王 慧，吳小燕，夏亞男，王玉榮，洋 洋，烏有娜，雙 全

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

乳清作為制造干酪和干酪素的加工副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，如果將其排放，不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染。目前，一些乳業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家如荷蘭、德國(guó)、美國(guó)已經(jīng)擁有了較強(qiáng)的乳清加工能力，與這些國(guó)家相比，我國(guó)對(duì)于乳清廢液的處理能力相對(duì)落后[1]。因此，乳清資源的合理開(kāi)發(fā)和利用已經(jīng)成為了急需解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，研究人員一直致力于將乳清更加合理利用，實(shí)現(xiàn)乳清的商業(yè)價(jià)值。毛婷等[2]研制一款發(fā)酵型牦牛乳清酒，口感獨(dú)特，得到了大量開(kāi)發(fā)應(yīng)用。孫子羽等[3]對(duì)黑枸杞乳清酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究分析，檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，以酯類物質(zhì)為主，主要成分是癸酸乙酯和辛酸乙酯，其次是醇類、酸類、醛類、烴類物質(zhì)。張敏[4]研制一款低醇乳清酒，篩選出最佳發(fā)酵菌種并對(duì)乳清酒的氨基酸含量進(jìn)行分析得出含量由高到低依次是谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸等。乳清酒發(fā)酵過(guò)程中微生物在其生產(chǎn)和風(fēng)味形成過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。但截至目前，缺少對(duì)乳清酒微生物多樣性和風(fēng)味的相關(guān)研究，無(wú)法為乳清酒的生產(chǎn)及工藝優(yōu)化提供指導(dǎo)。

本研究擬采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀對(duì)乳清酒發(fā)酵過(guò)程中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化進(jìn)行分析，運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)乳清酒發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并進(jìn)一步展開(kāi)相關(guān)性分析，揭示乳清酒發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替對(duì)風(fēng)味物質(zhì)形成的推動(dòng)作用，以期為乳清發(fā)酵酒的風(fēng)味調(diào)控及乳清產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗、桑葚、枸杞、葡萄干、白砂糖、乳清粉均為市售。

酵母菌為ALE -514 澳洲馬利釀酒干酵母（Saccharomyces cerevisiae），商品名Maurivin。

乳酸菌為PC-01 食用乳酸菌，配料：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lacotbacillus bulgaricus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

1.2 儀器與設(shè)備

TAISITE高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；bluepard生化培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；Illumina MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清酒釀造工藝

原料→清洗→粉碎→滅菌→調(diào)糖→調(diào)pH值→發(fā)酵→過(guò)濾→裝瓶

操作要點(diǎn)：1）原料：挑選大小均勻、成熟且無(wú)蟲(chóng)害潰爛；枸杞、桑葚、紅棗、葡萄干和乳清液的添加量為20.0、20.0、15.0、10.0 g/L和10%。2）清洗：將原料用去離子水清洗2 次，除去原料表面灰層等雜質(zhì)。3）粉碎：使用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)將原料進(jìn)行粉碎。4）滅菌：將灌裝好的乳清發(fā)酵酒進(jìn)行水浴滅菌，溫度99 ℃，時(shí)間30 min。5）調(diào)糖度：使用白砂糖將可溶性固形物調(diào)整到6.0%左右。6）調(diào)pH值：使用檸檬酸、檸檬酸鈉將pH值調(diào)整到5.2。7）發(fā)酵：分別加入酵母菌和乳酸菌200.0 mg/L和60.0 mg/L，發(fā)酵溫度22 ℃，發(fā)酵時(shí)間28 d，發(fā)酵前1 周進(jìn)行適合搖晃，1 周后保持無(wú)氧發(fā)酵。8）過(guò)濾：發(fā)酵后的乳清酒含有殘?jiān)⒊恋砦铮皇褂? 層紗布過(guò)濾，將發(fā)酵殘?jiān)?、沉淀物分離除去。9）取樣：取發(fā)酵第0、7、14、21、28天的樣品保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 樣品準(zhǔn)備

