冉雯雯,劉藝璇,孔維懋,喬倩倩,李廣起,王繼綱

甲狀腺濾泡癌(follicular thyroid carcinoma, FTC)是第二常見的甲狀腺惡性腫瘤,占所有甲狀腺癌的5%～15%,僅次于甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)。FTC的病理診斷依賴于對包膜和(或)血管侵犯的準(zhǔn)確評價。在病理學(xué)上,根據(jù)包膜及血管侵犯存在與否以及范圍,可將FTC分為微小浸潤性(僅有包膜侵犯)、包裹性血管浸潤性(血管侵犯伴或不伴包膜侵犯)和廣泛浸潤性三種類型,不同類型的FTC預(yù)后不同[1],不同觀察者對于包膜和血管侵犯評判的一致性較差[2]。此外,FTC與濾泡性腺瘤、具有乳頭樣核特征的非浸潤性甲狀腺濾泡性腫瘤(non-invasive follicular thyroid neoplasm with papillary like nuclear features, NIFTP)、浸潤性包裹性濾泡型PTC在形態(tài)學(xué)及基因表型上存在一定的重疊[3],這也給準(zhǔn)確診斷帶來了挑戰(zhàn)。一般認(rèn)為,FTC具有較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險,因此準(zhǔn)確診斷及鑒別診斷,尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)FTC中最常見的基因變異是RAS點突變,常見位點是NRAS和HRAS的61密碼子及KRAS的12/13密碼子,其次是PAX8::PPARG重排,但RAS突變與PAX8::PPARG重排通?；コ?。PI3K/PTEN/AKT通路分子的突變或拷貝數(shù)變異亦較常見,包括PIK3CA、PTEN等基因變異。其他少見的基因變異有DICER1、NF1、TERT啟動子等[1]。目前有關(guān)FTC的基因變異多來源于原發(fā)FTC的研究,對轉(zhuǎn)移性FTC的基因變異報道相對少見[4]。本文收集22例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的FTC,分析其臨床病理特征,并采用下一代測序(next generation sequencing, NGS)對其中12例轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行檢測,探討轉(zhuǎn)移性FTC的基因表型。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012～2021年青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科經(jīng)病理診斷為轉(zhuǎn)移性FTC(除外區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移),且具有完整病理資料,復(fù)習(xí)HE和免疫組化切片,最終共納入22例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性FTC。對2018年后的轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本進(jìn)一步行NGS基因檢測。通過查詢醫(yī)院信息管理系統(tǒng)獲得患者診療過程及結(jié)局。本研究經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 免疫組化免疫組化一抗CK19(EP72)、TTF-1(SPT24)、Galectin-3(UMAB157)、PAX8(EP298)、Ki-67(MIB1)等均購自北京中杉金橋公司,MC抗體(HBME-1)購自福州邁新公司,以上指標(biāo)免疫組化染色在Leica BOND免疫組化染色平臺進(jìn)行;BRAF V600E(VE1)為美國VENTANA公司產(chǎn)品,在Roche Benchmark ULTRA平臺上進(jìn)行免疫組化染色。

1.3 DNA/RNA提取及基因檢測采用基于雜交捕獲下一代測序技術(shù),對包括BRAF、KRAS、NRAS、HRAS、RET、EGFR、TP53、NTRK、ERBB2、PIK3CA在內(nèi)的523個基因進(jìn)行DNA測序,同時對523個基因中的ALK、RET、FGFR、MET、NTRK等55個基因進(jìn)行RNA測序。簡要過程如下:所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色確認(rèn)腫瘤細(xì)胞范圍,進(jìn)行富集,確保富集后的腫瘤細(xì)胞占比>20%;切取10～15張5 μm厚中性福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本蠟卷;利用硅膠膜吸附柱法核酸提取試劑(廈門艾德公司)和TruSight Oncology 500 Panel試劑盒(美國Ilumina公司,www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-oncology-500.html)分別行DNA和RNA提取及基因組測序文庫制備;最后在Illumina Nextseq550DX(美國Illumina公司)測序平臺上進(jìn)行雙端測序。

