張立佳，劉麗君，汪 洋，文 靜，莫 楠，謝瑞龍，呂志勇，李翠枝

（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

草銨膦是我國允許使用的除草劑。中國作為全球農(nóng)業(yè)大國，草銨膦轉(zhuǎn)基因技術(shù)推廣和應(yīng)用，已經(jīng)成為全球第二大轉(zhuǎn)基因作物除草劑[1]。草銨膦是屬于新型廣譜長效觸殺型化學(xué)除草劑，具有化學(xué)活性高、低毒、無污染、易降解、對作物安全、環(huán)境友好和除草快捷等特點[2]。盡管草銨膦是屬于廣譜非持久性農(nóng)藥，但如果放任其大量的、無約束的長期使用，則仍是有一定可能在農(nóng)作物上產(chǎn)生殘留，再通過食物鏈進入人類的餐桌，影響人體健康。草銨膦也可以在動物體內(nèi)代謝為3-(甲基膦基)丙酸和N-乙酰基草銨膦。大量研究發(fā)現(xiàn)吸入低劑量的草銨膦可以傷害新生兒和動物幼崽大腦的發(fā)育，高劑量可以導(dǎo)致過敏、高燒、精神紊亂、流涕、抽搐等中毒癥狀，此外，該藥物的殘留可以升級為食品安全事件，擾亂國際進出口貿(mào)易[3-4]。世界各國已制定了草銨膦最大殘留限量的規(guī)定，美國和日本限量值為0.05～6.00 mg/kg[5]，加拿大限量值為0.10～2.00 mg/kg[6]，國際食品法典規(guī)定0.02～8.00 mg/kg[7]，歐盟規(guī)定0.10～5.00 mg/kg[8]，GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定為0.01～0.50 mg/kg，其中牛乳中最大殘留限量為0.02 mg/kg[9]，并定義以草銨膦及其3-(甲基膦基)丙酸和N-乙酰基草銨膦2 種代謝物之和計。隨著牛乳需求量日益增加，為防止草銨膦的濫用，保證牛乳的品質(zhì)，真正實現(xiàn)乳品行業(yè)安全監(jiān)控，亟需建立牛乳中草銨膦及其代謝物的檢測方法。

目前，國內(nèi)外報道的主要方法有：離子色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-15]、毛細管電泳法[16]和液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法[17-28]。離子色譜法存在基質(zhì)干擾較大，無法有效的分離，靈敏度無法滿足限量要求等缺點；氣相色譜-質(zhì)譜法存在前處理繁瑣，衍生反應(yīng)時間長等缺點；毛細管電泳法對于測試液的凈化效果要求較高，否則容易堵塞毛細管損壞儀器，同時檢測器靈敏度低，不適合復(fù)雜基質(zhì)的痕量分析；液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法在定性和定量上均具有一定的優(yōu)勢，但是仍受限于色譜分離能力和保留能力以及特殊基質(zhì)的前處理技術(shù)。我國尚未發(fā)布有關(guān)牛乳中草銨膦及其代謝物檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外鮮有報道，因而急需建立一種實用且快速檢測牛乳中草銨膦及其代謝物的分析方法，滿足食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的限量規(guī)定以及行業(yè)的訴求。本研究采用多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNTs）吸附劑作為前處理凈化填料，選用一款新型的陰離子農(nóng)殘專用色譜柱，旨在開發(fā)一種同時測定牛乳中草銨膦及其2 種代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。圖1為草銨膦與2 種代謝物的結(jié)構(gòu)式。

圖1 草銨膦及其代謝物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulas of glufosinate ammonium and its two metabolites

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 號77182-82-2、分子式C5H15N2O4P、純度≥99%）、3-(甲基膦基)丙酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號15090-23-0、分子式C4H9O4P、純度≥99%）N-乙?；蒌@膦標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號73634-73-8、分子式C7H14NO5P、純度≥94%） 美國Dr.Ehrenstorfer公司；草銨膦-D3鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號1323254-05-2、分子式C5H10D3N2O4P、純度≥99%） 美國TRC公司；C18SPE小柱（500 mg，6 mL）、石墨化炭黑（ENVICarb）SPE小柱（500 mg，6 mL） 美國默克公司；PRIME HLB SPE小柱（150 mg，3 mL） 美國Waters公司；MWCNTs（粒徑范圍10～20 nm，顆粒物長度5～15 μm，比表面積（225±25）m2/g） 天津博納艾杰爾科技有限公司；PSA和C18填料 美國西格瑪公司；一次性針式過濾器（0.2 μm，尼龍），乙腈、甲酸、甲酸銨（色譜級） 上海安譜實驗科技股份有限公司；Milli-Q純水由實驗室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）、BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國Waters公司；MS 3 basic旋渦振蕩器 德國IKA公司；Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；Millipore Q純水機 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

