康婕*，陳鴻劍，李媛，孫亞南，劉娟娟，樊成

陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院（西安 710048）

高氯酸鹽作為新型污染物除了對飲用水的直接污染外，還會通過水、土壤等介質(zhì)快速遷移擴(kuò)散，進(jìn)一步積累于植物、動物、水生生物體內(nèi)，最終通過食物鏈進(jìn)入人體[1-4]*，目前全球范圍內(nèi)在肉制品、茶葉、嬰幼兒配方乳粉、蔬菜、水果、牛奶、藥品、飼料、水體、土壤中均檢出高氯酸鹽（ClO4-*），體液中也有檢出，包括尿液、血液和母乳[5-20]*。其中歐洲食品安全管理局公布牛奶和奶產(chǎn)品是造成高氯酸鹽暴露的重要因素[21]*，韓國39種食品中高氯酸鹽暴露情況可以看出乳制品中暴露水平最高[22]*。Krik等[23-24]*在牛奶中檢出高氯酸鹽，羊乳中含量顯著高于牛乳。目前有關(guān)羊乳和羊乳制品中高氯酸鹽的相關(guān)研究鮮少，隨著羊奶產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，因羊奶獨(dú)特于牛乳的營養(yǎng)特性，嬰幼兒配方羊奶粉市場規(guī)模也逐年增加，高氯酸鹽作為一種強(qiáng)力甲狀腺毒素，會干擾甲狀腺對碘的吸收，可影響胎兒和嬰兒大腦發(fā)育[25-30]*。

為了解羊乳中高氯酸鹽污染水平和暴露途徑，為制定羊乳中高氯酸鹽含量和風(fēng)險管理提供參考，2021年對陜西省嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)企業(yè)的奶山羊養(yǎng)殖場的水、土壤、青貯、飼草、飼料進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)測和暴露評估，為評估羊乳中高氯酸鹽暴露途徑及各個因素的貢獻(xiàn)率評價提供了合理的解決方法，對促進(jìn)我省羊乳及羊乳制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展、保障消費(fèi)者身體健康、維護(hù)社會穩(wěn)定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)氯酸鹽和高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL，美國Inorganic Ventures）；氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)：氯酸鹽-18O3（200 μg/mL，以氯酸根-18O3離子計，上海甄準(zhǔn)）；高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)：高氯酸鹽-18O4（100 μg/mL，以高氯酸根-18O4離子計，美國劍橋CIL）；乙腈（色譜純，美國格雷斯）；甲酸銨（液質(zhì)聯(lián)用級，美國Fisher Chemical）；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（150 mg/3 mL，美國waters）。試劑和耗材在使用前均應(yīng)做本底測試。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent 6495C，配有電噴霧離子源ESI）；超聲波清洗器（KQ-500E型，昆山超聲）；多樣品渦旋混合器（MultiVortex-12，廣州得泰）；高速臺式離心機(jī)（H1850，湖南湘儀）；超純水機(jī)（UPH-Ⅲ-20T，四川優(yōu)普）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集和前處理

從外圍環(huán)境入手，對全省覆蓋西安、咸陽、渭南、寶雞和銅川五個區(qū)域20家嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)企業(yè)的奶山羊養(yǎng)殖場涉及水、土壤、飼草、飼料、青貯、生羊乳和生牛乳進(jìn)行采樣，樣品共計230份樣品。其中，水90個樣本，采集羊飲用水；土壤36個樣本，采集奶山羊生活環(huán)境土壤，抽取土壤樣本參照NY/T 395—2012《農(nóng)田土壤環(huán)境質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)范》[31]*中要求進(jìn)行采樣，采用梅花五點(diǎn)法采集耕作層（0～20 cm）土樣從上至下約0.2 m處取約0.5 kg土樣，土壤樣本通過縮分、風(fēng)干、研磨、過篩、勻混、分裝后備用；青貯12個樣本：主要為奶山羊喂養(yǎng)青貯；采集飼草48個樣本：主要采集奶山羊喂養(yǎng)用草（包括花生蔓、苜蓿、黑麥、燕麥桿等），參照NY/T 398—2000《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 農(nóng)、畜、水產(chǎn)品污染檢測技術(shù)規(guī)范》[32]*進(jìn)行采樣，飼草樣品采集到達(dá)實驗室后，飼草先用自來水沖洗后，采用四分法縮分取150 g，再用去離子水清洗，用紗布輕輕擦去樣品上泥沙等附著物后用組織搗碎機(jī)搗碎，混合均勻成待測試樣，裝入聚乙烯樣品袋置于-20 ℃冰柜內(nèi)保存，待測；飼料44個樣本，主要為奶山羊喂養(yǎng)飼料（包括麩皮、玉米、精飼料等）；生羊乳87個樣本；生牛乳18樣本。

