劉蘭英，呂新，李瑩，羅土炎，上官亮，李玥仁*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所（福州 350003）；

2. 福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福州 350003）

海帶中含有豐富的膳食纖維、多糖、多酚等功能性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗病毒及提高免疫力等多種藥理活性[1-2]*，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的海藻養(yǎng)殖品種。同時(shí)海帶還含有極豐富的微量元素，微量元素在維持生命及人體正常新陳代謝中發(fā)揮重要作用，其含量與海帶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值密切相關(guān)[3-4]*。因此，開展海帶中微量元素的檢測(cè)分析對(duì)于評(píng)估其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。測(cè)量不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值分散性的非負(fù)參數(shù)[5]*，將測(cè)量不確定度引入海帶微量元素的檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)于測(cè)量結(jié)果可信程度的評(píng)價(jià)很有必要。

現(xiàn)有方法主要是利用火焰原子吸收光譜法（FAAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測(cè)定食品中微量元素的含量。其中，關(guān)于FAAS法測(cè)定食品中微量元素的不確定度評(píng)定主要集中在飲用水[6-7]*、糧食[8-9]*、酒類[10-11]*、奶粉[12-13]*等方面。如：趙立群等[9]*對(duì)小麥粉中鋅的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來(lái)源于方法回收率，其次是校準(zhǔn)曲線擬合和測(cè)量重復(fù)性；彭珍華等[10]*對(duì)葡萄酒中鐵的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合；鐘加成等[13]*對(duì)嬰兒配方乳粉中鋅的不確定度評(píng)定結(jié)果表明，測(cè)量不確定度主要來(lái)源于樣品溶液中鋅濃度的測(cè)定和測(cè)量重復(fù)性。然而在眾多研究中，關(guān)于海帶中微量元素測(cè)量不確定度的報(bào)道還比較欠缺。

試驗(yàn)以GB 5009.90—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鐵的測(cè)定》和GB 5009.14—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鋅的測(cè)定》為檢測(cè)依據(jù)，采用FAAS法對(duì)海帶中鐵、鋅2個(gè)微量元素進(jìn)行測(cè)定，參照J(rèn)JF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》和CNAS GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》的要求和規(guī)定，對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行相應(yīng)分析，以期為海帶中微量元素含量檢測(cè)的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

海帶樣品（取自福州市連江縣某海帶養(yǎng)殖區(qū)）。

硝酸（優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL：國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AA-6880原子吸收光譜儀（日本島津公司）；G-400智能控溫電加熱器、TOPEX微波消解儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；AL204電子天平（梅特勒公司）。

1.3 樣品前處理

將海帶樣品烘干、粉碎混合均勻后，稱取0.3 g左右（精確至0.000 1 g）于微波消解內(nèi)罐中。加入5.0 mL硝酸溶液，置于微波消解儀中進(jìn)行消解，消解升溫程序：120 ℃保持5 min，160 ℃保持10 min，190℃保持20 min。消解結(jié)束后冷卻至室溫，取出消解內(nèi)罐，置于配套電加熱器中趕酸至1.0 mL左右，冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取適量鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 μg/mL），用1%硝酸溶液稀釋配成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液；吸取適量此標(biāo)準(zhǔn)中間液，配成鐵的質(zhì)量濃度分別為0.0，0.05，0.1，0.2，0.4和0.6 μg/mL以及鋅的質(zhì)量濃度分別為0.0，0.1，0.2，0.4，0.8和1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.5 樣品測(cè)定

儀器預(yù)熱至穩(wěn)定后，將鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按質(zhì)量濃度由低到高的順序分別注入火焰原子化器，測(cè)定其吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再分別測(cè)定空白樣液和樣品溶液的吸光度，通過(guò)校準(zhǔn)曲線得到消解液中鐵、鋅的質(zhì)量濃度。

1.6 數(shù)學(xué)模型

海帶樣品中待測(cè)元素的數(shù)學(xué)模型見式（1）。

式中：X為試樣中待測(cè)元素含量，mg/kg；ρ為試樣溶液中待測(cè)元素的質(zhì)量濃度減去空白溶液中待測(cè)元素的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為試樣消化液定容體積，mL；f為試樣稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量結(jié)果

對(duì)海帶樣品進(jìn)行12次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 海帶樣品中鐵、鋅的測(cè)定結(jié)果

