張樂道，曹世英，王國澤，程立坤，云月英，盧俊

(內(nèi)蒙古科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭，014010)

石蠟切片技術(shù)是觀察植物組織結(jié)構(gòu)最重要的技術(shù)之一[1-2]。該技術(shù)可以很好地將石蠟與植物組織結(jié)合，經(jīng)過固定、脫水、透明、染色等一系列特殊的方法制成透明的薄片，在顯微鏡或電子顯微鏡下觀察，可如實地反映細(xì)胞組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化，定量地測定物料中組織結(jié)構(gòu)的大小、數(shù)量及所含物質(zhì)的量的多少[3-4]。

石蠟切片結(jié)合圖像處理技術(shù)可以定量地對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化指標(biāo)進(jìn)行測定。近年來，越來越多的人關(guān)注果蔬干燥過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化。常劍等[5]運用石蠟切片技術(shù)獲得了馬鈴薯、蘋果、胡蘿卜薄壁組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖像，通過Motic Images Plus 2.0軟件測量細(xì)胞的面積、周長，計算出細(xì)胞當(dāng)量直徑和圓度，分析熱風(fēng)干燥對果蔬薄壁組織結(jié)構(gòu)的變化，建立了微觀參數(shù)與宏觀參數(shù)(水分比)的數(shù)學(xué)模型。郭徽[6]利用石蠟切片技術(shù)獲得了不同干燥方法三七主根組織微觀圖像，運用圖像處理技術(shù)計算出面積分形維數(shù)以及迂曲分形維數(shù)，建立了三七主根內(nèi)部傳質(zhì)的數(shù)學(xué)模型。韋玉龍等[7-8]利用石蠟切片結(jié)合圖像處理技術(shù)獲得了熱風(fēng)干制過程中棗果細(xì)胞、空腔等結(jié)構(gòu)隨含水率變化的分布曲線，建立了非線性模型，預(yù)測了干制過程中細(xì)胞、空腔等結(jié)構(gòu)的變化情況。楊佳琪[9]運用石蠟切片技術(shù)獲得了熱風(fēng)干燥蜜桃和胡蘿卜的組織微觀結(jié)構(gòu)圖像，運用MATLAB和Photoshop等圖像處理軟件獲得相關(guān)微觀參數(shù)，以含水率為指標(biāo)進(jìn)行分析，進(jìn)一步得到了干燥過程中物料的微觀與宏觀結(jié)構(gòu)參數(shù)的關(guān)系。ONG等[10]利用掃描電鏡獲取了熱燙預(yù)處理后不同干燥方法的水果果實微觀結(jié)構(gòu)，表明不同干燥溫度對水果果實薄壁細(xì)胞形狀和完整度有顯著的影響。MOREIRA等[11]使用刀片徒手切片后甲苯胺酮溶液染色，獲取了新鮮、滲透脫水、風(fēng)干和復(fù)水后板栗的微觀結(jié)構(gòu)，通過UTHSCSA Image Tool v.2.0等軟件計算出板栗細(xì)胞大小和形狀參數(shù)，對比了新鮮板栗和不同脫水處理后板栗微觀結(jié)構(gòu)的變化。

與掃描電鏡相比，石蠟切片技術(shù)具有廉價、實時監(jiān)測、制作簡單等優(yōu)點。目前，傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)多數(shù)針對新鮮果蔬物料，本文針對干制懷山藥硬度較大、含水率較低的特點，在傳統(tǒng)的石蠟切片技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，探索出適合干制懷山藥的石蠟切片技術(shù)。利用改良技術(shù)觀察了熱風(fēng)干燥、真空干燥和微波真空冷凍干燥懷山藥的微觀結(jié)構(gòu)，該技術(shù)為研究干燥物料微觀結(jié)構(gòu)提供良好的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮懷山藥產(chǎn)自河南焦作溫縣，2021年4月在中國特產(chǎn)溫縣館采購，所選懷山藥外形完整、粗細(xì)均勻、表皮無酶、無病蟲害、肉質(zhì)潔白，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 設(shè)備與試劑

HistoCore MULTICUT輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司；ZXRD-B5110熱風(fēng)干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；DZF-6050B真空干燥箱，上海一恒科學(xué)有限公司；DK-90-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Nikon Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡，尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；SQP-QUINTIX124-1CN電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DHS16-A多功能紅外水分測定儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；微波真空冷凍干燥機(jī)，自制(設(shè)備原理參考文獻(xiàn)[12])；GR-B2471PKF冰箱，泰州樂金電子冷機(jī)有限公司。