1.3.2 樣品檢測

樣品檢驗方法參照BJS201706進(jìn)行檢驗。

1.3.3 羊乳和牛乳中高氯酸鹽的測定

采集陜西省奶山羊養(yǎng)殖場通過生羊乳樣品87個，生牛乳樣品18個，對樣本中高氯酸鹽含量進(jìn)行采樣檢測，其中27個樣本來自同一區(qū)域。

1.3.4 暴露評估方法和貢獻(xiàn)率計算

羊高氯酸鹽暴露途徑主要有2大類，飲用水和食物（食物包括飼料、飼草和青貯）?；谖覀冄芯繖z測的水（90個樣本）、飼料（44個樣本）、青貯（12個樣本）和飼草（48個樣本）中高氯酸鹽濃度測定值，計算各種膳食途徑長期慢性每日攝入量（CDI），按式（1）～（4）進(jìn)行計算，式中陜西省奶山羊存欄量達(dá)243萬只，品種以關(guān)中奶山羊和莎能奶山羊為主，關(guān)中奶山羊成年母羊體重為45～65 kg，莎能奶山羊成年母羊體重為50～65 kg，所以體質(zhì)量以60 kg計，根據(jù)本次調(diào)研，羊食物中飼料攝入量以1 kg計，青貯攝入量以1 kg計，飼草攝入量以3 kg計。按照式（5）計算每種膳食途徑對羊體高氯酸鹽的貢獻(xiàn)率，具體參數(shù)見表1。

表1 慢性攝入量中使用的參數(shù)及參數(shù)值

1.3.5 靶標(biāo)危害系數(shù)法（THQ法）計算

靶標(biāo)危害系數(shù)法（THQ法）是基于污染物暴露劑量和參考劑量的比值的一種方法，2000年美國國家環(huán)境保護(hù)局根據(jù)慢性每日攝入量（CDI）建立的一種評價非致癌污染物風(fēng)險的方法。根據(jù)式（6）計算。

式中：EF為暴露頻率，d/年；ED為暴露持久性，年；FIR為膳食攝入量，g/d；C為危害物含量，mg/kg；RFD為參考劑量，mg/（kg·d）；m為平均體質(zhì)量，kg；t為非致癌性暴露的平均時間，d。

1.3.6 層次分析法（AHP法）

層次分析法（簡稱AHP法）是以經(jīng)驗判斷為基礎(chǔ)，將要分析的問題以數(shù)量的形式表達(dá)和處理并層次化，構(gòu)建層次分析模型，將不同因素相互比對形成判斷矩陣，根據(jù)判斷矩陣準(zhǔn)則，一般采用1～9標(biāo)度法進(jìn)行打分（表2），一致性檢驗后，根據(jù)矩陣的特征值和特征向量計算指標(biāo)權(quán)重。判斷矩陣中元素P=（aij）n×n。

表2 判斷矩陣標(biāo)度含義

1)aij＞0；

2)aij=1（其中i=j）；

3)aij=1/aij（i，j=1，2，3，…，n）。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳和牛乳中高氯酸鹽的測定結(jié)果

