李愛君，王 迪，陽 剛，宋 軍，孔祥兵，廖勝藍，闞建全,

（1.西南大學食品科學學院，農業(yè)農村部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，中匈食品科學合作研究中心，川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶 400715；2.重慶市永川區(qū)君意食品廠，重慶 402160）

豆豉是一種以大豆為原料，經微生物發(fā)酵而制成的食品。根據發(fā)酵時采用的微生物類型，豆豉可分為4 類：曲霉型（如瀏陽豆豉）、毛霉型（如永川豆豉）、根霉型（如印尼丹貝）和細菌型（如日本納豆）[1]。其中細菌型豆豉利用芽孢桿菌具有高蛋白酶活力的特點進行發(fā)酵，提高其多肽、總酚及總黃酮含量[2]，增強其抗氧化、清除血栓[3]和抗疲勞[4]的能力，并具有鮮、咸、酸、辣、略有回甘的豐富滋味。

大豆經過浸泡、蒸煮以及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）制曲這幾種工序后（此時的細菌型豆豉與日本納豆類似），可直接食用，但為了使其滋味更加豐富，通常向其中加入花椒、辣椒、生姜及食鹽水進行保溫后發(fā)酵，故后發(fā)酵階段是細菌型豆豉風味和滋味形成的重要階段[5]。影響豆豉營養(yǎng)成分和感官特性的因素有很多，其中，大豆品種和后發(fā)酵溫度的選擇尤為重要。有研究表明不同大豆的氨基酸、有機酸和生育酚等代謝物含量、脂肪酸組成以及抗氧化活性均存在顯著差異[6-7]。同時，為了縮短生產周期，滿足市場需求，工業(yè)發(fā)酵豆豉往往選擇保溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度的選擇可以改變豆豉揮發(fā)性物質強度和發(fā)酵菌群的真菌多樣性[8-9]。氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素，其含量可以影響豆豉品質從而判斷豆豉的發(fā)酵程度[10]，在許多行業(yè)標準中作為評價豆豉產品質量是否合格的一個重要理化指標。發(fā)酵過程中，細菌型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量會不斷增大至最大值，之后增長速率減小并略有下降趨勢[11]。發(fā)酵終點的判定直接影響最終產品的品質，但在實際生產中，豆豉發(fā)酵終點的判定往往根據工人的個人經驗，這導致產品質量參差不齊。研究表明，動力學研究能較好地擬合食品加工過程中代謝物含量變化并建立模型，可為工業(yè)生產提供理論基礎[12-13]。

本研究利用修正后的Gompertz方程對4 種不同大豆品種發(fā)酵得到的細菌型豆豉在不同后發(fā)酵溫度下的氨基酸態(tài)氮含量進行擬合，采用多項式擬合預測其發(fā)酵終點；測定其發(fā)酵過程中水分、pH值、總酸的變化，利用相關性分析探究不同大豆品種之間品質指標的相關性；測定發(fā)酵終點時其游離氨基酸含量，探究大豆品種和溫度對豆豉滋味的影響。本研究可為細菌型豆豉生產提供一定理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種常見市售大豆：渝豆6號（LS）（重慶本地大豆）重慶市永輝超市；東生7號（DBL）（東北大粒大豆）、青仁烏（BS）（黑豆） 黑龍江省大興安嶺市當地超市；東生1號（DBS）（東北小粒大豆） 黑龍江省哈爾濱市當地超市；食鹽、生姜、辣椒 重慶市永輝超市；枯草芽孢桿菌 上海賀普實業(yè)有限公司。

18 種氨基酸標準品（純度≥98%）：天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、蘇氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、胱氨酸（Cys-Cys）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、蛋氨酸（Met） 美國Sigma-Aldrich公司；NaOH標準溶液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醛溶液、2,4-二硝基氟苯、乙腈（均為色譜級） 四川省成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；FS-2可調高速勻漿機 江蘇金壇科析儀器有限公司；LHS-150CLY恒溫恒濕箱 上海齊欣科學儀器有限公司；RCT Basic Package磁力攪拌器 德國IKA公司；PB-10 pH計德國賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌型豆豉的制備

大豆篩選→浸泡（25 ℃，12 h）→瀝干→蒸煮（常壓蒸煮，2 h）→冷卻→接種（以蒸煮后大豆質量計，0.05%枯草芽孢桿菌，m/m）→制曲（37 ℃、相對濕度85%，33 h）→拌料（以制曲后的曲料質量計，8%食鹽、5%辣椒、10%生姜、50%無菌水，m/m）→后發(fā)酵（15、25、40 ℃）→成品豆豉