二甲苯、冰乙酸、固綠，上海麥克林生化科技有限公司；甲醛、無水乙醇、95%乙醇，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；鹽酸，北京化工廠；石蠟48～50 ℃，北京索萊寶科技有限公司；中性樹膠，美侖生物科技有限公司；番紅，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設(shè)計

本實驗分別選用熱風(fēng)干燥(hot-air drying, HAD)：溫度45、50、55 ℃；真空干燥(vacuum drying, VD)：溫度50、55、60 ℃，壓強(qiáng)0.9×105Pa；微波真空冷凍干燥(microwave vacuum freeze drying, MFD)：微波功率0.225、1、1.5 W/g，壓強(qiáng)50、100、150、200 Pa。每個干燥條件下裝載量為(50.000±0.050) g，含水率≤10%(濕基含水率)時干燥結(jié)束。每個干燥條件的物料被分為2組，第1組取4/5懷山藥，用于測量懷山藥干制過程中的含水率。第2組取1/5懷山藥，用于制作石蠟切片觀察，尺寸約為5 mm×5 mm×4 mm的薄塊，放入甲醛-乙醇-冰乙酸固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative, FAA)中保存。

1.3.2 初始含水率的測定

開啟顯示器預(yù)熱30 min，同時進(jìn)行功能自檢，在預(yù)熱期間將待測的懷山藥切碎(2 mm)，待預(yù)熱結(jié)束，設(shè)定加熱溫度105 ℃、加熱時間120 min，稱量切碎的物料10 g，開始工作。待測定結(jié)束，點擊功能鍵查看物料含水率。

1.3.3 濕基含水率的測定

干燥試驗過程中物料濕基含水率[13]的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ωt,任意干燥t時刻物料濕基含水率，%；ω0,物料初始濕基含水率，%；mt,任意干燥t時刻的質(zhì)量，g；m0,物料初始質(zhì)量，g。

1.3.4 傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)

傳統(tǒng)的石蠟切片技術(shù)是選用新鮮的物料[14]，進(jìn)行FAA或多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脫水，V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1、二甲苯、二甲苯按順序透明，舊蠟液40 ℃恒溫箱過夜、純蠟換3次，切片，展片，二甲苯脫蠟，番紅-固綠二重染色，封片，拍照觀察。

1.3.5 改良石蠟切片技術(shù)

干制懷山藥的特點是硬度較大、含水率較低[15-16]，造成溶液不宜滲透，固定、脫水、透明、浸蠟等過程難度大，且切出的薄片容易斷裂，染色效果較差。有研究表明，針對干、硬物料制作石蠟切片需因材制宜，因此本文參考文獻(xiàn)[14,17]在傳統(tǒng)石蠟切片基礎(chǔ)上增加了軟化預(yù)處理的過程、加長固定時間以達(dá)到良好的切片效果。

1.3.5.1 取材、軟化、固定

物料尺寸5 mm×5 mm×4 mm，在體積分?jǐn)?shù)20%的鹽酸中浸泡12 h，將浸泡好的物料瀝干投入FAA固定液中固定，放入搖床，溫度設(shè)置為室溫，待36 h后將固定好的物料流水沖洗過夜。

1.3.5.2 脫水、透明

梯度乙醇脫水：50%→70%→85%→95%→100%→100%→V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1→二甲苯→二甲苯，各1.5 h

透明、脫水的過程在室溫下進(jìn)行。

1.3.5.3 浸蠟、包埋

V(二甲苯)∶V(蠟液)=2∶8→新蠟液→新蠟液→包埋

V(二甲苯)∶V(蠟液)=2∶8浸蠟過夜、新蠟液分別浸蠟2 h、包埋需在浸蠟結(jié)束后立即進(jìn)行。浸蠟的過程在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度不宜太高，應(yīng)設(shè)置高于石蠟熔點2～3 ℃。

1.3.5.4 切片、展片、烤片

將包埋好的蠟塊修成梯形→設(shè)置切片厚度(10～12 μm)→切片→展片(水浴鍋溫度40 ℃)→撈片→烤片(恒溫干燥箱溫度40 ℃)

