宋肖肖，張慧霞，劉斌杰，楊民和，王國紅

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350107）

茶菌又稱紅茶菌，是一種起源于中國并流傳千年的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品，當(dāng)前仍在世界各地流行，尤以北美、歐洲和東南亞為甚[1]。典型的茶菌以紅茶和白糖為原料，通過以酵母菌和醋酸菌為主（有時也含有乳酸菌）的益生微生物群體自然發(fā)酵，經(jīng)過7～15 d的發(fā)酵過程，在發(fā)酵液中產(chǎn)生細(xì)菌纖維素、有機(jī)酸、維生素和多酚類物質(zhì)等功能性微生物代謝產(chǎn)物，形成一種酸甜可口、清爽宜人的飲料，并常常被認(rèn)為具有助消化、解毒、抗氧化和抗癌等功能[2-3]。茶菌的自然發(fā)酵受微生物、原料、工藝和環(huán)境條件等因素的影響。共生微生物菌群（symbiotic culture of bacteria and yeasts，SCOBY）是影響茶菌發(fā)酵過程、發(fā)酵產(chǎn)物、營養(yǎng)價值和生理功效的主要因素[4]。不同地域的茶菌其發(fā)酵微生物不同，從世界上不同地區(qū)生產(chǎn)的茶菌樣品中，已經(jīng)分離獲得了眾多的菌株[3,5]。

茶菌一直以自然發(fā)酵和家庭飲用為主；近20年來，隨著人們對天然、有機(jī)和健康飲食的追求，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)規(guī)模化生產(chǎn)茶菌的探索逐漸增多[1,6]。參與傳統(tǒng)茶菌發(fā)酵的微生物豐富多樣，菌群復(fù)雜，加之生產(chǎn)環(huán)境開放，難以達(dá)到飲品的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和食品安全要求。因此，發(fā)酵劑成為制約茶菌大規(guī)模生產(chǎn)的“卡脖子”問題[7-8]。通過分離純化自然菌群中的菌株，分析不同菌株在發(fā)酵過程的功能和菌株之間的相互作用關(guān)系，識別和篩選優(yōu)勢菌株和關(guān)鍵菌株，在此基礎(chǔ)上混合、復(fù)配和組建人工復(fù)合菌劑，是當(dāng)前傳統(tǒng)食品發(fā)酵技術(shù)改良和創(chuàng)新的方向[9-11]。在茶菌的研究中，早在20世紀(jì)50—60年代，既有利用人工分離菌株模擬自然發(fā)酵的嘗試[12]，之后類似的研究工作逐漸增多[13-16]。進(jìn)入21世紀(jì)后，茶菌研究在北美和歐洲成為有機(jī)和功能性飲料研究的熱點(diǎn)，先后有多項研究探索茶菌人工發(fā)酵劑和發(fā)酵性能[16-17]。然而，目前尚未有利用人工發(fā)酵劑進(jìn)行茶菌大規(guī)模生產(chǎn)的報道。

本課題組從福建省泉州市鄉(xiāng)村獲得一份茶菌樣品，從中分離、純化和保存了一批菌株[18]。應(yīng)用其中的2 個酵母菌和2 個醋酸菌菌株，本研究以菌膜發(fā)生為指標(biāo)，構(gòu)建新型復(fù)合菌群，并通過單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的比較，確定不同菌株對菌膜形成的作用；明確人工菌群發(fā)酵過程中發(fā)酵液酸度、還原糖、多酚類物質(zhì)和香氣成分的動態(tài)變化以及不同菌株組合對發(fā)酵的影響；經(jīng)歷多次繼代培養(yǎng)后菌群的穩(wěn)定性。以期能夠構(gòu)建相對穩(wěn)定而又具有天然茶菌典型發(fā)酵性能的人工復(fù)合發(fā)酵劑，滿足日益增長的市場需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌種

菌株C3（邁耶氏酵母Meyerozymasp.），菌株C5（長孢洛德酵母Lodderomyces elongisporus），菌株C6（駒形氏桿菌Komagataeibactersp.C6）和菌株J5（葡糖醋桿菌Gluconacetobactersp.J5）從紅茶菌飲料分離獲得[18]。各菌種于4 ℃冰箱保藏在福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