根據(jù)表3，進(jìn)行Levene的變異數(shù)相等測試，即F檢驗（方差齊性檢驗），見表4。在采用相等變異數(shù)條件下，F(xiàn)=7.769，Sig.=0.006，小于0.05，可以認(rèn)為羊乳和牛乳兩組數(shù)據(jù)的方差齊性是不相等的，生羊乳中高氯酸鹽平均值為22.89 μg/kg，檢出率為87.36%，生牛乳中高氯酸鹽平均值為10.45 μg/kg，檢出率為100%。對同一地區(qū)咸陽市涇陽縣采集的樣品（27個樣品）結(jié)果顯示：生羊乳（29.03 μg/kg）＞生牛乳（9.61 μg/kg），推斷生羊乳中高氯酸鹽含量是生牛乳的2～3倍。羊乳中高氯酸鹽最大值150.93 μg/kg，通過對最大值追溯，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該奶站飼草中高氯酸鹽含量高達(dá)15 253.55 μg/kg，盡管是個例，初步推斷飼草中高氯酸鹽含量對生羊乳中高氯酸鹽含量可能有較大影響。

表3 不同類別乳樣本統(tǒng)計表

由于方差齊性是不相等的，針對平均值不相等的t測試，由表4可以看出t=4.309，自由度為101.7，雙尾顯著性概率Sig.（雙尾）=0.000＜0.05，因此，應(yīng)拒絕其原假設(shè)，即說明羊乳和牛乳的高氯酸鹽含量有顯著差異，表明生羊乳中高氯酸鹽含量顯著高于生牛乳，均值差為12.4，均值差標(biāo)準(zhǔn)誤為2.9，羊乳和牛乳的高氯酸鹽含量均值差的95%的置信區(qū)間為（6.7，18.2）。

表4 生羊乳和生牛乳獨(dú)立樣本檢驗表

2.2 因素中高氯酸鹽檢測結(jié)果

通過羊飲用水、灌溉用水、清洗用水涉及嬰幼兒配方羊乳粉生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)使用水共計90個樣本，奶源地的土壤36個樣本，羊食用飼料44個樣本，青貯樣品12個樣本，羊食用的飼草48個樣本，由圖1可以看出，水和飼料均集中在低含量水平，飼草和青貯分布廣，且飼草有含量10 000 μg/kg以上的分布區(qū)域。

圖1 境因素中高氯酸鹽攝入含量對比圖

通過對環(huán)境因素進(jìn)行排查，由表5中對其高氯酸鹽統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，水中高氯酸鹽均值濃度為3.49±4.98 μg/kg，土壤中高氯酸鹽均值濃度中26.08±52.01 μg/kg，飼料中高氯酸鹽均值濃度為112.43±226.88 μg/kg，青貯中高氯酸鹽均值濃度為1 804.76±2 809.02 μg/kg，飼草中高氯酸鹽均值濃度為2 091.53±3 210.39 μg/kg，其中土壤中高氯酸鹽不直接通過食物鏈進(jìn)入羊體內(nèi)并轉(zhuǎn)化為羊乳中的高氯酸鹽，飼料成分復(fù)雜，包括動物源和植物源性成分，其中植物源性成分（秸稈、大麥、玉米等飼草）本身含有高氯酸鹽，這也是飼料中檢出高氯酸鹽的主要因素。青貯是由飼草等植物經(jīng)過厭氧發(fā)酵形成的飼料，青貯和飼草的高氯酸鹽含量是水中高氯酸鹽含量的五百多倍，檢出率也高達(dá)83.33%和100%。高氯酸鹽的高溶解度特性決定了通過水系統(tǒng)實現(xiàn)遷移轉(zhuǎn)化和積累，并最終富集在飼草中。飼喂羊使用的飼料、青貯以及飼草作為羊的食用食物直接進(jìn)入羊體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化吸收最終進(jìn)入羊乳中。綜上，水、土壤、飼料、青貯以及飼草中的高氯酸鹽均會直接或者間接地通過食物鏈進(jìn)入羊乳。

表5 環(huán)境因素中高氯酸鹽檢測統(tǒng)計表

2.3 暴露評估方法和貢獻(xiàn)率計算

根據(jù)測定的高氯酸鹽數(shù)據(jù)分布和評估模型，使用蒙特卡羅模擬進(jìn)行暴露評估（表6）。暴露評估獲得不同攝入食物的CDI值。平均暴露量、P50暴露量、P90暴露量、P99暴露量分別指的是在平均值水平，中位值水平、百分之90分位值處及百分之99分位值處的暴露評估值。飲用水、飼料、青貯和飼草的平均暴露量分別為0.58，18.74，300.79和348.59 μg/（kg·d）。除了飲用水，羊攝入的食物（飼料、青貯和飼草）均高于美國科學(xué)院（NAS）推薦的高氯酸鹽人允許攝入劑量0.7 μg/（kg·bw）。