草銨膦標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：稱取草銨膦標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于100 mL塑料瓶容量瓶中，加入適量的超純水超聲助溶5 min，用水定容至刻度。

草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：稱取草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg于10 mL塑料瓶容量瓶中，用超純水定容至刻度。

N-乙?；蒌@膦標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：稱取N-乙?；蒌@膦標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于100 mL塑料瓶容量瓶中，用超純水定容至刻度。

3-(甲基膦基)丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）：稱取3-(甲基膦基)丙酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于100 mL塑料瓶容量瓶中，用超純水定容至刻度。

草銨膦混標(biāo)中間液（I）（1 μg/mL）的配制：分別量取草銨膦、3-(甲基膦基)丙酸和N-乙?；蒌@膦標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25 mL到25 mL塑料容量瓶中，用超純水定容至刻度。

草銨膦混標(biāo)中間液（II）（100 ng/mL）的配制：量取草銨膦混標(biāo)中間液（I）2.5 mL到25 mL塑料容量瓶中，用超純水定容至刻度。

草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液（I）（1 μg/mL）的配制：量取草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25 mL到25 mL塑料容量瓶中，用超純水定容至刻度。

草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液（II）（100 ng/mL）的配制：量取草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液（I）2.5 mL到25 mL塑料容量瓶中，用超純水定容至刻度。

以上試劑需要存放于聚乙烯或聚丙烯塑料瓶中，0～4 ℃，避光保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：選擇6 份陰性樣品，不加草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液，其余步驟同1.3.3節(jié)樣品前處理，制備空白基質(zhì)溶液。精密量取草銨膦混標(biāo)中間液（II）（100 ng/mL）0、10、20、50、100、200、500 μL至于不同的進樣小瓶中，分別加入草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液（II）（100 ng/mL）100 μL，分別用空白基質(zhì)溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度依次為0、1、2、5、1、20、50 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為10 ng/mL。溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線選用50%甲醇溶液稀釋，其余步驟同空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。

基質(zhì)效應(yīng)按下式[29-31]計算：

1.3.3 樣品前處理

稱取牛乳5 g（精確到0.0001 g），置于30 mL塑料離心管中，加入150 μL草銨膦-D3標(biāo)準(zhǔn)中間液（I）（1 μg/mL）混勻，靜置10 min，準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，渦旋振蕩提取10 min，0～4 ℃ 低溫冷凍離心（15000 r/min）5 min，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移到另外一支離心管中，加入10 mg MWCNTs填料凈化，渦旋振蕩10 min，0～4 ℃ 低溫冷凍離心（15000 r/min）5 min。取1.0 mL上清液于1.5 mL離心管中，0～4 ℃低溫冷凍離心（20000 r/min）5 min，取上清液過0.22 μm尼龍針式過濾器于進樣小瓶，待測定。

1.3.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.4.1 液相色譜條件

Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）；柱溫50 ℃；進樣量10 μL；流動相：0.9%甲酸溶液（A）和0.9%甲酸-乙腈溶液（B）；流速0.5 mL/min；線性洗脫梯度：0～3 min，10%～80% A、90%～20% B；3～5 min，80% A、20% B；5～8.0 min，10% A、90% B。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；數(shù)據(jù)采集采用負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式；脫溶劑溫度600 ℃；離子源溫度150 ℃，脫溶劑流量1000 L/h；草銨膦及其代謝物的離子對等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 草銨膦及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of glufosinate ammonium and its metabolites

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 提取試劑的選擇

由于生乳中含有大量的蛋白質(zhì)，需要去除蛋白，才能進質(zhì)譜檢測，而草銨膦及其代謝物的極性較強，易溶于水、甲醇、乙腈等，同時有機溶劑可以使生乳中的蛋白質(zhì)變性發(fā)生沉淀，因此考察甲醇和乙腈作提取試劑進行分析。結(jié)果表明：當(dāng)選擇乙腈作為提取試劑，凈化液體中牛乳蛋白質(zhì)去除的效果較好，但是草銨膦及其代謝物的提取效率不足50%，而當(dāng)選擇加入同等體積的甲醇作為提取試劑，牛乳蛋白質(zhì)去除效果不如乙腈作為提取試劑，但是提取效率可以達到90%以上，因此選擇甲醇作為提取試劑。