醋酸菌培養(yǎng)基[19]：酵母浸膏10 g，蛋白胨5 g，無水葡萄糖50 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，滅菌20 min。冷卻至55 ℃左右，加入體積分?jǐn)?shù)2%無水乙醇和165 ℃干熱滅菌2 h的CaCO310 g，分裝、冷卻后備用。酵母菌培養(yǎng)基[18]：酵母浸膏10 g，蛋白胨15 g，無水葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L；葡萄糖酵母（glucose yeast，GY）培養(yǎng)基[20]：葡萄糖50 g，酵母浸膏5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L；MRS（de Man,Rogosa and Sharpe）培養(yǎng)基[20]：蛋白胨10 g，牛肉浸膏5 g，酵母浸膏4 g，無水葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，瓊脂15 g，吐溫800.1%（V/V），蒸餾水1 L，pH 6.0～6.4。以上培養(yǎng)基配制好后分裝，1×105Pa高壓滅菌20 min。

紅茶糖水發(fā)酵培養(yǎng)液：紅茶6 g，白砂糖40 g。先用開水將所用器具、紗布等清潔蕩洗；稱取6 g紅茶加開水（85～90 ℃）1 L浸泡5～10 min，用紗布過濾后去除茶渣，在茶湯中加入40 g白砂糖，攪拌混勻，冷卻后備用。

兒茶素類化合物標(biāo)準(zhǔn)品如兒茶素（catechin，C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子酸（gallic acid，GA） 美國Sigma公司；甲醇、三氟乙酸（色譜純） 德國Merck公司；酵母浸膏、無水葡萄糖、亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、苯酚（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（分析純） 廣東環(huán)凱生物科技公司；氫氧化鈉、碳酸鈣、無水乙醇（均為分析純） 西隴化工股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純） 上海Macklin生化科技有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；紅茶茶葉、白砂糖 福建省福州市永輝超市；土壤基因組DNA提取試劑盒PowerSoil?DNA Isolation Kit 美國MoBio Laboratories公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平、Starter 2100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；LRH-250 F 生化培養(yǎng)箱 上海一恒公司；紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；PC-6 PLUS落地高速冷凍離心機(jī) 德國賽默飛世爾公司；LC-2030高效液相色譜儀 日本島津公司；5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 安捷倫科技（中國）有限公司；Nano Drop 2000超微量分光光度計 德國賽默飛世爾公司；Qubit?2.0熒光核酸定量計 美國Life Technologies派克生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株混合方式及培養(yǎng)條件

菌株C3和C5分別采用酵母菌液體培養(yǎng)基，菌株C6和J5采用GY液體培養(yǎng)基，接種后置于180 r/min搖床中28 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)36～48 h后，各菌株均配成1×106個/mL的菌懸液，按4 個菌株單獨(dú)培養(yǎng)（C3、C5、C6、J54 個處理）、兩個菌株混合培養(yǎng)（C3C5、C3C6、C3J5、C5C6、C5J5、C6J5）、3 個菌株混合培養(yǎng)（C3C5C6、C3C5J5、C5C6J5、C3C6J5）和4 個菌株混合培養(yǎng)（C3C5C6J5）的方法分別進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，以不接菌的紅茶糖水發(fā)酵液作為對照。在250 mL三角瓶中裝入150 mL紅茶糖水培養(yǎng)液，每個菌株各取0.1 mL菌懸液單獨(dú)或等比例混合接種，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，然后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵培養(yǎng)[18]。以12 d為一個發(fā)酵周期，將發(fā)酵后的菌液按20%接種量再重新接入紅茶液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，以此類推，對混菌發(fā)酵液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在培養(yǎng)至第6代時，觀察發(fā)酵液的顏色、氣泡、氣味和是否產(chǎn)生菌膜等現(xiàn)象。其后，選擇C3C5C6、C3J5C6、C5J5C6和C3C5C6J54 個菌株組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌體生長動態(tài)

混合菌株組合于28 ℃恒溫箱靜置發(fā)酵培養(yǎng)，每隔24 h在無菌條件下取樣5 mL菌液。用1 cm比色杯在600 nm波長處測定各組合不同生長時間培養(yǎng)液的OD600nm值，每個組合設(shè)置3 個重復(fù)，以相同條件下等量未發(fā)酵紅茶糖水作為對照。以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制混合菌種組合的動態(tài)生長曲線。

1.3.3 發(fā)酵液生理生化指標(biāo)測定

對各菌株組合發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值、總酸含量和還原糖含量等指標(biāo)進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。接種后每隔24 h在無菌環(huán)境下吸取發(fā)酵液5 mL，用Starter 2100 pH計測定發(fā)酵液的pH值，每瓶測3 次取平均值。參照酸堿滴定法測定發(fā)酵液總酸含量[14-15]。參照DNS法測定發(fā)酵液還原糖含量[18]。茶多酚含量測定參照GB/T 21733—2008《茶飲料》的方法進(jìn)行[21]。