1.3.5.5 脫蠟、染色

二甲苯20 min→二甲苯20 min→V(無水乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1 10 min→100%乙醇20 min→95%乙醇10 min→浸入番紅染液中1 h→85%乙醇1 min(去浮色)→固綠染色液5～10 s→95%乙醇1 min→100%乙醇1 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min

1.3.5.6 封片、鏡檢

封片是將蓋玻片一側(cè)放置在滴有中性樹膠的組織切片上，隨后緩慢放下并將空氣完全排除，避免水蒸氣進(jìn)入，封片后將樣片轉(zhuǎn)于37 ℃恒溫箱中烘干，即可長久保存。鏡檢是使用倒置熒光顯微鏡與NIS-Elements成像系統(tǒng)觀察與拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良技術(shù)對干制懷山藥石蠟切片效果的影響

改良前后石蠟切片效果的對比如圖1所示。

圖1 改良前后石蠟切片效果的對比Fig.1 Comparison of paraffin section before and after improvement

因為干制懷山藥干、硬的特點，運用傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)制作時物料不易滲透溶液，導(dǎo)致切片局部碎裂，無法進(jìn)行展片、染色等步驟。傳統(tǒng)石蠟切片制作的微波真空冷凍干燥懷山藥的橫縱切片均出現(xiàn)局部碎裂的情況，不利于后續(xù)石蠟切片制作。與傳統(tǒng)石蠟切片比較，改良石蠟切片技術(shù)可以制出完整連續(xù)的薄片，組織容易滲透溶液，后續(xù)染色效果很好，適用于熱風(fēng)干燥、真空干燥、微波真空冷凍干燥的干制懷山藥石蠟切片制作。

2.2 不同干燥方法對懷山藥微觀結(jié)構(gòu)的影響

石蠟切片技術(shù)與掃描電鏡均可以觀察果蔬組織微觀結(jié)構(gòu)。本文運用改良石蠟切片技術(shù)對新鮮懷山藥和干制懷山藥進(jìn)行橫切和縱切，橫、縱截面懷山藥的微觀結(jié)構(gòu)圖像如圖2所示。

圖2 不同干燥方法下懷山藥改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.2 Cross-section of paraffin sections of Diosocorea opposita with different drying methods (×400)

熱風(fēng)干燥的懷山藥微觀結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁破壞嚴(yán)重，組織結(jié)構(gòu)致密，真空干燥的懷山藥微觀結(jié)構(gòu)存在一定的水分蒸發(fā)通道，熱風(fēng)干燥與真空干燥微觀結(jié)構(gòu)變化較為相似，都是使物料的細(xì)胞壁失去了飽滿而立體的狀態(tài)，皺縮嚴(yán)重，與淀粉顆粒包裹在一起，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)框架依稀可辨，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[18]觀察到的一致，表明溫度是導(dǎo)致細(xì)胞壁皺縮的首要因素；微波真空冷凍干燥的懷山藥微觀結(jié)構(gòu)輪廓較清晰，細(xì)胞具有明顯的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[19]觀察到的一致，表明微波真空冷凍干燥在冷凍階段已經(jīng)形成了多孔的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這個孔道在后續(xù)的微波真空干燥過程中得到了保持。與鮮樣相比干制懷山藥的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)變化很大，鮮樣的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)過干燥處理之后，細(xì)胞壁皺縮、組織結(jié)構(gòu)變得致密，由于干燥方法不同，去除水分的原理不同，造成懷山藥細(xì)胞中水分遷出分布不同，淀粉與水之間的結(jié)合力改變，導(dǎo)致懷山藥細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

2.3 熱風(fēng)干燥溫度對懷山藥微觀結(jié)構(gòu)的影響

熱風(fēng)干燥的懷山藥微觀結(jié)構(gòu)橫、縱截面如圖3所示。溫度45 ℃時橫截面木質(zhì)纖維破壞嚴(yán)重、縱截面孔道結(jié)構(gòu)致密且淀粉粒分布收縮；溫度50 ℃時橫截面木質(zhì)纖維破壞嚴(yán)重但是淀粉粒具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)、縱截面孔道結(jié)構(gòu)致密且淀粉粒分布收縮；溫度55 ℃時橫截面木質(zhì)纖維破壞嚴(yán)重且具有空洞，縱截面孔道結(jié)構(gòu)致密且淀粉粒分布收縮。說明干燥溫度越高對物料的細(xì)胞壁破壞程度、皺縮程度影響越大。