取5 mL樣品加入20 mL頂空瓶中，加蓋密封。

1.3.2.2 固相微萃取條件

萃取纖維：50/30 μm DVB；萃取溫度50 ℃；振蕩15 min、萃取30 min；振蕩速率250 r/min；解吸時(shí)間5 min；GC循環(huán)時(shí)間50 min。

1.3.2.3 GC-MS條件

色譜柱：DB-wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣溫度260 ℃；載氣為氦氣（99.999%）；流量1 mL/min；柱溫：40 ℃保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，20 ℃/min升至250 ℃，保持2.5 min；接口溫度260 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離方式為電子電離源，70 eV；掃描方式為全掃描；質(zhì)量范圍20～400 u。

1.3.2.4 氣味活性值（odor activity value，OAV）計(jì)算

OAV為組分在樣品中含量與該組分氣味閾值之比。

1.3.3 細(xì)菌多樣性解析

1.3.3.1 樣品總DNA提取

參照E.Z.N.A.?Soil DNA kit試劑盒中的方法對(duì)乳清酒樣品中宏基因組的總DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增及MiSeq高通量測(cè)序

細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)：上游引物：338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，最后在4 ℃進(jìn)行保存。使用引物338F和806R對(duì)細(xì)菌V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

基因功能預(yù)測(cè)：使用PICRUSt軟件對(duì)乳清酒樣品中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[5]。直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）功能注釋：參照蛋白質(zhì)COG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行[6]。京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋：運(yùn)用FMAP軟件進(jìn)行KEGG注釋和差異Module分析。采用IBM SPSS Statistics 26和R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Origin 2021和美吉云平臺(tái)進(jìn)行作圖。風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性分析通過(guò)計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳清酒香氣成分分析

2.1.1 乳清酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化

由圖1可以看出，在不同發(fā)酵時(shí)間，乳清酒物質(zhì)種類較豐富；同時(shí)離子相對(duì)強(qiáng)度也不同，說(shuō)明在發(fā)酵期間乳清酒各揮發(fā)性物質(zhì)的含量不同。由圖2可知，在發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到酯類、醛酮類、烷烴類、醇類、其他類5大類物質(zhì)。其中酯類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中種類最多，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)共檢測(cè)到41 種風(fēng)味物質(zhì)，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)檢測(cè)到55 種風(fēng)味物質(zhì)，說(shuō)明乳清酒發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量整體增加，酒體變得豐富，香氣逐漸濃郁。

圖1 乳清酒發(fā)酵期間總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of whey wine with different fermentation periods

圖2 乳清酒發(fā)酵期間各類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量變化Fig.2 Variation in the types of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

2.1.2 乳清酒香氣化合物的定量分析

乳清酒的主要香氣來(lái)源于原料本身和微生物發(fā)酵[7]。這些揮發(fā)性化合物通過(guò)富集作用使乳清酒香氣濃郁[7]。乳清酒發(fā)酵期間共檢測(cè)出102 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)38 種，醛酮類物質(zhì)24 種，醇類物質(zhì)10 種，烷烴類物質(zhì)10 種，酸類物質(zhì)7 種，其他類物質(zhì)13 種。圖3為含量前30的風(fēng)味物質(zhì)的變化圖。在發(fā)酵期間，各類物質(zhì)含量變化較明顯。總體呈先增加后減少的趨勢(shì)，這與裴鵬正等[7]研究的軟兒梨果酒結(jié)果一致。

圖3 乳清酒發(fā)酵期間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化Fig.3 Changes in contents of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

