劉 宇

（云南醫(yī)藥健康職業(yè)學(xué)院，云南·昆明 650000）

據(jù)報(bào)道，2019 年，全球估算新發(fā)結(jié)核病例996萬，其中141萬死亡病例，排名前三位的結(jié)核病新發(fā)患者高負(fù)擔(dān)國家分別是，印度（264 萬），印度尼西亞（84.5 萬），中國（83.3 萬）[1]。由于艾滋病、吸毒、免疫抑制劑、酗酒與貧困等原因，結(jié)核病的發(fā)病率又呈上升趨勢。結(jié)核病已成為艾滋病病人死亡的首要原因。結(jié)核桿菌可通過呼吸道、消化道及損傷的皮膚粘膜等多種途經(jīng)侵入易感機(jī)體，2019年報(bào)道的新發(fā)結(jié)核病例中，合并艾滋病的病例占比為8.2%[1]。結(jié)核病可引起多種組織器官的感染。結(jié)核桿菌在在與宿主的長期作用中，進(jìn)化出了一系列獨(dú)特的抗壓力反應(yīng)功能，使其能夠抵御巨噬細(xì)胞的吞噬和裂解而存活下來。結(jié)核桿菌既可以在細(xì)胞外存活，也可以在細(xì)胞內(nèi)寄生。結(jié)核桿菌主要感染人體的巨噬細(xì)胞，其分泌的多種蛋白質(zhì)成分在阻止巨噬細(xì)胞與溶酶體融合中起到重要作用。結(jié)核桿菌分泌的蛋白成分還可以干擾巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)，引起巨噬細(xì)胞的凋亡或壞死，從而使菌體自身得以生存[2]。在宿主免疫功能強(qiáng)大時(shí)，結(jié)核桿菌通過引起脂質(zhì)成分的聚集，將自身包裝成一種潛伏狀態(tài)，從而避免機(jī)體巨噬細(xì)胞更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[3]。當(dāng)宿主免疫功能低下時(shí)，處于休眠狀態(tài)的結(jié)核桿菌迅速被調(diào)動(dòng)起來，進(jìn)入激活狀態(tài)，繼續(xù)繁殖和感染機(jī)體。因此，研究菌體分泌蛋白的抗壓力反應(yīng)機(jī)制，不僅有助于鑒定結(jié)核桿菌的致病基因，也為結(jié)核病的診斷和治療提供新的技術(shù)手段和思路。還可以闡明結(jié)核桿菌潛伏感染的作用機(jī)理，為研制新型抗結(jié)核藥物提供理論基礎(chǔ)。結(jié)核桿菌表面蛋白R(shí)bpA、Cas2和PPE19是近年來研究比較熱門的幾種菌體表面蛋白。

一、結(jié)核桿菌表面蛋白R(shí)bpA

利福平作為重要的一線抗結(jié)核藥物之一，其作用的靶點(diǎn)是結(jié)核桿菌負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的RNA 聚合酶。Paget 等在分離純化天藍(lán)鏈霉菌RNA 聚合酶時(shí)分離出一種新的RNA聚合酶結(jié)合蛋白，并將其命名為RbpA(RNAP binding protein)，并根據(jù)序列分析結(jié)果顯示，該蛋白僅存在于放線菌中[4]。Rb?pA是能夠與RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)。

RbpA 與結(jié)核桿菌對利福平耐藥之間存在密切關(guān)系，RNA 聚合酶的高表達(dá)與結(jié)核桿菌對利福平的耐藥成正向相關(guān)。而RNA聚合酶的缺失或者基因突變則會(huì)導(dǎo)致菌體對利福平的敏感性增加。Chatterji 等對恥垢分枝桿菌的RbpA 蛋白的序列進(jìn)行研究表明，過表達(dá)RbpA蛋白能明顯增加其對利福平的耐藥性，還利用Cross—link 方法證實(shí)RbpA 蛋白結(jié)合于RNA 聚合酶的D 亞基[5]。RbpA的蛋白序列結(jié)合位點(diǎn)與利福平的結(jié)合位點(diǎn)十分靠近。菌體對利福平的耐藥機(jī)制可能的解釋為RbpA是作為利福平的一種競爭結(jié)合蛋白而存在的[6]。而利福平與細(xì)菌的作用位點(diǎn)在空間結(jié)構(gòu)上并不完全重合。因此推測，RbpA在利福平耐藥中的作用，并不是通過與利福平作用位點(diǎn)直接結(jié)合的形式。