將拌料步驟中混合均勻的曲料分裝在無菌密封袋中。細菌型豆豉的工業(yè)生產中，通常會在20～25 ℃間的某一溫度下進行保溫后發(fā)酵，最低不低于15 ℃，最高不高于40 ℃，故選擇將密封袋分別放入15、25 ℃及40 ℃的恒溫箱中進行后發(fā)酵，定時取樣并進行相關理化指標的測定。

1.3.2 水分含量的測定

按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》的直接干燥法[14]進行測定。

1.3.3 pH值的測定

參考劉敏等[15]的方法。取5 g研磨至無明顯顆粒的樣品到50 mL離心管中，加入40 mL純水，用勻漿機破碎混勻。7500 r/min離心10 min，將上清液移至50 mL容量瓶并定容，用校正后的pH計進行測定。

1.3.4 總酸含量的測定

取5 g研磨至無明顯顆粒的樣品到100 mL離心管中，加入50 mL純水并用勻漿機分散均勻，移至100 mL容量瓶并定容。過濾后取20 mL濾液，按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》的酸堿滴定法[16]進行測定，結果以乳酸計。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮的測定

按照1.3.4節(jié)的步驟處理樣品，按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的酸度計法[17]進行測定。

1.3.6 游離氨基酸的測定

參考王迪等[18]的方法處理樣品，參照趙英蓮等[19]的方法進行游離氨基酸的柱前衍生，設置高效液相色譜條件。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮的生成動力學模型

使用修正后Gompertz方程擬合4 種細菌型豆豉在3 種后發(fā)酵溫度下的氨基酸態(tài)氮含量，修正后Gompertz方程如下式所示：

式中：P t為后發(fā)酵td 的氨基酸態(tài)氮含量/（g/100 g）；Pm為氨基酸態(tài)氮的最大值/（g/100 g）；tz為滯后時間/d；km為生成速率/（g/h）；e為自然對數的底數（2.718）；t為后發(fā)酵時間/d。

1.3.8 Arrhenius模型分析

使用Arrhenius 方程擬合氨基酸態(tài)氮生成速率（km/（g/h））與后發(fā)酵溫度（T/K）的關系，方程如下式所示：

式中：A0為指前因子/（m2/s）；Ea為活化能/（J/mol）；R為氣體常數（8.314 J/（mol·K））。

1.4 數據處理

使用Minitab 182018、Origin 2018b軟件繪圖，使用Microsoft Excel 2019軟件進行多項式擬合分析，使用IBM SPSS 25軟件進行差異顯著性分析和線性回歸分析，每個變量的樣本間差異采用方差分析和Duncan法確定，使用判定系數（R2）對數學模型進行評估，殘差平方和（sum of squared errors，SSE）表示Gompertz方程預測的準確度。

2 結果與分析

2.1 不同細菌型豆豉的氨基酸態(tài)氮生成動力學差異

如圖1所示，4 種細菌型豆豉在3 種后發(fā)酵溫度下的氨基酸態(tài)氮含量變化均隨后發(fā)酵的進行呈先上升再略有下降的趨勢，其生成速率隨后發(fā)酵的進行逐漸降低，這與Liu Xiaoyan[20]和趙欣[21]等的研究結果一致。氨基酸態(tài)氮的生成與制曲階段微生物代謝積累的蛋白酶密切相關，蛋白酶將大豆蛋白降解為氨基酸、多肽等小分子物質，使后發(fā)酵階段前期氨基酸態(tài)氮含量迅速增加[22]。但隨著后發(fā)酵的進行，蛋白酶不斷被枯草芽孢桿菌和可能存在的乳酸菌、腸桿菌等細菌消耗[23]，生成速率開始降低，導致后發(fā)酵階段后期，氨基酸態(tài)氮的生成速率低于消耗速率，出現下降趨勢。

圖1 不同細菌型豆豉在不同溫度下的氨基酸態(tài)氮含量實測值與預測值Fig.1 Measured and predicted values of amino nitrogen content in different bacterial-type douchi at different post-fermentation temperatures