酯類物質(zhì)是乳清酒的主要香氣物質(zhì)，酯類的形成受醪液理化組成及發(fā)酵條件的影響，乙醇發(fā)酵階段，在酯酶催化作用下?；鵆oA與乙醇合成脂肪酸乙酯，乙酰CoA和高級(jí)醇合成乙酸酯[8]。發(fā)酵酒酯類物質(zhì)的種類隨發(fā)酵的進(jìn)行明顯增多，發(fā)酵結(jié)束時(shí)檢測(cè)出26 種酯類物質(zhì)。多數(shù)酯類在發(fā)酵過(guò)程中呈先增加后降低的趨勢(shì)，是由于發(fā)酵前期發(fā)酵液中醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，使得乳清酒中酯類物質(zhì)增加；發(fā)酵后期含量降低可能是微生物將其分解或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)[9]。大多數(shù)酯類具有怡人的花香味，如苯甲酸乙酯帶有濃郁的花香味，癸酸乙酯帶有葡萄似水果香味[10]。其中乙酸異戊酯、乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯在發(fā)酵過(guò)程中一直存在，主要賦予發(fā)酵酒果香味。

醛酮類物質(zhì)能與醇類物質(zhì)相互反應(yīng)，產(chǎn)生怡人、和諧的香氣。乳清酒發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)出14 種醛類物質(zhì)，10 種酮類物質(zhì)。其中包括構(gòu)成發(fā)酵酒原料之一紅棗的主要香氣成分己醛[11]，主要呈青草氣及蘋(píng)果香氣。同時(shí)乙醛的形成可能是發(fā)酵液中木質(zhì)素降解產(chǎn)生[12]，賦予酒體果香和干果味。

醇類化合物是組成乳清酒香氣成分的重要物質(zhì)，少量高級(jí)醇可使酒體的香氣更加飽滿。發(fā)酵過(guò)程中苯乙醇含量（2369.61 mg/kg）最多，具有清香的玫瑰花香。異戊醇是高級(jí)醇的主要成分，主要呈辛辣味[13]，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳清酒中異戊醇逐漸消失，說(shuō)明酒體柔和，更易被大眾接受。

酸類物質(zhì)是風(fēng)味形成的主要物質(zhì)，同時(shí)也是酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)，具有平衡口感的作用。乳清酒發(fā)酵過(guò)程中乙酸、辛酸和癸酸呈增加趨勢(shì)，乙酸是發(fā)酵制品中重要的風(fēng)味物質(zhì)，使得酒體口感酸而不澀。有報(bào)道稱辛酸和癸酸對(duì)奶香味貢獻(xiàn)較大[14]，是乳清酒的獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)。同時(shí)辛酸還能促進(jìn)胃排空，緩解消化不良[15]。其他酸類物質(zhì)在發(fā)酵后期減少可能與酯化反應(yīng)有關(guān)。2,4-二叔丁基酚、4-乙基苯酚和苯乙烯是發(fā)酵酒的主要芳香化合物，主要呈水果香和花香，香味突出，這是酒體優(yōu)雅、醇厚等風(fēng)味形成的關(guān)鍵[16]。

2.1.3 乳清酒風(fēng)味物質(zhì)的OAV分析

對(duì)揮發(fā)性化合物定性定量分析后，根據(jù)的氣味閾值[17]計(jì)算各類物質(zhì)的OAV。通常認(rèn)為OAV≥1的化合物為香氣貢獻(xiàn)成分，OAV≥10的化合物為重要香氣成分。上述103 種揮發(fā)性化合物中有43 種化合物OAV大于1，見(jiàn)表1。在發(fā)酵第7天時(shí)，香氣物質(zhì)開(kāi)始顯著增加，其中OAV≥10的有苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、十一酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯丙酸乙酯、癸酸異戊酯、壬醛、2-十一酮、辛酸、苯乙醇、4-乙基苯酚構(gòu)成了乳清發(fā)酵酒的重要香氣成分。這與任曉宇等[18]在紅棗白蘭地香氣分析中的結(jié)果相似，苯甲酸乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、苯丙酸乙酯等乙酯類化合物具有較高的OAV，它們共同賦予酒體水果香味。發(fā)酵后期增加了癸酸乙酯、己酸乙酯、2-壬酮為主要香氣成分，分別賦予乳清酒青蘋(píng)果和草莓的果香味。

表1 乳清酒發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV變化Table 1 Changes in OAV of volatile flavor substances in whey wine during fermentation