采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中兒茶素類化合物相對含量[22]。分別在發(fā)酵后第1、3、5、7天定時取樣20 mL茶菌發(fā)酵液，9000 r/min離心5 min后取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液，備用。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取EC、EGC、ECG、EGCG、C、GA固體標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）各5 mg，用50%的甲醇溶液溶解并定容至5 mL，則以上6 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)儲備液質(zhì)量濃度均為1 mg/mL。

色譜條件：色譜柱為Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.05%三氟乙酸溶液，流動相B為甲醇；流動相洗脫梯度：流動相A、B流速均為0.5 mL/min。流動相梯度：0～13 min，90%～30% A、10%～70% B；13～19 min，30% A、70% B；19～20.5 min，30%～90% A、70%～10% B；20.5～25 min，90% A、10% B。柱溫30 ℃；紫外檢測器檢測波長280 nm，檢測器掃描范圍200～380 nm；分析周期25 min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析[23]

1.3.4.1 頂空固相微萃取

混合菌群C3C5C6J5接種紅茶糖水培養(yǎng)液作為處理組，未接菌紅茶糖水培養(yǎng)液作為對照組，培養(yǎng)7 d后用頂空固相萃取法分別收集揮發(fā)性氣體。將處理組發(fā)酵液和對照組的培養(yǎng)液10000 r/min離心2 min，取上清液然后進(jìn)行抽濾，取8 mL發(fā)酵液置于20 mL頂空瓶中，加入2 g氯化鈉，搖晃混勻制成飽和溶液，再于50 ℃用提前預(yù)熱的磁力攪拌器攪拌5 min后，將老化處理后的DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入頂空瓶，萃取30 min。

1.3.4.2 氣相色譜-質(zhì)譜法分析

色譜條件：色譜柱為HP-Innowax（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序?yàn)?0 ℃保溫3 min，5 ℃/min上升到150 ℃保持10 min，再以6 ℃/min上升到230 ℃保持10 min；載氣為氦氣；柱流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，不分流。

質(zhì)譜條件：電子電離源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，檢測電壓為350 V，電流強(qiáng)度為0.2 mA，檢測溫度為230 ℃。采集模式為全掃描。

根據(jù)出峰時間與NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的匹配度對氣體成分進(jìn)行定性（去除匹配度低于70%的數(shù)據(jù)），用色譜峰面積歸一法定量求出各種氣體成分的相對含量。

1.3.5 菌株人工分離培養(yǎng)

為分析和驗(yàn)證混合菌群C3C5C6J5連續(xù)轉(zhuǎn)接6 代后菌群的穩(wěn)定性和各菌株的大致含量，采用酵母菌培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基，對培養(yǎng)7 d后的發(fā)酵液和菌膜樣品，以稀釋分離法分別進(jìn)行分離純化，統(tǒng)計各菌株數(shù)量（CFU/mL）[18]。

1.3.6 菌群宏基因組分析

1.3.6.1 DNA的提取

在紅茶糖水培養(yǎng)液接種C3C5C6J5組合，連續(xù)轉(zhuǎn)接至第6代，培養(yǎng)7 d后，取5 mL發(fā)酵液10000 r/min離心10 min，棄上清液獲得菌體混合物，洗滌菌體3 次。然后用Power Soil?DNA Isolation Kit提取菌體混合物樣本中的DNA，所得的DNA用超微量分光光度計檢測其濃度、純度（A260nm/A280nm）及含量，將符合宏基因組測序標(biāo)準(zhǔn)的DNA存放于-20 ℃冰箱保存。樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司分析。

1.3.6.2 基因組DNA片段化和文庫構(gòu)建

將得到的樣本DNA片段化，使得最終打斷的DNA片段大小控制在300～500 bp之間。建立1 個長度在500 bp左右的文庫，使得初始DNA總量為300 ng，使用Elution buffer將文庫中DNA質(zhì)量濃度配制為3 ng/μL。將片段化的DNA進(jìn)行濃縮回收，使用熒光核酸定量計Qubit?2.0對純化后的DNA濃度進(jìn)行檢測。使用NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?試劑盒對純化后的DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建。樣本測序數(shù)據(jù)量為10 G。

1.3.6.3 數(shù)據(jù)處理和測序分析

將宏基因組分析測得的原始數(shù)據(jù)使用FastQC軟件對其進(jìn)行質(zhì)量評估，將帶接頭和低質(zhì)量的序列進(jìn)行去除，從而得到相對可靠序列。將通過質(zhì)量控制的樣本序列使用IDBA_UD軟件進(jìn)行拼接與組裝，根據(jù)序列之間的組間關(guān)系獲得長序列contigs，對多個拼接組裝結(jié)果進(jìn)行綜合評定，對拼接效果最佳的序列進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測，挑選長度大于100 bp的預(yù)測基因?qū)⑵浞g成氨基酸序列。根據(jù)基因預(yù)測結(jié)果，使用CD-HIT軟件去除冗余基因，獲得樣本的非冗余基因。采用Bowtie2軟件對樣本的質(zhì)控序列和非冗余基因序列進(jìn)行對比，獲得同源序列，比較基因特征得到樣本的物種分類信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用GraphPad Prism 8.0.1和Excel作圖，系統(tǒng)發(fā)育樹由軟件MEGA 6.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株混合培養(yǎng)及生物膜的形成