由表1可知，R2均大于0.96，說明Gompertz方程可以很好擬合不同溫度下后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的生成動力學。4 種細菌型豆豉在15 ℃后發(fā)酵溫度下的Pm值為DBL＞LS＞DBS＞BS，在25 ℃和40 ℃后發(fā)酵溫度下的Pm為LS＞DBL＞DBS＞BS；3 種黃豆型豆豉（LS、DBL和DBS）在15 ℃和25 ℃的Pm沒有顯著差異（P＞0.05），在40 ℃下，LS與DBS的Pm存在顯著差異（P＜0.05）；黑豆型豆豉（BS）在各溫度下的Pm均顯著低于其他3 種黃豆型豆豉（P＜0.05）。根據細菌型豆豉的行業(yè)標準，氨基酸態(tài)氮含量需超過0.3 g/100 g，3 種黃豆型豆豉均符合標準，而黑豆型豆豉并未達到該標準（圖1）。由于不同大豆的營養(yǎng)成分不同，枯草芽孢桿菌對其利用程度不同。由表2可知，黑豆型豆豉的中性蛋白酶活力低于黃豆型豆豉，這使得黑豆型豆豉的氨基酸態(tài)氮含量較低，與程甲[24]的研究結果一致。另外，從宋軍霞[25]的研究結果可知，黑豆型豆豉的活菌數遠低于黃豆型豆豉，且黏液稀薄，這說明黑豆作為發(fā)酵原料，并不利于枯草芽孢桿菌的生長。此外，枯草芽孢桿菌是一個適合在37 ℃生長的菌株，溫度的升高促進了芽孢桿菌的生長，蛋白酶生成速度增加，使得4 種豆豉呈現一致的趨勢：Pm和km均隨著溫度的升高而增加（表1）。在課題組先前的研究[18]中得知Pm與后發(fā)酵溫度T的關系可以用Arrhenius方程進行描述，本研究使用線性回歸描述Pm和T的關系。如表3所示，在15～40 ℃范圍內，Pm與T有良好的線性關系，km與T的關系符合Arrhenius方程。

表1 Gompertz方程系數及擬合優(yōu)度Table 1 Coefficients and goodness of fit of Gompertz equation

表2 4 種不同品種大豆原料和制曲后的基本指標（均為干基）Table 2 Basic indexes of four different soybean varieties and douchi koji made from them (on a dry matter basis)

表3 Pm和T的線性回歸方程以及km和T的Arrhenius方程擬合Table 3 Linear regression equation of Pm versus T and Arrhenius equation of km versus T

為了精確不同溫度下4 種細菌型豆豉后發(fā)酵過程的終點，使用多項式擬合后發(fā)酵中后期氨基酸態(tài)氮含量，推算出氨基酸態(tài)氮最高點對應的發(fā)酵時間。由表4可知，多項式可以很好地擬合后發(fā)酵中后期氨基酸態(tài)氮含量變化（R2≥0.91），4 種細菌型豆豉在25、15 ℃和40 ℃后發(fā)酵溫度下的預測發(fā)酵終點均分別為發(fā)酵9、10 d和4 d左右。由表5可知，細菌型豆豉的T和t呈負相關線性關系（R2≥0.90），即后發(fā)酵溫度越高，其發(fā)酵結束時間越短。

表4 細菌型豆豉后發(fā)酵中后期氨基酸態(tài)氮含量的多項式擬合Table 4 Polynomial fitting of amino nitrogen content in bacterialtype douchi at the mid-late stages of fermentation as a function of postfermentation temperature

表5 細菌型豆豉后發(fā)酵結束時間和溫度之間的關系Table 5 Relationship between the post-fermentation endpoint of bacterial-type douchi and temperature

2.2 不同細菌型豆豉的水分含量、pH值及總酸含量的變化

如圖2～4所示，4 種細菌型豆豉在不同后發(fā)酵溫度下的水分含量、pH值及總酸含量呈現出相似的變化趨勢：3 種溫度下細菌型豆豉的水分含量整體呈先上升后逐漸平穩(wěn)的趨勢，且無明顯差異（圖2），這與Tan Yue等[26]的研究結果一致。前期水分上升是由后發(fā)酵過程中加入無菌水引起，隨后發(fā)酵的進行豆豉吸收足夠水分后水分含量無明顯的波動。3 種溫度下細菌型豆豉的總酸含量整體隨后發(fā)酵的進行而不斷上升然后趨于穩(wěn)定，導致pH值整體隨后發(fā)酵的進行而不斷降低（圖3、4），在劉敏等[15]的研究中得到相同的結果。pH值的下降和總酸含量的上升是因為在后發(fā)酵期間乳酸菌等微生物[23]分泌出相關酶分解大豆中的大分子物質，從而導致有機酸、氨基酸、脂肪酸等酸性物質增加[27]；隨著酸度不斷上升，相關水解酶的活力被抑制，導致總酸含量趨于平緩[28]。同時，總酸含量隨著發(fā)酵溫度的升高而增加（圖4），這可能是因為在本實驗的溫度范圍內，溫度升高促進了芽孢桿菌和乳酸菌的生長繁殖，生成相關酸性物質的酶活力上升，從而導致總酸含量增加。此外，4 種細菌型豆豉中，BS型豆豉的pH值整體較低，這會使分解酶受到抑制、微生物多樣性減少[29]，可能導致有機酸類物質生成減少、總酸含量整體較低。