2.2 乳清酒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 乳清酒細(xì)菌α多樣性分析

通過(guò)細(xì)菌16S rRNA序列測(cè)序從15 個(gè)樣本中共獲得226550 條有效序列，所有樣本細(xì)菌序列歸屬于24 個(gè)門(mén)，52 個(gè)綱，105 個(gè)目，151 個(gè)科，212 個(gè)屬，262 個(gè)種，293 個(gè)可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。樣本覆蓋率均大于0.90，表明所選樣本有效序列的測(cè)序深度較高，可以反映整個(gè)微生物群落的真實(shí)情況（表2）。對(duì)于群落的物種多樣性來(lái)說(shuō)，乳清酒的Shannon指數(shù)從第7天時(shí)開(kāi)始降低，到28 d增加，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程乙醇含量開(kāi)始增加，具有低氧、低pH值以及高乙醇的不利條件，使得許多不耐乙醇和酸的微生物隨之消亡[19]，導(dǎo)致多樣性降低。發(fā)酵酒發(fā)酵前7 d的細(xì)菌Chao1指數(shù)較小，隨后大幅度上升，這表明乳清酒在發(fā)酵初期微生物群落豐富度最低，經(jīng)過(guò)發(fā)酵作用后菌群豐富度上升。

表2 乳清酒酒樣細(xì)菌α多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 α-Diversity indexes of bacteria in whey wine

由圖4可知，乳清酒發(fā)酵過(guò)程共有的OTU為21 個(gè)。在發(fā)酵前，樣品中特有的OTU數(shù)為7 個(gè)，發(fā)酵7 d，OTU數(shù)快速下降，發(fā)酵后期樣品在環(huán)境中獲得了大量的菌體，發(fā)酵21 d，特有OTU數(shù)快速增加為68 個(gè)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，特有OTU增加為87 個(gè)。再將每個(gè)OTU與細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到每個(gè)OTU的物種注釋，共注釋得到3 個(gè)門(mén)、12 個(gè)屬的細(xì)菌。

圖4 乳清酒酒樣細(xì)菌OTU的統(tǒng)計(jì)和比較Fig.4 Venn diagram of unique and shared bacterial OTUs in whey wine with different fermentation periods

2.2.2 基于門(mén)水平乳清酒發(fā)酵過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)分析

由圖5所示，在門(mén)水平，乳清酒細(xì)菌群落由厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）和其他（others）構(gòu)成。發(fā)酵開(kāi)始存在Proteobacteria與Cyanobacteria，可能來(lái)源于發(fā)酵酒的原料和環(huán)境。Firmicutes和Proteobacteria在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，但二者呈相反的變化趨勢(shì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，F(xiàn)irmicutes相對(duì)豐度雖然有所浮動(dòng)，但在整個(gè)發(fā)酵期間的含量仍為最高。Proteobacteria在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)達(dá)到峰值22.41%，在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的平均相對(duì)含量為2.43%。這可能因?yàn)镻roteobacteria的部分好氧菌在低氧、酸性和高醇的環(huán)境中難以生存[20]。而Firmicutes的乳酸菌可以適應(yīng)這種環(huán)境，這也說(shuō)明Firmicutes在乳清酒發(fā)酵中發(fā)揮了重要作用，與Sun Zhihong等[21]報(bào)道結(jié)果一致。

圖5 基于門(mén)水平的乳清酒酒樣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Bacterial community structure in whey wine samples at the phylum level

2.2.3 基于屬水平乳清酒發(fā)酵過(guò)程中群落結(jié)構(gòu)分析

由圖6可知，在屬水平上，乳清酒發(fā)酵過(guò)程中共檢測(cè)到的相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌屬有7 個(gè)，分別是乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、拉烏爾菌屬（Raoultella）。發(fā)酵前期Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨著發(fā)酵的進(jìn)行Lactobacillus和Lactococcus成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌是存在于乳清酒發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌種，乳酸菌能將乳制品中可發(fā)酵糖類轉(zhuǎn)化為乳酸、水解酪蛋白、分解脂肪，進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵。乳酸菌產(chǎn)生的酶和代謝產(chǎn)物在發(fā)酵酒的酸度、口感、香氣和質(zhì)地中發(fā)揮著重要作用。研究學(xué)者認(rèn)為可以通過(guò)對(duì)乳酸菌的基因調(diào)控如丙酮酸脫羧酶、NADH氧化酶和α-乙酰乳酸脫羧酶等控制乳中風(fēng)味代謝物的產(chǎn)生[22]。同時(shí)，乳酸菌也是酸肉、香腸發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[23]。