2.1.2 凈化方法的選擇

考察C18SPE小柱（500 mg，6 mL）、石墨化炭黑SPE小柱（500 mg，6 mL）、PRiME HLB SPE小柱（150 mg，3 mL）以及不過SPE小柱凈化效果。結(jié)果表明，3 種SPE小柱凈化后，批次間的重復(fù)性較差，重復(fù)性均大于20%，不符合方法重復(fù)性規(guī)定，只有不經(jīng)過SPE小柱凈化的重復(fù)性小于10%，需要繼續(xù)優(yōu)化。再次考察不過柱直接加入填料的凈化效果，分別加入相同質(zhì)量的C18填料、PSA填料、MWCNTs填料以及不加填料對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，草銨膦及其2 種代謝物在3 種填料中凈化效果均優(yōu)于不加填料，其中MWCNTs絕對回收率最高，說明去除基質(zhì)的能力最佳。MWCNTs是基于多個石墨烯片同軸卷曲結(jié)合優(yōu)秀的納米技術(shù)形成的中空管狀立體結(jié)構(gòu)，每層納米管壁通過sp2與周圍3 個碳原子結(jié)合，具有較大的比表面積；MWCNTs吸附機理主要集中在π-π作用、疏水作用、H鍵作用、靜電作用力等，與非極性有機化合物和多核芳香化合物相作用，而與極性較強的化合物不會產(chǎn)生吸附作用；牛乳中脂肪等非極性化合物含量較高，樣品基質(zhì)中含有高含量的脂肪會增加質(zhì)譜電噴霧電離源的表面張力，降低目標(biāo)物的霧化效率，增強基質(zhì)效應(yīng)，影響儀器的靈敏度以及數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，與文獻[32-33]中MWCNTs吸附非極性雜質(zhì)的效果優(yōu)于PSA結(jié)論一致。因此，選擇MWCNTs作為凈化填料，見圖2。同時，對MWCNTs添加量進行優(yōu)化，考察5、10、15、20 mg不同添加量，其中5 mg回收率最低，其他不同添加量并無明顯差異，因此，選擇最小的加入量10 mg。此外。比對凈化后的液體不離心和高速低溫離心之間的差異。結(jié)果表明，凈化后的液體不離心較渾濁，不適合精密儀器檢測，經(jīng)高速低溫離心后較澄清，可以有效去除油脂以及殘留蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。因此，凈化后的液體增加高速低溫離心凈化步驟。

圖2 不同凈化填料優(yōu)化Fig.2 Effect of different column fillers on the recoveries of glufosinate ammonium and its metabolites

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

草銨膦及其代謝物均屬于極性較強的酸性化合物，適合在質(zhì)譜的負(fù)離子模式下進行掃描分析。各目標(biāo)化合物工作液需要使用50%甲醇溶液稀釋，提高目標(biāo)化合物在儀器上的靈敏度。通過質(zhì)譜端的蠕動泵注入一定濃度的稀釋后標(biāo)準(zhǔn)溶液，在質(zhì)譜軟件的調(diào)諧界面優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，如電壓、溫度、氣體流速等質(zhì)譜參數(shù)，得到質(zhì)譜條件，選擇2 個響應(yīng)較強、無干擾的目標(biāo)物特征離子對，用于定性和定量分析。

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1 色譜柱的選擇

考察BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）。結(jié)果表明，BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）目標(biāo)峰保留能力差，不適合草銨膦及其代謝物的分析；BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）存在靈敏度低、色譜峰拖尾，且無法實現(xiàn)目標(biāo)物與基質(zhì)的有效分離，因此也不適用于草銨膦及其代謝物的分析；Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）是在BEH HILIC基礎(chǔ)上進行改進，結(jié)合WAX（陰離子交換）功能的一款新型的用于分析陰離子農(nóng)殘色譜柱，使該色譜柱對于草銨膦及其代謝物均具有優(yōu)秀的保留特性和選擇性。通過對Anionic Polar Pesticide色譜柱（2.1 mm×100 mm，5 μm）條件的優(yōu)化，可實現(xiàn)對草銨膦及其代謝物N-乙?；蒌@膦、3-(甲基膦基)丙酸的分離，經(jīng)過連續(xù)數(shù)日大量樣品的檢測，草銨膦及其代謝物N-乙?；蒌@膦、3-(甲基膦基)丙酸出峰時間較穩(wěn)定，色譜峰較好，受基質(zhì)干擾小，靈敏度高，滿足牛乳中草銨膦及其代謝物檢測分析。