圖2 不同細菌型豆豉的水分含量變化Fig.2 Changes in moisture content of different bacterial-type douchi during post-fermentation at different temperatures

圖3 不同細菌型豆豉的pH值變化Fig.3 pH changes of four bacterial-type douchi during postfermentation at different temperatures

圖4 不同細菌型豆豉的總酸含量變化Fig.4 Changes in total acidity of four bacterial-type douchi during post-fermentation at different temperatures

2.3 不同細菌型豆豉的游離氨基酸含量變化差異

測定4 種細菌型豆豉發(fā)酵前及發(fā)酵終點時（15、25 ℃發(fā)酵10 d及40 ℃發(fā)酵4 d）的游離氨基酸含量。如表6所示，4 種細菌型豆豉均檢測出17 種游離氨基酸，其中均主要以Glu、Arg和Leu為主，這與索化夷等[30]的研究結果一致。對比4 種細菌型豆豉發(fā)酵前后總游離氨基酸的含量，觀察到一致的趨勢：3 種溫度下發(fā)酵后的豆豉游離氨基酸總含量均高于發(fā)酵前，后發(fā)酵溫度越高，其游離氨基酸總含量越高，這可能是因為本研究后發(fā)酵溫度范圍內，溫度越高，蛋白酶活力越強。相對于發(fā)酵前的游離氨基酸總含量，40 ℃下4 種細菌型豆豉（LS、DBL、DBS、BS）分別增加了1.63、2.90、1.67、2.02 倍。其中，細菌型豆豉中如Lys、Ala等部分氨基酸含量在發(fā)酵溫度上升時，呈現略有下降的趨勢，這可能是由于該溫度下芽孢桿菌和乳酸菌等微生物的繁殖被促進，從而加快風味物質生成和美拉德反應對氨基酸的消耗，使氨基酸含量下降[31-32]。

表6 不同細菌型豆豉不同溫度下發(fā)酵前后游離氨基酸含量Table 6 Contents of free amino acid before and after post-fermentation of different bacterial-type douchi at different temperatures

對比3 種黃豆（LS、DBL、DBS）和黑豆（BS）在不同后發(fā)酵溫度下的游離氨基酸總含量，發(fā)現同一溫度下3 種黃豆的游離氨基酸總含量均明顯高于黑豆，這與氨基酸態(tài)氮含量結果一致。通過對比發(fā)酵前后4 種細菌型豆豉的必需氨基酸總含量變化，發(fā)現4 種細菌型豆豉除DBL在15 ℃發(fā)酵后的必需氨基酸總含量相比于發(fā)酵前略有下降以外，其余均高于發(fā)酵前的必需氨基酸總含量，且隨著后發(fā)酵溫度升高，必需氨基酸總含量也隨之升高。

按照Merlo等[33]的研究將游離氨基酸分為鮮味（Asp、Glu）、甜味（絲氨酸、Gly、Thr、Ala）、苦味（Arg、Met、Val、Leu、Ile、His、Phe、Tyr）、無味（Pro、Cys、Lys）4 類呈味氨基酸。由表7可知，4 種細菌型豆豉呈現一致的趨勢：發(fā)酵后，苦味氨基酸比例降低，而鮮味氨基酸比例升高，這與Han等[34]的研究結果一致。但相比于15 ℃后發(fā)酵溫度，后發(fā)酵溫度為40 ℃時所得的4 種細菌型豆豉均出現鮮味氨基酸比例降低，而苦味氨基酸比例增加。發(fā)酵過程中，氨基酸在蛋白酶作用下不斷生成，但其同時作為風味物質的前體和美拉德反應的反應物也被消耗[35]，從韓佳冬[36]的研究可知，美拉德反應主要是對鮮味氨基酸的消耗。因此，推測在本研究溫度范圍內，溫度的升高促進了美拉德反應對鮮味氨基酸的消耗，使鮮味氨基酸比例降低，苦味氨基酸比例上升。