圖6 基于屬水平的乳清酒酒樣的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Bacterial community structure in whey wine samples at the genus level

2.2.4 乳清酒細(xì)菌β多樣性分析

在16S rRNA基因序列分析中，基于Unifrac距離主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）被廣泛使用，在圖中的距離越近，說(shuō)明樣品間組成相似度越高。

PC1和PC2分別解釋了不同發(fā)酵時(shí)間乳清酒中細(xì)菌群落57.27%和28.57%的信息，累計(jì)解釋了85.84%的信息。由圖7可知，發(fā)酵0 h，樣本主要集中在第3象限。發(fā)酵過(guò)程中的樣本呈較明顯的聚類。發(fā)酵7～14 h的樣本距離較近，聚集于第2象限。發(fā)酵21～28 h樣本主要集中在第4象限。

圖7 基于加權(quán)Unifrac距離的樣本細(xì)菌群落PCoA圖Fig.7 PCoA plot of bacterial communities based on weighted Unifrac distance

由圖8可知，乳清酒發(fā)酵期間樣本可聚為3 類，發(fā)酵0 d聚集為第1大類，發(fā)酵7～14 d聚集為第2大類，發(fā)酵21～28 d聚集為第3大類。結(jié)合PCoA可得到一致的結(jié)論，即乳清酒發(fā)酵可分為：0 d（發(fā)酵初期）、7～14 d（發(fā)酵中期）、21～28 d（發(fā)酵后期）。

圖8 基于OTU水平樣板細(xì)菌群落層級(jí)聚類分析圖Fig.8 Hierarchical cluster analysis of bacterial community based on OTUs

2.2.5 細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

2.2.5.1 COG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析

由圖9可知，通過(guò)對(duì)乳清酒細(xì)菌菌群COG功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在乳清酒細(xì)菌菌群中共鑒定到20 個(gè)主要的功能大類，乳清酒中的微生物一部分豐度較高的基因參與到未知功能和已知功能這兩個(gè)COG分類中，其中相對(duì)含量在前8 位的功能大類為：碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，均值為1309157 個(gè)；常規(guī)功能預(yù)測(cè)，均值為1251161 個(gè)；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，均值為1203998 個(gè)；轉(zhuǎn)錄，均值為1120427 個(gè)；復(fù)制、重組與修復(fù)，均值為1071133個(gè)；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及合成，均值為1023398 個(gè)；細(xì)胞壁/膜/被膜的生物合成，均值為825269 個(gè)；無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，均值為741526 個(gè)，除微生物基本生命活動(dòng)外，代謝活動(dòng)主要以氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主。本研究與夏亞男[24]、Chen Chen[25]等采用宏基因組分析酒藥中微生物多樣性的結(jié)果一致，在酒藥所有活性代謝途徑中，碳水化合物代謝和氨基酸代謝最為活躍，而碳水化合物代謝和氨基酸代謝這兩類代謝通路與風(fēng)味物質(zhì)形成密切相關(guān)。

圖9 細(xì)菌基因COG功能分類Fig.9 COG functional classification of bacterial genes

2.2.5.2 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析

通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比可知（表3），共注釋到6 類一級(jí)代謝通路，在二級(jí)代謝通路中共注釋到42 個(gè)子功能組成，表3為代謝通路豐度值前22 位的結(jié)果。

表3 乳清酒酒樣細(xì)菌α多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 3 α-Diversity indexes of bacteria in whey wine