在靜置培養(yǎng)條件下，不同菌株的單獨(dú)培養(yǎng)、不同混合培養(yǎng)組合在紅茶糖水培養(yǎng)液中培養(yǎng)至第3天均可見菌體濃度的增加。單獨(dú)培養(yǎng)情況下，C3和C6生長快，菌體增加比較明顯；C5和J5生長相對較慢，菌體增加不明顯。C3和C5單獨(dú)培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中未見氣泡產(chǎn)生，而C6和J5單獨(dú)培養(yǎng)時產(chǎn)生氣泡，特別是C6的發(fā)酵液中氣泡明顯。菌株J5在單獨(dú)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生絮狀物。在不同菌株的組合中，凡是含有C6的組合，培養(yǎng)過程中均可見氣泡產(chǎn)生。從培養(yǎng)后3 d開始，在C3單獨(dú)或含有C3的菌株組合培養(yǎng)中，在發(fā)酵液的表面可見碎片狀漂浮物（圖1A）；這些漂浮物易破碎，搖動后下沉。凡是含有J5的組合，均可見在發(fā)酵液表面生成完整而牢固的菌膜（圖1B），不易破碎。

圖1 不同菌株發(fā)酵后茶菌培養(yǎng)液表面形成的漂浮物Fig.1 Microbial pellicles formed on the surface of tea fungus fermentation broth

2.2 菌株混合培養(yǎng)生長動態(tài)

各菌株按等比例混合后，4 個不同菌株組合的菌體增長趨勢基本一致（圖2）。菌株組合C3C5C6J5啟動生長的速度最快，培養(yǎng)后10 d一直保持較強(qiáng)的菌體增長勢頭；至發(fā)酵后第10天，菌液OD600nm值達(dá)到0.6254；發(fā)酵后第11天開始，菌液OD600nm值開始下降。發(fā)酵后2～5 d，組合C3C5C6的菌體數(shù)量直線上升，其后保持較快的增長速度，至發(fā)酵后第12天，菌液OD600nm值達(dá)到0.6663，與其他3 個菌株組合相比差異顯著。在發(fā)酵后1～10 d，菌株組合C3J5C6的菌體數(shù)量呈波浪式增長，與其他3 個組合相比，整體上菌體增長速度較慢。組合C5J5C6在發(fā)酵后7 d菌體數(shù)量增長較緩慢，發(fā)酵后8～12 d生長速度加快。4 個菌株組合相比較，組合C3C5C6的菌體數(shù)量增長較快，生長后勁較強(qiáng)。

圖2 發(fā)酵過程中菌體生長動態(tài)Fig.2 Dynamics of microbial growth

2.3 發(fā)酵液生理生化變化

2.3.1 發(fā)酵液還原糖含量變化

與不發(fā)酵的對照相比，4 個混合菌株組合在12 d的發(fā)酵期間，發(fā)酵液中還原糖含量均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢（圖3）。其中，組合C3J5C6發(fā)酵液中還原糖含量最高，與對照、組合C3C5C6、C5J5C6和C3C5C6J5的發(fā)酵液相比差異顯著。在12 d的發(fā)酵過程中，組合C5J5C6和C3C5C6J5的發(fā)酵液中還原糖含量直線上升，趨勢比較一致；而在發(fā)酵前6 d，組合C3C5C6發(fā)酵液中還原糖含量差異不顯著；發(fā)酵后6 d，還原糖含量逐漸上升。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖含量變化Fig.3 Changes in reduced sugar content during fermentation

2.3.2 發(fā)酵液pH值和酸度變化

混合發(fā)酵過程中，不同菌株組合發(fā)酵液中pH值的變化情況見圖4A。紅茶糖水培養(yǎng)液的pH值保持在5左右。接種時由于加入20%的傳代培養(yǎng)液，接種后培養(yǎng)液的pH值急劇下降，4 個不同菌株組合的初始pH值在3～3.3之間，顯著低于對照。隨著發(fā)酵進(jìn)行，各組合的pH值進(jìn)一步下降。在12 d的發(fā)酵過程中，組合C3J5C6發(fā)酵液的pH值從3.32降至3.01，顯著高于組合C3C5C6、C5J5C6和C3C5C6J5。組合C5J5C6和C3C5C6J5發(fā)酵液的pH值變化基本一致；發(fā)酵后第11天發(fā)酵液的pH值最低為2.65。