表7 不同溫度下不同細菌型豆豉發(fā)酵前后呈味氨基酸在總氨基酸中的占比Table 7 Ratio of flavor to total amino acids before and after post-fermentation of different bacterial-type douchi at different temperatures

mg/g

2.4 不同細菌型豆豉各理化指標的相關性分析

對4 種細菌型豆豉在不同溫度下后發(fā)酵過程中的水分含量、pH值、總酸及氨基酸態(tài)氮含量進行相關性分析。

由圖5可知，4 種細菌型豆豉中各指標間的相關性呈相似的趨勢：4 種細菌型豆豉中發(fā)酵溫度與總酸含量均呈極顯著正相關（P＜0.01），這可能是因為本研究溫度范圍內，溫度升高不僅促進了枯草芽孢桿菌和乳酸菌等微生物的生長代謝，同時，生成有機酸、脂肪酸及氨基酸等酸性物質的酶活性升高。除BS中水分含量與總酸含量為顯著正相關（P＜0.05）外，其余3 種細菌型豆豉均呈極顯著正相關（P＜0.01）。LS和DBS中水分含量與氨基酸態(tài)氮含量呈顯著正相關（P＜0.05），而DBL和BS中呈極顯著正相關（P＜0.01）。LS和DBL中pH值與總酸含量呈顯著負相關（P＜0.05），在DBS和BS中呈極顯著負相關（P＜0.01）。LS和BS中pH值與氨基酸態(tài)氮含量呈顯著負相關（P＜0.05），在DBL和DBS中呈極顯著負相關（P＜0.01）。這可能是因為后發(fā)酵過程中，水分含量逐漸增加至飽和，pH值不斷降低，總酸和氨基酸態(tài)氮含量不斷上升。此外，4 種細菌型豆豉中總酸含量與氨基酸態(tài)氮含量均呈極顯著正相關（P＜0.01），總酸和氨基酸態(tài)氮的生成均與豆豉中微生物的代謝密切相關，發(fā)酵過程中，微生物生長旺盛時，產酸和分解蛋白質能力強，總酸和氨基酸態(tài)氮含量隨之增加，而總酸升高到一定值時反而會抑制微生物的生長以及蛋白酶活力，使氨基酸態(tài)氮生成速度下降，總酸和氨基酸態(tài)氮含量趨于平緩。

圖5 不同指標間的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between different physicochemical indicators

3 結論

采用修正后Gompertz方程很好地擬合了4 種細菌型豆豉（LS、DBL、DBS、BS）在3 個不同后發(fā)酵溫度下（15、25 ℃和40 ℃）的氨基酸態(tài)氮生成動力學（R2＞0.96），3 個不同溫度下（25、15 ℃和40 ℃）擬合的預測發(fā)酵終點分別為9、10 d和4 d左右。Pm和km均隨著溫度的升高而升高，且Pm與T呈線性關系，km與T的關系符合Arrhenius方程。此外，同一溫度下，3 種黃豆型豆豉LS、DBL、DBS的氨基酸態(tài)氮含量和游離氨基酸含量沒有明顯差異，但明顯高于黑豆型豆豉；根據豆豉的行業(yè)標準，其氨基酸態(tài)氮含量需超過0.3 g/100 g，而黑豆型豆豉并未達到該標準。從測定的游離氨基酸含量可知，發(fā)酵使細菌型豆豉的鮮味氨基酸比例上升，而苦味氨基酸比例下降；但相比于15 ℃后發(fā)酵溫度，后發(fā)酵溫度為40 ℃時所得的4 種細菌型豆豉均出現鮮味氨基酸比例降低，而苦味氨基酸比例增加，說明過高的后發(fā)酵溫度會增加豆豉的苦味。

本研究結果能準確描述不同溫度下4 種細菌型豆豉氨基酸態(tài)氮變化的動力學方程，明確了溫度和大豆品種對細菌型豆豉理化性質的影響，為細菌型豆豉的工業(yè)化生產提供一定理論支持，但還未對溫度和大豆品種對細菌型豆豉揮發(fā)性物質的影響進行探究。黃豆型和黑豆型豆豉在氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸含量上存在明顯差異，這與前人研究結果[24-25,37]一致，但其根本原因還未明確。因此，后續(xù)研究可以通過從大豆自身的種皮、結構、基因型方面的相同點和差異性探究其對發(fā)酵細菌型豆豉品質的影響。