圖3 不同溫度下熱風(fēng)干燥的改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.3 Cross-section of paraffin sections blast drying at different temperatures (×400)

2.4 真空干燥溫度對懷山藥微觀結(jié)構(gòu)的影響

真空干燥懷山藥的微觀結(jié)構(gòu)橫、縱截面見圖4。

圖4 不同溫度下真空干燥的改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.4 Cross-section of paraffin sections vacuum drying at different temperatures (×400)

溫度50 ℃，壓強(qiáng)0.9×105Pa時橫截面木質(zhì)纖維被破壞、出現(xiàn)較大空洞，縱截面孔道結(jié)構(gòu)松散、淀粉粒具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)；溫度55 ℃，壓強(qiáng)0.9×105Pa時橫縱截面木質(zhì)纖維均破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)較大空洞，淀粉粒收縮，縱截面孔道結(jié)構(gòu)致密；溫度60 ℃，壓強(qiáng)0.9×105Pa時橫截面木質(zhì)纖維均破壞嚴(yán)重，出現(xiàn)空洞，縱截面出現(xiàn)大面積空洞。說明真空干燥與熱風(fēng)干燥對懷山藥組織的微觀結(jié)構(gòu)破壞程度相似，但是在壓強(qiáng)的作用和溫度越高時更容易出現(xiàn)大面積的空洞。

2.5 微波真空冷凍干燥的功率、壓強(qiáng)對懷山藥微觀結(jié)構(gòu)的影響

微波真空冷凍干燥的懷山藥微觀結(jié)構(gòu)橫、縱截面如圖5所示。

圖5 不同微波功率、壓強(qiáng)下微波真空冷凍干燥的石蠟切片截面圖(×400)Fig.5 Cross-section of paraffin section microwave vacuum freeze-drying at different microwave power and vacuum degree (×400)

壓強(qiáng)200 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面空腔結(jié)構(gòu)致密、縱截面木質(zhì)纖維破壞較??；壓強(qiáng)150 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面木質(zhì)纖維破壞較小、縱截面淀粉粒具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)；壓強(qiáng)100 Pa，微波功率0.225 W/g時橫縱截面木質(zhì)纖維破壞、空腔結(jié)構(gòu)致密；壓強(qiáng)50 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面空腔結(jié)構(gòu)、木質(zhì)纖維保持最完整；壓強(qiáng)100 Pa，微波功率1 W/g時橫截面具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)、縱截面木質(zhì)纖維保持較好且淀粉粒分布具有蜂窩狀結(jié)構(gòu)；壓強(qiáng)200 Pa，微波功率1.5 W/g時橫截面結(jié)構(gòu)致密但是出現(xiàn)水分通道、縱截面出現(xiàn)空洞。說明微波真空冷凍干燥可以很好地保持多孔介質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)，相對壓強(qiáng)越高時越容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)致密和水分通道的現(xiàn)象，壓強(qiáng)一定時微波功率的影響很小。

3 結(jié)論

改良石蠟切片技術(shù)溶液滲透效果較好，原有細(xì)胞形態(tài)保持良好，脫水透明時組織不易發(fā)脆，浸蠟時不會引起材料變脆、變硬而收縮，切片時可以形成完整的蠟帶，不易碎裂，染色效果好、不易發(fā)生掉片現(xiàn)象。

運用改良石蠟切片技術(shù)觀察懷山藥的微觀結(jié)構(gòu)，其中熱風(fēng)干燥的懷山藥溫度越高，木質(zhì)纖維破壞越嚴(yán)重；真空干燥的懷山藥壓強(qiáng)與溫度越高越容易出現(xiàn)大面積空洞；微波真空冷凍干燥的懷山藥壓強(qiáng)越高越容易出現(xiàn)結(jié)構(gòu)致密的現(xiàn)象和空洞，壓強(qiáng)一定時微波功率的影響較小。

綜合來看，改良石蠟切片技術(shù)結(jié)合顯微成像技術(shù)可以得到組織完整的石蠟切片圖像，能夠清楚地分析干燥后物料組織的細(xì)胞及細(xì)胞與細(xì)胞之間的孔道網(wǎng)絡(luò)，為干燥物料觀察微觀結(jié)構(gòu)提供了一套具體的操作步驟。