2.2 測(cè)量不確定度來(lái)源識(shí)別

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型，采用基本因果圖分析測(cè)量不確定度的來(lái)源（圖1）。海帶中鐵、鋅的測(cè)量不確定度分量主要來(lái)源有樣品質(zhì)量（m）、樣品消解液定容體積（V）、樣品溶液質(zhì)量濃度（ρ）、消化液稀釋因子（f）、樣品測(cè)量重復(fù)性（Rep）和方法回收率（Rec）。其中，測(cè)量重復(fù)性（Rep）包括樣品測(cè)定過(guò)程中稱量、定容等操作的重復(fù)性，為總試驗(yàn)的一個(gè)合成重復(fù)性分量。

圖1 海帶中鐵、鋅測(cè)量不確定度評(píng)定因果關(guān)系圖

2.3 測(cè)量不確定度分量的量化

2.3.1 樣品質(zhì)量（m）引入的不確定度

樣品稱量過(guò)程產(chǎn)生的不確定度主要由天平校準(zhǔn)和重復(fù)性2個(gè)分量組成，由于引入已確定的合成重復(fù)性，因此沒(méi)有必要考慮稱量的重復(fù)性。

試驗(yàn)樣品稱量所使用的天平為特種準(zhǔn)確度等級(jí)，從校準(zhǔn)證書上獲得，測(cè)量范圍在0～50 g時(shí)，天平的最大允許誤差為±0.5 mg，該不確定度分量需計(jì)算2次（皮重1次、毛重1次）。假設(shè)服從均勻分布，取包含因子3，則樣品稱量過(guò)程產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度試驗(yàn)海帶平均質(zhì)量為m=0.304 5 g，即304.5 mg，則樣品質(zhì)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)=0.408 2/304.5=0.001 34。

2.3.2 樣品消解液定容體積（V）引入的不確定度

樣品消解液定容過(guò)程產(chǎn)生的不確定度主要由容量瓶校準(zhǔn)、溫度效應(yīng)和體積重復(fù)性3個(gè)分量組成，同樣這里不考慮體積重復(fù)性。

2.3.2.1 容量瓶校準(zhǔn)所產(chǎn)生的不確定度

試驗(yàn)海帶樣品消解后使用25 mL容量瓶定容，所用容量瓶經(jīng)計(jì)量校準(zhǔn)均為合格，依據(jù)JJG196—2006《常用玻璃量器》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，25 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.03 mL。按照CNAS GL006：2019推薦，玻璃器皿假定為三角分布，取包含因子6，得到由容量瓶校準(zhǔn)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(V25)=

2.3.2.2 溫度效應(yīng)所產(chǎn)生的不確定度

試驗(yàn)使用的容量瓶校準(zhǔn)溫度為22.7 ℃，樣品消解液定容時(shí)環(huán)境溫度為25 ℃，液體的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4*℃-1*，則溫度波動(dòng)（2.3 ℃）產(chǎn)生的液體體積變化區(qū)間為±（25 mL×2.3 ℃×2.1×10-4*℃-1*）=±0.012 08 mL。假設(shè)服從均勻分布，得到由溫度效應(yīng)所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

將上述2個(gè)分量合成，得到樣品消解液定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V25)=u12*(V25)+u22*(V25)=其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.3 樣品溶液質(zhì)量濃度（ρ）引入的不確定度

樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過(guò)程產(chǎn)生的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、校準(zhǔn)曲線擬合、檢測(cè)儀器校準(zhǔn)3個(gè)分量組成。

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ1)

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得，鐵、鋅標(biāo)準(zhǔn)貯備液的相對(duì)擴(kuò)展不確定度均為0.7%（包含因子k=2），換算成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρstock)=0.7%/2=0.003 5。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中，鐵、鋅元素使用到1 mL，5 mL移液器和50 mL容量瓶，分別進(jìn)行不確定度分析。