富集差異表達(dá)基因最多的8 個(gè)KEGG通路包括膜運(yùn)輸（2171276）、碳水化合物代謝（1856934）、氨基酸代謝（1444883）、復(fù)制和修復(fù)（1367350）、翻譯（924207）、特征差（862876）、能量代謝（742465）、核苷酸代謝（742042）。其中，碳水化合物代謝及氨基酸代謝是最主要的兩類代謝活動(dòng)，與COG功能注釋結(jié)果一致。具體地，碳水化合物代謝主要包括三羧酸循環(huán)、糖酵解和磷酸戊糖途徑等，可產(chǎn)生大量的乙酸、檸檬酸等風(fēng)味中間代謝產(chǎn)物[26]。氨基酸可以在酶的作用下產(chǎn)生風(fēng)味成分[27]，由此推測(cè)，乳清酒的主要風(fēng)味物質(zhì)來(lái)源于碳水化合物代謝和氨基酸代謝途徑。

2.3 細(xì)菌與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

由圖10可知，大多數(shù)的風(fēng)味物質(zhì)與Lactococcus和Raoultella呈正相關(guān)，其中Lactococcus和Raoultella與乙酸苯乙酯（A4）、癸酸乙酯（A8）、己酸乙酯（A17）、乙酸乙酯（A20）呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明Lactococcus和Raoultella與這些物質(zhì)的合成有關(guān)。Lactobacillus與檸檬醛（B11）、辛酸（E5）、癸酸（E7）、4-乙基苯酚（F8）、庚酸乙酯（A6）、癸酸甲酯（A9）、油酸乙酯（A11）、水楊酸甲酯（A13）、壬酸乙酯（A16）、十一酸乙酯（A22）、辛酸異戊酯（A25）和癸酸異戊酯（A29）呈正相關(guān)。Meng Yuecheng等[28]研究牛乳發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與核心微生物關(guān)聯(lián)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌與酸類、酯類物質(zhì)之間呈正相關(guān)。

圖10 乳清酒細(xì)菌與風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性Fig.10 Correlation between bacteria and flavor substances in whey wine

Streptococcus與酯類等風(fēng)味化合物呈負(fù)相關(guān)可能與糖苷酶水解風(fēng)味物質(zhì)引起的變化有關(guān)[29]。Acinetobacter在酸馬奶的發(fā)酵中也與大多數(shù)物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)[10]，與物質(zhì)之間的分解作用有關(guān)。Leuconostoc可進(jìn)行乳酸菌異型發(fā)酵產(chǎn)酸，營(yíng)造酸性環(huán)境[30]，與酸類和酯類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。Klebsiella可產(chǎn)生脂肪酶，賦予發(fā)酵酒飽和柔軟的香氣[31]。

3 結(jié)論

通過(guò)采用高通量測(cè)序技術(shù)和PICRUSt軟件分析乳清酒的細(xì)菌多樣性及對(duì)細(xì)菌類群的基因功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)，采用GC-MS分析了乳清發(fā)酵酒中重要香氣成分的變化規(guī)律，并對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析。研究表明乳清酒發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量整體增加，共檢測(cè)出102 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乙酸乙酯、十一酸乙酯、棕櫚酸乙酯、苯丙酸乙酯、癸酸異戊酯、壬醛、2-十一酮、辛酸、苯乙醇、4-乙基苯酚構(gòu)成了乳清酒的重要香氣成分。乳清酒發(fā)酵初期Lactobacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群，隨著發(fā)酵的進(jìn)行Lactobacillus和Lactococcus成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。細(xì)菌功能預(yù)測(cè)表明，乳清酒代謝活動(dòng)主要以氨基酸代謝和碳水化合物代謝為主。通過(guò)對(duì)二者的關(guān)聯(lián)性分析得出：大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)與Lactococcus和Raoultella呈正相關(guān)，其中Lactococcus和Raoultella與乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯呈顯著正相關(guān)。Lactobacillus與檸檬醛、辛酸、癸酸、4-乙基苯酚、庚酸乙酯、癸酸甲酯、油酸乙酯等呈正相關(guān)。因此，構(gòu)建良好的細(xì)菌群落有利于提升釀造乳清酒的品質(zhì)。