不同菌株混合發(fā)酵有機(jī)酸（以乙酸計）隨時間的動態(tài)變化曲線見圖4B。紅茶糖水培養(yǎng)液的總酸質(zhì)量濃度在12 d內(nèi)保持在0.16～0.21 g/L之間。與對照相比，各組合有機(jī)酸的含量隨發(fā)酵時間的延長均逐漸升高。組合C3C5C6J5混合培養(yǎng)3 d后，發(fā)酵液中總酸含量快速增加；發(fā)酵至第12天時，發(fā)酵液總酸質(zhì)量濃度達(dá)到3.43 g/L。發(fā)酵7 d后，組合C3J5C6發(fā)酵液總酸含量增長的趨勢和組合C5C6J5基本相似，但顯著低于組合C3C5C6J5。組合C3C5C6總酸含量的增速比較緩慢，酸度的變化幅度最??；發(fā)酵12 d后，組合C3C5C6發(fā)酵液的總酸質(zhì)量濃度為1.88 g/L。

2.3.3 發(fā)酵液中總茶多酚含量變化

從發(fā)酵開始至發(fā)酵后8 d，對照組和各實(shí)驗(yàn)組總茶多酚含量均大幅度下降（表1）。從發(fā)酵后第8天開始，各處理和對照的發(fā)酵液中總茶多酚含量又有所升高，各處理之間的茶多酚含量差異不顯著。綜合分析混菌發(fā)酵全過程中茶多酚含量的變化，其中，對照組發(fā)酵前茶多酚質(zhì)量濃度為0.7554 mg/mL，發(fā)酵12 d后質(zhì)量濃度為0.32878 mg/mL，茶多酚減少量約為0.43 mg/mL。在整個發(fā)酵過程中，菌株組合C5J5C6中茶多酚含量下降最為明顯，減少量約為0.45 mg/mL；其次為菌株組合C3C5C6和菌株組合C3C5C6J5，茶多酚減少量約為0.41 mg/mL，而菌株組合C3J5C6中茶多酚含量下降最少，減少量約為0.35 mg/mL。

表1 不同菌株組合發(fā)酵后茶多酚含量變化Table 1 Changes in tea polyphenol content during fermentation with different microbial consortia mg/mL

2.3.4 發(fā)酵液兒茶素和GA含量變化

采用混合菌株組合C3C5J5C6考察發(fā)酵后不同時間兒茶素單體成分和GA的含量變化（表2）。在紅茶糖水培養(yǎng)液中接入混合菌種初期（接種后1 h之內(nèi)取樣），發(fā)酵液中C、EC、ECG和EGCG的含量影響不顯著，但EGC和GA的含量已顯著下降。在對照組中，酯型兒茶素和非酯型兒茶素含量在前3 d均呈下降趨勢，但非酯型兒茶素的下降量（0.72 mg/mL）比酯型兒茶素（0.1 mg/mL）更加明顯；之后含量相對穩(wěn)定。GA含量前3 d下降明顯，3 d后逐漸回升。發(fā)酵組中，兒茶素類總含量從發(fā)酵后1～3 d下降明顯；發(fā)酵后3～5 d快速回升，之后含量趨于穩(wěn)定。酯型兒茶素（EGCG、ECG）發(fā)酵初期總量從0.60 mg/mL下降至0.51 mg/mL；之后稍有回升。非酯型兒茶素（EGC、EC和C）的含量在發(fā)酵初期同樣呈現(xiàn)下降趨勢，之后相對穩(wěn)定。GA含量也呈現(xiàn)相似的變化趨勢。

表2 菌株組合C3C5J5C6發(fā)酵后兒茶素和GA質(zhì)量濃度變化Table 2 Changes in catechin and gallic acid contents during fermentation with the four-strain consortium mg/mL