依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，50 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.05 mL，同2.3.2的計(jì)算，得出由50 mL容量瓶定容所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V50)=0.000 494。從校準(zhǔn)證書上獲得，標(biāo)稱容量1 mL的移液器，在移取0.1，0.5和1.0 mL體積時(shí)的容量允差分別為±2.0%，±1.0%和±1.0%，因未給出移取0.25 mL體積的容量允差，故移取0.25 mL體積的容量允差取最大值±2.0%。標(biāo)稱容量5 mL的移液器，在移取0.5，2.5和5.0 mL體積時(shí)的容量允差分別為±1.0%，±0.5%和±0.6%，因未給出移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差，故移取2.0，3.0和4.0 mL體積的容量允差取最大值±1.0%。假設(shè)服從均勻分布，則各移液體積對(duì)應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.25 mL體積1次、0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0 mL、3.0 mL體積各1次，故鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+urel2*(0.25)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(3.0)=0.017 712*。鋅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中使用50 mL容量瓶6次，1 mL移液器分別移取0.5 mL體積2次、1.0 mL體積1次，5 mL移液器分別移取2.0、4.0、5.0 mL體積各1次，故鋅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制中所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uZn,rel2*(ρ1)=urel2*(ρstock)+6×urel2*(V50)+2×urel2*(0.5)+urel2*(1.0)+urel2*(2.0)+urel2*(4.0)+urel2*(5.0)=0.013 862*。

2.3.3.2 校準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ2)

采用FAAS法測(cè)定海帶中的鐵、鋅含量，分別對(duì)配制的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行3次測(cè)定，得到相應(yīng)吸光度，結(jié)果如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液測(cè)定結(jié)果

對(duì)海帶樣品消解液進(jìn)行12次測(cè)量后，由吸光度求得樣品中鐵、鋅的平均質(zhì)量濃度：ρFe=0.307 μg/mL；ρZn=0.194 μg/mL（表1），則此過(guò)程帶來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：SR為曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Yj為第i個(gè)校準(zhǔn)溶液的第j次吸光度；Xi為擬合曲線第i個(gè)校準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；B1為曲線斜率；B0為曲線截距；n為測(cè)量校準(zhǔn)溶液的次數(shù)，n=18；P為測(cè)量樣品溶液的次數(shù)，P=12；為擬合曲線各校準(zhǔn)點(diǎn)濃度的平均值（n次）。mL；鋅元素SR=0.02046，?=0.417 μg/mL。

計(jì)算得到：鐵元素SR=0.00131，=0.225 μg/

將各值代入u(ρ2)的計(jì)算中，得出由校準(zhǔn)曲線擬合所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，分別為uFe(ρ2)=0.004 23 μg/mL，uZn(ρ2)=0.014 64 μg/mL。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(ρ2)=0.013 78，uZn,rel(ρ2)=0.075 46。

2.3.3.3 儀器校準(zhǔn)所產(chǎn)生的不確定度urel(ρ3)

根據(jù)火焰原子吸收光譜儀檢定證書，其擴(kuò)展不確定度為0.004 μg/mL（包含因子k=2），換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ρ3)=0.004/2=0.002 μg/mL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為uFe,rel(ρ3)=0.006 51，uZn,rel(ρ3)=0.010 31。

合并3個(gè)分量，則樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(ρ)=計(jì)算得到uFe,rel(ρ)=0.023 36，uZn,rel(ρ3)=0.077 41。

2.3.4 方法回收率（Rec）引入的不確定度

對(duì)海帶中鐵、鋅進(jìn)行6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)量分別為75 μg和4.5 μg，6次回收試驗(yàn)的加標(biāo)回收率結(jié)果見表3。根據(jù)貝塞爾公式，回收率試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為計(jì)算得到sFe(Rec)=3.00%、sZn(Rec)=5.39%。則方法回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為計(jì)算得到uFe(Rec)=1.23%，uZn(Rec)=2.20%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(Rec)=0.011 39，uZn,rel(Rec)=0.020 19。

表3 海帶樣品加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果

2.3.5 測(cè)量重復(fù)性（Rep）引入的不確定度

在相同條件下，對(duì)同一海帶樣品進(jìn)行12次獨(dú)立的重復(fù)測(cè)定（表1），同2.3.4的計(jì)算，得出重復(fù)性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為sFe(Rep)=8.623 5 mg/kg，sZn(Rep)=0.409 0 mg/kg。則樣品重復(fù)性測(cè)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe(Rep)=2.489 4 mg/kg，uZn(Rep)=0.118 1 mg/kg，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uFe,rel(Rep)=0.009 88，uZn,rel(Rep)=0.007 43。