1.4 Sanger測序由于NGS測序試劑盒探針對TERT啟動子區(qū)的覆蓋度不夠,本實驗進(jìn)一步采用Sanger測序法對12例樣本的TERT啟動子突變情況進(jìn)行再次檢測。DNA提取方法同上。PCR擴(kuò)增體系采用TaKaRa LA Taq with GC Buffer(北京寶日醫(yī)生物公司)配制;TERT啟動子區(qū)擴(kuò)增及測序引物:5′-CACCCGTCCTGCCCCTTCACCTT-3′(正向),5′-TTCCACTTCCCCGTCCTGCCCAC-3′(反向);PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 1 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個循環(huán);72 ℃ 5 min(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ProFlex PCR儀)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI3500DX基因測序儀進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征22例轉(zhuǎn)移性FTC中,男性6例,女性16例;年齡19～80歲,其中3例≥70歲,5例60～69歲,8例50～59歲,4例30～49歲,1例35歲,1例18歲。7例既往無甲狀腺癌手術(shù)史,以轉(zhuǎn)移灶為首發(fā)癥狀就診,診斷后發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié),其中4例未行甲狀腺手術(shù),另3例診斷為FTC;14例既往有甲狀腺手術(shù)史,從手術(shù)到發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的時間間隔為3～12年,僅3例原發(fā)灶診斷為甲狀腺癌(1例為FTC,2例為甲狀腺癌),3例分別診斷為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、濾泡性腺瘤、腺瘤樣增生結(jié)節(jié),8例結(jié)果不詳(無法獲得確切病理信息);另外1例病史不詳(門診病例)。16例為骨轉(zhuǎn)移,10例為肺轉(zhuǎn)移,3例為腦轉(zhuǎn)移,1例轉(zhuǎn)移灶位于前上縱隔,1例位于腋窩軟組織。骨轉(zhuǎn)移部位包括椎體及附件(6例)、肋骨(5例)、骨盆(髂骨、坐骨或恥骨,5例)、顱骨(4例)、股骨(3例)、肩胛骨(2例),至少8例為多發(fā)性骨轉(zhuǎn)移(表1)。

表1 22例轉(zhuǎn)移性甲狀腺濾泡癌的臨床病理特征

2.2 影像學(xué)及病理學(xué)特征本組20例可獲得轉(zhuǎn)移灶放射學(xué)資料。骨轉(zhuǎn)移病灶好發(fā)于不規(guī)則骨,表現(xiàn)為溶骨性病灶,多數(shù)伴有軟組織腫塊,缺乏骨膜反應(yīng),部分病灶可見少許殘留的不完整的骨殼,腫瘤周邊可形成硬化的邊緣;肺轉(zhuǎn)移病灶為多發(fā),境界清楚(圖1～4)。組織病理學(xué)上表現(xiàn)為典型的濾泡性腫瘤,腫瘤由彌漫分布、分化良好、大小不等的濾泡結(jié)構(gòu)構(gòu)成,細(xì)胞核呈圓形或卵圓形,異型性不明顯,核分裂象罕見,缺乏PTC細(xì)胞核特征,均未觀察到腫瘤性壞死(圖1～4)。18例行TTF-1、PAX8染色均呈陽性;10例行CK19和HBME-1染色,其中8例陽性或弱陽性,2例為陰性;12例行Galectin-3染色,其中6例為陽性或弱陽性,6例為陰性;7例行Ki-67染色,陽性率1%～10%;8例行BRAF V600E染色均為陰性。