表6 飲用水和羊食物（飼料、飼草和青貯）膳食暴露評估結(jié)果 單位：μg/（kg·d）

根據(jù)暴露評估數(shù)據(jù)，即各種膳食途徑長期慢性每日攝入量（CDI）計算每種膳食途徑對羊體高氯酸鹽的貢獻(xiàn)率。不同攝入途徑的貢獻(xiàn)率見表7，不同膳食攝入羊高氯酸鹽暴露風(fēng)險途徑貢獻(xiàn)率見圖2。飲用水?dāng)z入途徑高氯酸鹽貢獻(xiàn)率與攝入途徑相比要低2～3個數(shù)量級，貢獻(xiàn)率為0.13%，基本可以忽略不計。以飼草和青貯為主的植物類食物為羊高氯酸鹽攝入的主要來源，貢獻(xiàn)率約占96.5%，其次是飼料，貢獻(xiàn)率占3.4%。

圖2 高氯酸鹽暴露風(fēng)險途徑貢獻(xiàn)率

2.4 靶標(biāo)危害系數(shù)法（THQ法）

羊每天都要攝入飲用水和食物（飼草、飼料和青貯），EF為暴露頻率，因此EF取值為365 d/年，由于關(guān)中奶山羊和莎能奶山羊平均壽命為10年，ED在數(shù)值上等于羊的平均壽命。RFD為參考劑量，參考劑量以體質(zhì)量計，參考美國科學(xué)院（NAS）推薦的高氯酸鹽允許攝入劑量0.7 μg/（kg·bw）。使用THQ來評價羊攝入高氯酸鹽風(fēng)險。高氯酸鹽暴露風(fēng)險途徑貢獻(xiàn)率見表7。

表7 高氯酸鹽暴露風(fēng)險途徑貢獻(xiàn)率

由表8可以看出，水和飼料的平均暴露水平和P50、P90、P99暴露水平均小于1，說明羊攝入飲用水和飼料的攝入水平是安全的，與平均暴露水平和P50相比，P90、P99暴露水平的THQ值明顯提高，青貯的P90、P99暴露水平的THQ值均大于1，說明在P90、P99暴露水平上青貯攝入已經(jīng)對羊產(chǎn)生較大影響，屬于高風(fēng)險因素，飼草在平均暴露水平的THQ值已經(jīng)大于1，P90、P99暴露水平是平均暴露水平2倍和10倍，說明飼草攝入對羊產(chǎn)生的影響巨大，屬于高風(fēng)險因素，同時由于青貯是由飼草等植物經(jīng)過厭氧發(fā)酵形成的飼料，說明植物源性食物高氯酸鹽攝入對羊?qū)儆诟唢L(fēng)險因素，有相關(guān)研究證實通過食物鏈的傳遞能使高氯酸鹽在一些高等動植物體內(nèi)得到富集，且高氯酸鹽會遷移

表8 平均暴露水平、P50、P90、P99暴露水平的THQ

到乳腺組織中，并且溶于分泌的乳液中。由于高氯酸鹽風(fēng)險受不同食物種類和比例的影響，因此引入層次分析模型來確定不同膳食種類的風(fēng)險權(quán)重。

2.5 風(fēng)險權(quán)重的判別

2.5.1 層次分析模型

建立奶山羊飲食安全風(fēng)險評價體系的層次結(jié)構(gòu)模型，將高氯酸鹽風(fēng)險分解為飲用水風(fēng)險、飼料風(fēng)險、青貯風(fēng)險與飼草風(fēng)險，結(jié)果見圖3