2.3.6 消化液稀釋因子（f）引入的不確定度

試驗(yàn)海帶測(cè)定過(guò)程中，因樣品消化液中鐵含量超出校準(zhǔn)曲線的線性范圍，故對(duì)消化液進(jìn)行10倍稀釋，用1 mL移液器移取1 mL測(cè)試液到10 mL容量瓶中，定容至刻度，則稀釋因子帶來(lái)的不確定度主要由稀釋過(guò)程中容量瓶定容和使用移液器引起的不確定度分量組成。其中，移液器移取體積所產(chǎn)生的不確定度同2.3.3的計(jì)算，可知urel(1.0)=0.005 77。依據(jù)JJG196—2006規(guī)定，10 mL容量瓶（A級(jí)）的容量允差為±0.02 mL，同2.3.2的計(jì)算，得出由10 mL容量瓶定容所產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V10)=0.000 862，故鐵元素由消化液稀釋因子引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度uFe,rel2*(f)=urel2*(V10)+urel2*(1.0)=0.005 832*。

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合各不確定度分量，試驗(yàn)海帶中鐵、鋅含量測(cè)定的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為計(jì)算得到鐵元素ucrel(X)=0.028 47，鋅元素ucrel(X)= 0.080 42。

海帶經(jīng)重復(fù)測(cè)定12次后，樣品中各元素的平均含量分別為XFe=252 mg/kg，XZn=15.9 mg/kg（表1），其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(X)=ucrel(X)×X，計(jì)算得到鐵元素uc(X)=7.174 4 mg/kg，鋅元素uc(X)=1.278 7 mg/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度

依據(jù)CNAS GL006：2019推薦，取95%的置信水平，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度U=kuc(X)，計(jì)算得到鐵元素U=14 mg/kg，鋅元素U=2.6 mg/kg。

2.6 各不確定度分量的相對(duì)貢獻(xiàn)

從各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可知，影響海帶中鐵、鋅含量檢測(cè)結(jié)果不確定度的最大因素是樣品溶液質(zhì)量濃度，其次為方法回收率、測(cè)量重復(fù)性。相關(guān)研究在食用植物油微量元素的不確定度評(píng)定中也得到相似結(jié)果[14]*。與彭珍華等[10]*的研究結(jié)果相似，試驗(yàn)在樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過(guò)程中，又以標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量較大。

通過(guò)對(duì)比移液器在移取標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)引入的不確定度發(fā)現(xiàn)，移液器在移取低體積溶液時(shí)，其產(chǎn)生的不確定相對(duì)更大些，這與所用移液器的體積誤差有關(guān)，因此在配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)，要特別加強(qiáng)各種規(guī)格移液器的計(jì)量檢定，盡量移取較大體積的溶液，以減少此過(guò)程引入的不確定度。對(duì)于校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制，可通過(guò)選擇適當(dāng)濃度梯度的工作曲線，盡可能使待測(cè)元素濃度靠近曲線的中間位置，從而減少由此引入的不確定度。此外，通過(guò)使用精密度更高的器具配制標(biāo)準(zhǔn)溶液、增加工作曲線各濃度點(diǎn)的測(cè)量次數(shù)也可在一定程度上降低不確定度的引入[15]*。為降低方法回收率帶來(lái)的不確定度，在測(cè)量過(guò)程中須充分了解樣品的特性，優(yōu)化樣品的前處理方法，消解液轉(zhuǎn)移定容時(shí)少量多次清洗消解罐，盡可能徹底消解樣品并減少待測(cè)元素的損失。測(cè)量重復(fù)性帶來(lái)的不確定度主要受樣品前處理和測(cè)量?jī)x器的影響[16]*，在實(shí)際工作中可通過(guò)增加樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)、定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和期間核查，提升儀器性能穩(wěn)定性等進(jìn)行控制。

3 結(jié)論

采用FAAS法測(cè)定海帶中鐵、鋅的含量，并從樣品質(zhì)量、樣品消解液定容體積、樣品溶液質(zhì)量濃度、方法回收率、測(cè)量重復(fù)性、消化液稀釋因子等影響因素對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果表明：海帶樣品中鐵含量252 mg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為14 mg/kg（k=2）；鋅含量15.9 mg/kg時(shí)，其擴(kuò)展不確定度為2.6 mg/kg（k=2）。在各不確定度分量中，由樣品溶液質(zhì)量濃度引入的不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果影響最大，其次是方法回收率和測(cè)量重復(fù)性，而樣品消解液定容體積引入的不確定度影響最小。在樣品溶液質(zhì)量濃度測(cè)定過(guò)程中，又以標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和校準(zhǔn)曲線擬合帶來(lái)的不確定度貢獻(xiàn)較大。因此，在海帶微量元素檢測(cè)過(guò)程中，要加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的規(guī)范性和校準(zhǔn)曲線的質(zhì)量控制。