圖1 例1坐骨轉(zhuǎn)移性甲狀腺濾泡癌:A.骨質(zhì)破壞為溶骨性,可見不完整的硬化邊緣;B.坐骨穿刺活檢示腫瘤呈大小不等的分化良好的甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu),細(xì)胞輕度異型;C.坐骨轉(zhuǎn)移灶檢測出TERT啟動子突變(c. -146 C>T) 圖2 例2肺轉(zhuǎn)移性甲狀腺濾泡癌:A.病灶為多發(fā)性,大小不等,邊界相對清楚;B.肺轉(zhuǎn)移病灶表現(xiàn)為分化良好的甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu);C.肺轉(zhuǎn)移灶檢測出TERT啟動子突變(c. -112 C>T) 圖3 例8髂骨轉(zhuǎn)移病灶:A.腫瘤為多灶性,周圍可見少許骨殼殘留;B.髂骨轉(zhuǎn)移病灶穿刺活檢示腫瘤組織破壞骨小梁,反應(yīng)性骨小梁不明顯;C.髂骨轉(zhuǎn)移灶檢測出TERT啟動子突變(c. -124 C>T) 圖4 例9額葉轉(zhuǎn)移病灶:A.額葉占位(MR圖像T2加權(quán));B.額葉轉(zhuǎn)移灶的組織學(xué)形態(tài),表現(xiàn)為分化良好的甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu);C.腦轉(zhuǎn)移灶檢測出TERT啟動子突變(c. -124 C>T)

2.3 基因變異特點12例轉(zhuǎn)移性PTC同時行DNA及RNA測序檢測(圖5),最常見的基因變異為RAS基因,包括NRAS(6例)、HRAS(2例)和KRAS(1例)。NRAS突變位點為3號外顯子c.181C>A(例8)和c.182A>G(p.Q61R)(例1、3、4、7、9),HRAS和KRAS突變位點均為3號外顯子c.182A>G(p.Q61R)。3例檢測到KEL基因錯義突變,分別為c.1481A>T(p.E494V)(例3)、c.1334C>T(p.A445V)(例6)、c.127G>A(p.A43T)(例11)。3例BRCA1基因變異分別是c.2594del(p.K865Sfs*28)移碼突變(例9)、c.4075C>G(p.Q1359E)錯義突變(例11)及拷貝數(shù)擴(kuò)增(17:41197308-41276383)(例8),1例BRCA2錯義突變?yōu)閏.2519T>C(p.M840T)(例7)。2例ALK錯義突變?yōu)閏. 3251G>A(p.R1084H)(例5)和c.1246G>T(p.A416S)(例11),2例ROS1錯義突變分別為c.521C>A(p.A174E)(例6)和c.38A>G(p.N13S)(例10),1例BRAF錯義突變?yōu)閏.64G>A(p.D22N)(例1),但除ALK c.3251G>A外,其余突變位點并非位于激酶域,其臨床意義仍待進(jìn)一步研究。2例ERBB4錯義突變?yōu)閏.3662A>G(p.Y1221C)(例6)和c.965T>A(p.M322K)(例10)。2例檢測到ANKRD26剪切位點區(qū)域突變(均為c.1269+7T>A和c.1269+8_1269+12del)。1例檢測到NTRK3基因斷裂重排,其伙伴基因為ETV6(保留NTRK3激酶域結(jié)構(gòu))和ST3GAL1(未保留激酶域)。此外,1例檢測到PTEN移碼突變(c.322_345del,p.L108_D115del),1例檢測到TP53缺失突變(c.198_208del,p.M66Ifs*79)。

圖5 12例轉(zhuǎn)移性甲狀腺濾泡癌的測序結(jié)果(例1～12)

11例標(biāo)本行Sanger測序(例4為活檢標(biāo)本,再次切片未獲取到足夠質(zhì)量的DNA),結(jié)果表明,8例檢測到TERT啟動子突變(例1、2、3、8、9、10、11、12),其中1例為c.-112 C>T,6例為c.-124 C>T,1例為c.-146C>T(圖1～4),3例未檢測到突變(例5、6、7),突變發(fā)生率為72.7%(8/11)。

2.4 隨訪結(jié)果13例獲得隨訪,隨訪時間10個月～10年,其中9例出現(xiàn)新發(fā)或復(fù)發(fā)病灶,4例影像學(xué)未見明顯進(jìn)展。本組僅1例轉(zhuǎn)移灶得以完整切除(例5),其余均為姑息性手術(shù)或活檢,同時行131I同位素治療或局部放療,但大部分患者治療過程中出現(xiàn)病灶進(jìn)展或復(fù)發(fā)(表1)。