2.3.5 發(fā)酵液揮發(fā)性成分含量分析

在混合菌株組合C3C5J5C6發(fā)酵后7 d取樣，采用頂空固相萃取和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合分析發(fā)酵液揮發(fā)性成分（表3）。發(fā)酵組與未發(fā)酵組共檢測出25 種揮發(fā)性成分，主要由酸類、酚類、酯類和醇類等化合物組成。未發(fā)酵組中共檢測到13 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中酸類物質(zhì)4 種，分別是壬酸（3.4566%）、3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸（2.2362%）、癸酸（1.4932%）和辛酸（1.1988%）；酚類1 種，2,4-二叔丁基苯酚（18.3608%）；醇類6 種，分別是苯乙醇（11.6100%）、香葉醇（4.2933%）、芐醇（3.1791%）、糠醇（1.0943%）、2-乙基-2,6-己醇（0.5042%）和芳樟醇（0.4879%）；酯類1 種（鄰苯二甲酸二丁酯，0.5978%），醛類1 種（苯乙醛，1.6301%）。接菌發(fā)酵7 d后，共檢測到揮發(fā)性物質(zhì)23 種，其中酸類物質(zhì)9 種，分別是3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸（1.3470%）、壬酸（0.9800%）、癸酸（0.7276%）、肉豆蔻酸（0.7276%）、己酸（0.5648%）、辛酸（0.3799%）、反式-2-己烯酸（0.3589%）、丁酸（0.3445%）和月桂酸（0.1287%）；酚類物質(zhì)3 種，分別是4-乙基苯酚（16.8802%）、2,4-二叔丁基苯酚（5.8007%）和4-乙基-2-甲氧基苯酚（3.3871%）；醇類物質(zhì)6 種，分別是苯乙醇（7.7036%）、芐醇（0.9584%）、芳樟醇（0.5450%）、α-松油醇（0.3855%）、2-乙基己醇（0.2413%）和糠醇（0.1656%）；酯類物質(zhì)2 種，分別是二氫獼猴桃內(nèi)酯（0.1923%）和γ-壬內(nèi)酯（0.1789%）；酮類物質(zhì)1 種（香葉基丙酮，0.2086%），烯類物質(zhì)1 種（2-莰烯，0.5272%），其他類型化合物2 種。

表3 菌株組合C3C5J5C6發(fā)酵后揮發(fā)性成分相對含量變化Table 3 Changes in relative contents of volatile components after fermentation with the four-strain consortium for 7 days

經(jīng)過7 d發(fā)酵后，發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)的種類大幅增多。酸類物質(zhì)總和為5.559%；與對照相比，癸酸、壬酸、3,7-二甲基-2,6-辛二烯酸和辛酸的含量均下降；新產(chǎn)生己酸、丁酸和月桂酸等短鏈有機(jī)酸。酚類物質(zhì)種類增多，含量也顯著增加。揮發(fā)性醇類物質(zhì)總和從21.1688%下降至9.9994%，苯乙醇、香葉醇、芐醇和糠醇含量顯著下降；其中苯乙醇含量下降幅度最大，達(dá)3.9064%，但是新產(chǎn)生α-松油醇。發(fā)酵后，新產(chǎn)生了γ-壬內(nèi)酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯和香葉基丙酮。

2.4 菌群分析

混合菌株組合C3C5J5C6接種發(fā)酵后，在第1次移接的發(fā)酵液表面即可見形成菌膜。此后，按紅茶菌常規(guī)的移接方法，經(jīng)過6 個循環(huán)的移接，發(fā)酵液的氣味、顏色和菌膜等特征基本穩(wěn)定。

2.4.1 人工分離培養(yǎng)

采用酵母菌培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基分別對菌株組合C3C5J5C6的發(fā)酵液和菌膜進(jìn)行稀釋分離，依照菌落形態(tài)和顯微鏡觀察，大致可以區(qū)分為4 種酵母菌和3 種細(xì)菌（圖5A）。與本實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果相比，菌株組合C3C5J5C6在紅茶糖水培養(yǎng)液中經(jīng)歷6 次傳接，第6次轉(zhuǎn)接發(fā)酵7 d后，培養(yǎng)液中含有L.elongisporus（8.40×106CFU/mL）、木糖駒形氏桿菌（K.xylinus）（2.67×107CFU/mL）、Meyerozyma（2.33×106CFU/mL）和Gluconacetobacter（4.93×107CFU/mL）；其他兩種酵母菌均為假絲酵母屬（Candida）的種類；另一種細(xì)菌為醋桿菌（Acetobacter）。在菌膜中只分離獲得兩種菌，分別為Meyerozyma（5.77×107CFU/mL）和Gluconacetobacter（5.33×105CFU/mL）。

圖5 菌株組合C3C5J5C6傳代6 次后菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 Changes in microbial community structure of the four-strain synthetic consortium after six passages

2.4.2 宏基因組分析

通過同源序列對比，混合菌株組合C3C5C6J5的發(fā)酵液中優(yōu)勢酵母菌屬為洛德酵母屬（Lodderomyces），占總檢測微生物的25.29%；其次為Meyerozyma和Candida，分別占比為21.56%和1.70%；其他的菌屬如德巴利氏酵母屬（Debaryomyces）和米勒酵母屬（Millerozyma），占比均小于1%。優(yōu)勢細(xì)菌屬為駒形氏桿菌屬（Komagataeibacter），占總檢測微生物的21.56%；其次為醋酸桿菌屬（Acetobacter）、Gluconacetobacter、葡糖桿菌屬（Gluconobacter）和醋酸桿菌科的1 個未命名屬，分別占比為2.99%、2.37%、1.39%和1.15%。