2.3.2 液相色譜條件的優(yōu)化

考察3 種流動相體系，分別為水-乙腈（A）、0.9%甲酸-乙腈（B）、0.9%甲酸-0.9%甲酸乙腈（C）。結(jié)果表明，通過對水-乙腈（A）流動相體系優(yōu)化色譜梯度，目標(biāo)物的保留能力較差，并未獲得較好的色譜峰形；通過對0.9%甲酸-乙腈（B）流動相體系優(yōu)化色譜梯度，草銨膦色譜峰形得到改善，但是草銨膦的2 個代謝物并未獲得較好的色譜峰形；通過對0.9%甲酸-0.9%甲酸乙腈（C）流動相體系優(yōu)化色譜梯度，草銨膦及其代謝物均獲得較好的色譜峰形。此外，對流動相體系中的甲酸含量也進行優(yōu)化，當(dāng)體系中甲酸體積分?jǐn)?shù)低于0.9%，均無法獲得較好色譜峰形，當(dāng)系統(tǒng)中甲酸體積分?jǐn)?shù)大于0.9%，目標(biāo)化合物靈敏度和色譜峰形均未有顯著提升，因此選擇加入0.9%甲酸。同時對柱溫也進行優(yōu)化，分別考察35、40、45、50、55 ℃，當(dāng)溫度升高到50 ℃，草銨膦及其代謝物峰形均得到改善，并且靈敏度也得到顯著提升，當(dāng)柱溫升高到55 ℃，化合物的靈敏度略有下降。因此，柱溫定為50 ℃，見圖3。

圖3 草銨膦及其代謝物離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatograms of glufosinate ammonium and its metabolites

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法實現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)的評估分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)于單點或者多個點單獨比較基質(zhì)效應(yīng)評價，更具有統(tǒng)計意義和代表性。溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線A：用甲醇溶液（1∶2，V/V）稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、10、20、50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線B：用陰性樣品得到空白基質(zhì)溶液，配制成質(zhì)量濃度與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線A一致的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。通過空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線B斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線A斜率比值計算：草銨膦、3-(甲基膦基)丙酸和N-乙酰基草銨膦的基質(zhì)效應(yīng)分別為78%、86%和81%。結(jié)果表明，3 個化合物的基質(zhì)效應(yīng)均為抑制，而草銨膦基質(zhì)抑制效應(yīng)略大，為提高草銨膦檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和消除基質(zhì)效應(yīng)，草銨膦采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量，并配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，對檢測結(jié)果進行校準(zhǔn)。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限結(jié)果

由表2可知，草銨膦及其代謝物添加量為5～20、10～40 μg/kg和10～40 μg/kg時，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99，線性相關(guān)性良好；檢出限為2.5、5.0 μg/kg和5.0 μg/kg（以RSN=3確定檢出限），定量限分別為5、10.0 μg/kg和10.0 μg/kg（以RSN=10確定定量限），可以滿足分析的需要。

表2 草銨膦及其代謝物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,and limits of detection and quantification of glufosinate ammonium and its metabolites

2.6 準(zhǔn)確度和精密度實驗結(jié)果

選取空白樣品，進行低、中、高3 個水平分別6 個平行進行加標(biāo)實驗，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。研究表明，回收率范圍為79.35%～101.80%，RSD為1.15%～8.63%之間，均有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求。

表3 加標(biāo)回收率和RSDTable 3 Recoveries and relative standard deviations for spiked samples

2.7 實際樣品測定

利用本研究建立的方法對100 批次不同牧場原奶進行檢測，均未檢出草銨膦及其代謝物。

3 結(jié)論

采用新穎的MWCNTs吸附材料，結(jié)合一款新型的陰離子農(nóng)殘專用色譜柱，建立同時檢測牛乳中草銨膦及其代謝物殘留量檢測方法。牛乳中草銨膦及其代謝物3-(甲基膦基)丙酸和N-乙?；蒌@膦的檢出限分別為2.5、5.0 μg/kg和5.0 μg/kg，定量限為5.0、10.0 μg/kg和10.0 μg/kg，分別在5、10、20 μg/kg，10、20、40 μg/kg和10、20、40 μg/kg，3 個不同質(zhì)量濃度水平下的加標(biāo)回收率范圍為79.35%～101.80%，RSD為1.15%～8.63%（n=6）；該方法操作便捷、色譜條件穩(wěn)定、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于牛乳中草銨膦及其代謝物3-(甲基膦基)丙酸和N-乙?；蒌@膦殘留量檢測。