3 討論

FTC是第二常見的甲狀腺惡性腫瘤,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的重要因素;既往對轉(zhuǎn)移性FTC的分子病理學(xué)研究相對少見,且病例數(shù)相對較少。本研究收集了22例轉(zhuǎn)移性FTC,回顧性分析臨床及影像特征,同時篩選了一系列可能的驅(qū)動基因變異。

FTC的診斷和鑒別診斷一直是甲狀腺病理診斷的難點,對細(xì)胞核特征、包膜及脈管侵犯的正確識別是診斷的關(guān)鍵。在實踐工作中,多種類型的甲狀腺結(jié)節(jié)與FTC在形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)上存在相似性,如腺瘤樣增生結(jié)節(jié)、濾泡性腺瘤、惡性潛能未定的濾泡性腫瘤及高分化腫瘤、NIFTP、浸潤性包裹性濾泡型PTC等,這些腫瘤均可表現(xiàn)為濾泡樣生長方式及RAS樣基因表型[3,5]。本組14例既往有甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)史的病例中,僅3例原發(fā)灶診斷為甲狀腺癌(1例FTC),3例診斷為其他良性結(jié)節(jié),其余8例患者未得以準(zhǔn)確診斷。這些結(jié)果表明,FTC仍存在較高比例的漏診率和誤診率。既往研究表明,對于濾泡性腫瘤包膜侵犯的形態(tài)學(xué)判讀,不同病理學(xué)家的結(jié)果并不相同[6],對于FTC和其他形態(tài)學(xué)相似的腫瘤,不同觀察者之間的一致性較低[7-8]。此外,FTC的鑒別診斷也缺少特異性的免疫組化或分子指標(biāo),因此存在較高的漏診率。

發(fā)生骨轉(zhuǎn)移最常見的甲狀腺癌類型是PTC(47.7%),其次是FTC(39.5%);好發(fā)部位以肋骨、髂骨和胸椎居多,以溶骨性骨轉(zhuǎn)移為主[9],本組骨轉(zhuǎn)移病例也符合該特點,轉(zhuǎn)移灶好發(fā)于不規(guī)則骨,缺乏硬化的骨殼,并且多數(shù)病例為多發(fā)轉(zhuǎn)移。這提示對于診斷FTC,無論是原發(fā)或轉(zhuǎn)移,進(jìn)行全身骨掃描檢查十分必要。國內(nèi)研究報道,以骨轉(zhuǎn)移為首發(fā)癥狀的分化型甲狀腺癌的5年和10年生存率分別為93%和71%[10];國外一項報道顯示,骨轉(zhuǎn)移性FTC的5年和10年生存率分別為63%和50%[11]。這些結(jié)果說明,雖然發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后的甲狀腺癌預(yù)后較差,但與其他發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤相比,預(yù)后仍相對較好[12],所以積極地治療仍有價值。本研究發(fā)現(xiàn),對于僅發(fā)生肺轉(zhuǎn)移或單一部位轉(zhuǎn)移的病例,經(jīng)同位素治療或手術(shù)切除后,仍可獲得較好的預(yù)后;而對于不可手術(shù)切除的多發(fā)轉(zhuǎn)移者,即使積極治療,仍存在較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率。鑒于病例數(shù)較少,本研究并未進(jìn)行生存分析和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移生存的相關(guān)因素分析。