在種水平上（圖5 B），酵母菌優(yōu)勢種分別為L.elongisporus（占25.29%）和季也蒙邁耶氏酵母（M.guilliermondii）（20.92%），其他種均低于1%。細(xì)菌優(yōu)勢種分別為K.xylinus（占5.31%）、歐洲駒形氏桿菌（K.europaeus）（4.85%）、居間駒形氏桿菌（K.intermedius）（3.24%）、K.kakiaceti（3.25%），Komagataeibactersp.（1.71%）、K.medellinensis（1.20%）和Gluconacetobactersp.SXCC-1（占2.03%）。其他種占比均小于1%。

3 討論

不同地域生產(chǎn)的茶菌參與發(fā)酵的微生物千差萬別，是決定其風(fēng)味、營養(yǎng)和生理功能的重要因素之一[24]。分析和解釋菌群中菌株的不同類型、組成、功能和相互作用關(guān)系，是當(dāng)今傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化的重點(diǎn)科學(xué)問題[25-27]。經(jīng)過長期的研究，茶菌微生物共生體（SCOBY）的主要組成在屬級分類單元上已經(jīng)比較清楚，主要包括酵母屬（Saccharomyces）、酒香酵母屬（Brettanomyces）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）和Candida等菌屬的酵母菌和Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter的醋酸菌[4,6]；但不同菌群所含有的種和菌株差異很大，其具體功能和相互作用關(guān)系依然不清楚[17,27]。菌株組合C3C5J5C6在紅茶糖水中發(fā)酵培養(yǎng)6 代后，宏基因組分析顯示菌株C5是優(yōu)勢菌株，占比為25.29%。在BLAST比對時，菌株C3的ITS序列相似性與M.caribbica和M.guilliermondii均在99%以上[18]，難以區(qū)分；此次宏基因組分析顯示M.guilliermondii占比為20.92%。醋酸菌包括Acetobacter、Gluconacetobacter和Komagataeibacter的細(xì)菌，相互之間親緣關(guān)系密切，分類地位常有調(diào)整[18]。發(fā)酵劑C3C5J5C6中所包含的菌株在傳代6 次后依然是優(yōu)勢菌株，特別是酵母菌菌株C5和C3，占比分別為25.29%和20.92%，居于絕對優(yōu)勢地位。因此，菌株組合C3C5J5C6在使用過程中穩(wěn)定。由于茶菌的生產(chǎn)過程沒有進(jìn)行嚴(yán)格意義上的滅菌處理，因此也可能帶進(jìn)其他的微生物菌株。

已有的茶菌人工菌群構(gòu)建均至少含有1 種酵母菌和1 種醋酸菌[12-17,19,22,28]。早期的研究依賴于人工分離和純化技術(shù)，受培養(yǎng)基選擇性的限制，能夠分離獲得的菌株有限，像醋酸菌這類微生物的分離純化尤其困難[29]，難以解釋發(fā)酵液中菌群的全貌。如Hesseltine[12]和Kozaki等[13]均分離到多種酵母菌，但只分離獲得1 種Acetobacter；利用純化菌株混合培養(yǎng)產(chǎn)生菌膜，明確木糖醋桿菌（A.xylinum）是產(chǎn)生菌膜的關(guān)鍵菌株，不同酵母菌均可以起促進(jìn)菌膜形成的作用。因此，Acetobacter（特別是A.xylinum）是必須的，而酵母菌可以選擇不同菌株。隨著菌株分離和菌群分析技術(shù)的發(fā)展，從茶菌中獲得的菌株逐漸增多。應(yīng)用從茶菌中分離的菌株、菌種保藏中心的保存菌株和商業(yè)菌株構(gòu)建茶菌人工菌群的研究逐漸增多[14-15,22,28]。這些人工構(gòu)建的菌群或沒有形成菌膜，或沒有將菌膜作為考察指標(biāo)。細(xì)菌纖維素和菌膜是茶菌的典型特征，特別是菌膜，是決定靜置培養(yǎng)條件下茶菌發(fā)酵環(huán)境的主要因素。采用從天然茶菌中分離的5 株醋酸菌、2 株乳酸菌和4 株酵母菌，Savary等[30]成功構(gòu)建了一個能夠產(chǎn)生菌膜的人工菌群，確定其中的4 個菌株是優(yōu)勢菌株；其中2 個醋酸菌菌株可以產(chǎn)生細(xì)菌纖維素和菌膜。通過4 個菌株在紅茶糖水培養(yǎng)液中單獨(dú)培養(yǎng)和不同混合培養(yǎng)的比較，本實(shí)驗(yàn)明確供試的4 個菌株中只有菌株J5可以產(chǎn)生完整的菌膜；菌株C6也是醋酸菌，但單獨(dú)培養(yǎng)和與其他酵母菌混合均沒有產(chǎn)生菌膜。