二、結(jié)核桿菌表面蛋白Cas2

噬菌體在自然界中廣泛存在，結(jié)核桿菌依靠不斷進(jìn)化的抗壓力反應(yīng)機(jī)制來對抗噬菌體的威脅。CRISPR 系統(tǒng)（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）也是這一抗壓力反應(yīng)機(jī)制中的一員，它廣泛存在于90%以上的古生菌和40%以上的細(xì)菌基因序列中[7]。對于結(jié)核分枝菌屬而言，CRISPR 系統(tǒng)只存在于致病性結(jié)核分枝桿菌，屬于致病菌對抗噬菌體的獲得性免疫機(jī)制的一部分。而Cas2 基因則位于CRISPR 系統(tǒng)的前導(dǎo)序列，它不同于CRISPR系統(tǒng)中那些短的重復(fù)基因系列，它屬于CRISPR系統(tǒng)基因序列中獨(dú)特的一部分[8]。Cas2 基因表達(dá)蛋白包括解旋酶和核糖核酸酶等，表面蛋白Cas2 功能各不相同。結(jié)核桿菌表面蛋白Cas2廣泛存在于含有CRISPR序列的微生物基因組中。Cas2 蛋白對于結(jié)核桿菌逃避巨噬細(xì)胞的免疫監(jiān)視、抗壓力反應(yīng)以及抗生素抗性起著重要的作用。使用抗生素等可引起結(jié)核桿菌壓力反應(yīng)的試劑處理后，菌體內(nèi)部的Cas2蛋白表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化[9]。

經(jīng)過氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)，Cas2 在致病性結(jié)核桿菌的的表達(dá)是高度保守的，說明Cas2可能對分枝桿菌的致病性是非常重要的。選擇恥垢分枝桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌株構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒連接到恥垢分枝桿菌中，建立過表達(dá)Cas2的重組恥垢分枝桿菌模型[10]。并對重組恥垢分枝桿菌的Cas2 在壓力反應(yīng)以及毒力等方面的功能進(jìn)行研究。進(jìn)一步表明，Cas 蛋白與實(shí)驗(yàn)菌體的致病性高度相光。此研究為Cas 蛋白的機(jī)制提供了新方向，并為研究Cas2在結(jié)核分枝桿菌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

三、結(jié)核桿菌表面蛋白PPE19

結(jié)核分枝桿菌PPE家族基因作為抗原變異的來源及診斷血清，主要參與結(jié)核桿菌的毒力及抗壓力反應(yīng)中。結(jié)核分枝桿菌PPE 家族基因與宿主相互作用，發(fā)揮抗壓力反應(yīng)的作用越來越受到重視。PPEl9 基因作為PPE 基因家族的重要一員，其作用是調(diào)控結(jié)核桿菌抗壓力反應(yīng)因子SigB 的重要調(diào)控因子。實(shí)驗(yàn)表明，缺失或突變PPEl9基因的菌株對于抗生素、低氧、氧化壓力等壓力反應(yīng)均表現(xiàn)出更加敏感。因此，作為SigB 因子的一個(gè)調(diào)控子而言，PPEl9基因可能對其中的一種壓力因素或幾種壓力因素起到調(diào)控作用。

利用結(jié)核分枝桿菌基因組的PPEl9 基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)接到恥垢分枝桿菌中，構(gòu)建表達(dá)PPEl9重組蛋白的重組恥垢分枝桿菌[11]。實(shí)驗(yàn)表明，PPEl9的過表達(dá)菌株也即菌體對抗壓力反應(yīng)的耐受菌株。這些抗壓力反應(yīng)包括，對抗饑餓條件，對抗酸性壓力，對抗表面壓力，對抗氧化壓力以及對抗結(jié)核藥物異煙肼的耐受。但是，PPEl9 基因僅在結(jié)核分枝桿菌的牛分枝桿菌中表達(dá)。而且，PPEl9基因?qū)τ趷u垢分枝桿菌菌落形態(tài)，生物膜的形成等表面特性均未產(chǎn)生明顯的影響。此外，PPEl9對于抗生素諾氟沙星表現(xiàn)出高度敏感。對于寄生于機(jī)體巨噬細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)菌而言，PPEl9明顯增強(qiáng)了恥垢分枝桿菌的存活，但是沒有明顯改變細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。

四、結(jié)語

肺結(jié)核是一種很古老的傳染病，俗稱是“癆病”，是一種對人類健康構(gòu)成重大威脅的慢性傳染病[12]。人類對結(jié)核桿菌感染率很高，雖然各國為防治結(jié)核病做出了大量努力，但是結(jié)核病依然在全球特別是中低收入國家中蔓延。近年來，科學(xué)界發(fā)現(xiàn)了一系列結(jié)核桿菌效應(yīng)蛋白調(diào)控宿主細(xì)胞功能從而逃逸免疫清除的機(jī)制，揭示了病原菌與宿主間相互博弈的動(dòng)態(tài)過程及分子機(jī)理，為抗結(jié)核治療及藥物研究提供了新思路和特異靶點(diǎn)。