圖3 風(fēng)險權(quán)重層次模型

2.5.2 判斷矩陣及權(quán)重計算

根據(jù)飲用水、飼料、青貯與飼草的平均攝入量，兩兩比較其重要性并進(jìn)行打分。選擇平均暴露水平的THQ值作為判斷依據(jù)，對各個膳食指標(biāo)兩兩比較其風(fēng)險程度并根據(jù)1～9標(biāo)度法進(jìn)行打分，整理得到下表奶山羊飲食安全風(fēng)險評價體系各指標(biāo)的相對重要性評分表，結(jié)果見表9。

表9 食物類別指標(biāo)重要性賦值

風(fēng)險權(quán)重的結(jié)果見表10。在奶山羊飲食安全風(fēng)險評價體系各指標(biāo)權(quán)重中，平均暴露水平下飼草的風(fēng)險所占權(quán)重為0.511，權(quán)重最大，說明飼草在膳食暴露中屬于高風(fēng)險因素，即奶山羊飲食風(fēng)險中，食用飼草中的高氯酸鹽對羊的安全影響最大，飼草中高氯酸鹽超標(biāo)會對羊的健康產(chǎn)生危害，而且高氯酸鹽會遷移到乳腺組織中，并且溶于分泌的乳液中，如果生羊乳受到高氯酸鹽污染，則導(dǎo)致后續(xù)的嬰幼兒配方羊乳奶粉等羊乳制品質(zhì)量安全受到威脅。青貯的風(fēng)險權(quán)重排第二，權(quán)重為0.377，其風(fēng)險主要是由于青貯是由飼草制備的，風(fēng)險主要體現(xiàn)在供需風(fēng)險，飼料風(fēng)險次之，飲用水的風(fēng)險最小，但是同樣需要重視。通過比較可以發(fā)現(xiàn)，飼草在P90暴露水平和P99暴露水平的風(fēng)險權(quán)重值占比最大，說明極端暴露羊群與正常水平羊群相比，飼草的高氯酸鹽對于羊群的危害更加顯著。

表10 平均暴露水平、P50、P90、P99暴露水平的風(fēng)險權(quán)重值

3 討論與結(jié)論

研究對陜西地區(qū)環(huán)境和羊乳中高氯酸鹽污染情況檢測分析，水、土壤、飼料、青貯和飼草中高氯酸鹽均值濃度分別為3.49±4.98，26.08，112.43，1 804.76和2 091.53 μg/kg，其中飲用水、飼料、青貯和飼草均會通過食物鏈直接進(jìn)入羊體內(nèi)通過轉(zhuǎn)化吸收最終進(jìn)入羊體內(nèi)，進(jìn)一步遷移到乳腺組織中，并且溶于分泌的乳液中。土壤中高氯酸鹽不直接通過食物鏈進(jìn)入羊體內(nèi)并轉(zhuǎn)化為羊乳中的高氯酸鹽。根據(jù)暴露評估數(shù)據(jù)，飼草和青貯為羊乳中高氯酸鹽的主要來源，貢獻(xiàn)率約占96.5%，屬于高風(fēng)險因素，通過THQ計算，水和飼料的平均暴露水平和P50、P90、P99暴露水平均小于1，說明羊攝入飲用水和飼料的攝入水平是安全的，飼草在平均暴露水平的THQ值已經(jīng)大于1，P90、P99暴露水平是平均暴露水平2倍和10倍，說明飼草攝入對羊產(chǎn)生的影響巨大，屬于高風(fēng)險因素。利用層次分析法計算相應(yīng)權(quán)重。飲用水、飼料、青貯和飼草的平均暴露水平的權(quán)重分別是0.045，0.079，0.377和0.511，青貯和飼草在平均暴露水平和P50、P90、P99暴露水平的風(fēng)險權(quán)重值都是最大的，風(fēng)險最大。由此得到陜西地區(qū)環(huán)境和羊乳中高氯酸鹽污染情況及羊群高氯酸鹽暴露途徑貢獻(xiàn)率，間接分析了羊乳中高氯酸鹽含量與羊食用飼草有明顯的相關(guān)性，不僅對羊乳制品企業(yè)控制奶源中高氯酸鹽有重要的指導(dǎo)意義，同時對保障嬰幼兒配方羊乳粉質(zhì)量安全提供理論依據(jù)，也對制定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供了參考價值。