RAS基因突變在甲狀腺濾泡性生長方式的良、惡性腫瘤中均可出現(xiàn),在FTC中的發(fā)生率略高于其他良性濾泡性腫瘤[13]。本實驗亦發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)移性FTC中RAS突變?yōu)槌Ｒ姷淖儺惢?其中NRAS第61密碼子點突變最常見。既往報道FTC中NRAS第61密碼子突變?yōu)樽畛Ｒ姷幕蛲蛔冾愋?發(fā)生率為26%～34%),并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),RAS突變意味著較差的臨床結(jié)局[14-15]。而國內(nèi)一項研究發(fā)現(xiàn)HRAS突變似乎更常見,RAS基因突變不能作為甲狀腺疾病的預(yù)后影響因子[13],造成這種差異的原因可能是不同報道中FTC組織學(xué)類型的構(gòu)成比不同。Nicolson等[16]發(fā)現(xiàn),NRAS第61密碼子突變發(fā)生率在不同類型FTC中是不同的,其發(fā)生率在血管侵犯性FTC>廣泛侵犯性FTC>微小浸潤性FTC;由于不同類型的FTC預(yù)后不同,所以NRAS第61密碼子可能與臨床結(jié)局相關(guān),但大部分研究樣本量較小,還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗證。本研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)移灶中NRAS第61密碼子突變發(fā)生率高,但由于未獲得原發(fā)灶樣本,所以仍不能明確原發(fā)灶是否也具有相同的特點。

本組中有3例未檢出RAS突變,但檢測出了受體酪氨酸激酶相關(guān)變異:1例為ETV6::NTRK3重排、1例為ALK錯義突變、1例存在ERBB2擴(kuò)增,但這些變異在FTC中為罕見變異類型[1,17]。本組3例FTC檢測到KEL基因錯義突變,但該基因變異可能出現(xiàn)于血液系統(tǒng)疾病[18],在其他類型實瘤中報道較少,而在FTC中尚未見報道,其臨床病理意義仍不明確。此外,2例中檢測到ERBB4錯義突變,ErbB4為受體酪氨酸激酶,屬于EGFR家族;但是兩個突變位點中僅c.3662A>G位于激酶域,其突變可能導(dǎo)致下游Erk1/2磷酸化通路的活化,而c.965T>A位于胞外段(既往在運動元神經(jīng)病中有報道[19]),臨床病理意義并不明確。BRCA1/2是腫瘤抑制基因,其突變可影響損傷修復(fù)功能,導(dǎo)致患乳腺癌和卵巢癌的風(fēng)險增高,但本組4例BRCA1/2突變者均無乳腺癌或卵巢癌病史;鑒于本實驗未對正常組織進(jìn)行檢測,因此尚不能明確BRCA1/2突變是否為胚系突變。本實驗還檢測到ALK、ROS1、BRAF等受體酪氨酸激酶家族基因的錯義突變,僅1例ALK錯義突變c.3251G>A發(fā)生在激酶域(ClinVar ID:404330),且不存在RAS突變。具有明確臨床意義的還有TERT啟動子、TP53和PTEN突變,這可能與腫瘤高侵襲性相關(guān)[20-21]。需注意的是,本組中有8例檢測到TERT啟動子突變,這充分說明了FTC中TERT啟動子突變檢測的重要意義。韓國成均館大學(xué)的一項研究發(fā)現(xiàn),TERT啟動子突變好發(fā)于血管侵犯型FTC,并且和FTC預(yù)后關(guān)系密切[21],這提示TERT突變的FTC具有較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險;鑒于本研究未對原發(fā)灶進(jìn)行檢測,因此仍不能明確該突變存在于原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移過程中獲得性突變。

綜上,FTC的好發(fā)轉(zhuǎn)移部位依次是骨、肺、腦,轉(zhuǎn)移性FTC中存在NRAS第61密碼子以及TERT啟動子頻發(fā)突變,可能與FTC的預(yù)后不良相關(guān)。本研究亦存在一些不足:(1)NGS測序結(jié)果未進(jìn)行進(jìn)一步驗證;(2)測序樣本量少,僅有12例;(3)無原發(fā)病灶測序結(jié)果。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量對FTC進(jìn)行研究,對于明確FTC轉(zhuǎn)移相關(guān)因素以及基因表型,提高FTC的診斷準(zhǔn)確率,闡明FTC的生物學(xué)行為,具有較好的臨床參考價值。