發(fā)酵過程中，4 個混合培養(yǎng)組合的菌體增長趨勢基本一致，但發(fā)酵液pH值、總酸度、還原糖含量差異明顯。這一結(jié)果與林娟[15]、Li Ruyi[19]和Nguyen[22]等的結(jié)果相似，說明發(fā)酵劑的菌種組成改變會顯著影響整個共生體系的代謝和發(fā)酵液的化學(xué)成分[7]。菌株C3、C5、C6的糖利用能力和產(chǎn)有機(jī)酸能力存在差異[18]；因此，和菌株J5以不同的方式混配時，存在不同的相互作用關(guān)系，發(fā)揮不同的功能。本研究不同菌株組合發(fā)酵后，發(fā)酵液中茶多酚、兒茶素和GA含量的變化與Wang Shuai[16]、汪鵬輝[18]等的結(jié)果不一致。發(fā)酵前期這些組分的含量明顯下降，后期則逐漸回升。單獨(dú)培養(yǎng)條件下，菌株C3、C5和C6發(fā)酵后對發(fā)酵液中茶多酚含量均有不同的提升效果[18]，但C3C5C6J5組合后發(fā)酵液中含量下降，維持在0.5 mg/mL左右。這些差異可能與不同菌株及其組合的代謝能力相關(guān)。菌株組合C3C5C6J5發(fā)酵后，茶菌的揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)量發(fā)生明顯的變化，短鏈脂肪酸、酚類、醇類和脂類物質(zhì)種類增多?？傮w變化趨勢與之前的研究大致相似[1,30-31]。但是，由于用于發(fā)酵的原料、微生物、發(fā)酵工藝和環(huán)境條件的差異，風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量差異很大。人體消化道適宜的pH值應(yīng)不低于3；飲料要維持口感酸爽的滋味，總酸一般應(yīng)維持在4～5 g/L之間[3]。比較4 個不同菌株組合的糖利用、pH值和有機(jī)酸產(chǎn)生情況，混菌組合C3C5C6J5發(fā)酵產(chǎn)生的茶菌液比較合適。今后，可以進(jìn)一步研究茶菌中不同功能成分的閾值[19]，綜合分析有機(jī)酸、糖類、多酚類物質(zhì)等不同功能成分對茶菌風(fēng)味的影響，篩選出更為適合的菌株組合；也可以進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，達(dá)到最優(yōu)的發(fā)酵效果。

茶菌發(fā)酵是一個動態(tài)的過程。目前的茶菌發(fā)酵還是在開放條件下進(jìn)行，從工業(yè)發(fā)酵的角度出發(fā)，人工混合菌群的穩(wěn)定性需要加以關(guān)注[7,22,25]。依照茶菌典型的形態(tài)、風(fēng)味和代謝產(chǎn)物，本研究成功構(gòu)建了混合菌群C3C5C6J5。經(jīng)馴化轉(zhuǎn)接6 代以后，在這一人工混合菌群中，菌株J5是核心菌株，是生產(chǎn)纖維素和形成菌膜的主要菌株，而菌株C3、C5和C6是優(yōu)勢菌株。但是，菌株C3、C5、C6與菌株J5之間的相互作用關(guān)系，以及這種互作關(guān)系對茶菌發(fā)酵過程、功能成分和菌群穩(wěn)定的影響，需要作進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

分離自紅茶菌的C3、C5、C6和J5菌株中，菌株J5是生產(chǎn)細(xì)菌纖維素和促進(jìn)菌膜形成的核心菌株。菌株J5和菌株C3、C5、C6混合構(gòu)成一個穩(wěn)定的人工發(fā)酵劑菌株組合，傳代6 次后，4 個菌株在發(fā)酵液中依然占據(jù)優(yōu)勢。以紅茶糖水為培養(yǎng)液，菌株組合C3C5C6J5在菌體生長、糖利用、有機(jī)酸產(chǎn)生和揮發(fā)性物質(zhì)產(chǎn)生等發(fā)酵性能方面與天然的紅茶菌發(fā)酵相似；但發(fā)酵后總多酚和兒茶素含量的變化與天然紅茶菌發(fā)酵相比有差異?；旌暇篊3C5C6J5的構(gòu)建為茶菌發(fā)酵過程的優(yōu)化、放大和工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。