胡世偉，王超凡，王景春，王慧慧，趙 華，張朝正*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

白酒作為世界六大蒸餾酒，因其獨(dú)特的口感和香味，深受世界各國(guó)人民喜愛(ài)。濃香型白酒的生產(chǎn)過(guò)程一般包括制曲、發(fā)酵、蒸餾、勾調(diào)等步驟[1]。發(fā)酵過(guò)程中的微生物代謝產(chǎn)生的香氣化合物，是決定濃香型白酒風(fēng)味的重要因素之一。窖泥是在窖池內(nèi)壁附著的一層黏土，參與白酒的發(fā)酵過(guò)程，是濃香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的來(lái)源地。老窖中的窖泥保障了傳統(tǒng)品牌白酒的風(fēng)味和品質(zhì)，窖泥中產(chǎn)生的乙酸、丁酸、己酸等物質(zhì)及其和乙醇形成的多種乙酯，通過(guò)物質(zhì)交換轉(zhuǎn)移到酒醅中，再通過(guò)蒸餾進(jìn)入白酒中，進(jìn)一步影響濃香型白酒的風(fēng)味和品質(zhì)[2]。在濃香型白酒的整個(gè)釀造過(guò)程中，窖泥是產(chǎn)生酒體風(fēng)味物質(zhì)的重要的場(chǎng)所，對(duì)濃香型白酒的特色和品質(zhì)具有決定性作用[3]。但由于窖泥的特殊性，限制了一些常規(guī)微生物分析技術(shù)的應(yīng)用，致使窖泥的研究處于瓶頸階段，但一些組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如宏基因組學(xué)和元轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等對(duì)窖泥的研究提供了新的檢測(cè)手段。

當(dāng)談?wù)摬煌貐^(qū)的白酒風(fēng)味特點(diǎn)時(shí)，可以歸結(jié)于多方面因素的綜合作用。其中，生產(chǎn)工藝、原材料的不同以及微生物群落的差異，是導(dǎo)致這種多樣性的關(guān)鍵因素。在這些因素中，窖泥和酒曲起著重要作用，特別是在影響濃香型白酒風(fēng)味方面，窖泥的影響尤為顯著。窖泥和酒曲不僅僅是白酒釀造過(guò)程中的材料，更代表著釀酒工匠多年的經(jīng)驗(yàn)和技藝積累。尤其是歷經(jīng)歲月的窖泥，蘊(yùn)含了豐富的釀酒智慧。這其中蘊(yùn)含的微生物群落，也扮演著非常重要且獨(dú)特的角色[4]。窖泥中的微生物如己酸菌和乳酸菌產(chǎn)生的酶類(lèi)在酒醅中參與白酒生產(chǎn)過(guò)程中的多種反應(yīng)，產(chǎn)生多種化合物。窖泥中微生物的代謝產(chǎn)物和分解產(chǎn)物中也包含多種揮發(fā)性化合物，這些化合物包括酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)等，貢獻(xiàn)了白酒特有的香氣和風(fēng)味，如果香、花香、香草香氣等[5]，賦予了白酒豐富的口感和復(fù)雜性。因此研究窖泥中微生物群落對(duì)提高白酒品質(zhì)非常重要。

鑒于窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵作用，本文簡(jiǎn)述了窖泥微生物中的乳酸菌、己酸菌、芽孢桿菌及產(chǎn)甲烷菌，并綜述了濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)，探討了窖泥中的微生物菌群對(duì)濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，旨在為進(jìn)一步研究濃香型白酒的窖泥微生物、提升白酒質(zhì)量以及增強(qiáng)風(fēng)味特性提供思路和支持。

1 窖泥中的微生物

1.1 乳酸菌

乳酸菌是自然界中廣泛存在的一類(lèi)細(xì)菌，目前已經(jīng)鑒定出的乳酸菌屬種達(dá)到了23種[6]。同時(shí)，從窖泥等環(huán)境中也可以分離出多種乳酸菌，其屬種達(dá)到16個(gè)左右[7]。研究發(fā)現(xiàn)，酒醅中的乳酸菌和窖泥中的乳酸菌在氧的利用、移動(dòng)元件含量和氧化脅迫耐受方面存在差異，且窖泥中兼性厭氧乳酸菌的豐度高于酒醅[8]。這幾年來(lái)，窖泥中乳酸菌的分離培養(yǎng)和代謝研究都取得了重大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）在窖泥中豐度最高[9]。由于乳酸菌的代謝特點(diǎn)，其所產(chǎn)生的乳酸和乙酸在濃香型白酒的風(fēng)味及窖泥環(huán)境中具有重要作用。

乳酸是濃香型白酒中的一個(gè)重要有機(jī)酸，在窖池中的存在對(duì)窖泥的pH值影響較大，從而維持了適宜的酸性環(huán)境[10]。這種酸性環(huán)境不僅有助于淀粉的糖化過(guò)程，還能促進(jìn)乙醇的發(fā)酵。此外，乳酸還具備一定的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的功能，對(duì)維持釀酒過(guò)程的正常進(jìn)行也起到了一定的作用[11]。張會(huì)敏等[12]研究確認(rèn)了窖泥中乳酸含量與pH值之間存在著密切的相關(guān)性。通過(guò)比較新舊窖泥中總氫含量的差異，并探究這些差異與pH值及乳酸含量之間的關(guān)系，可以更深入地了解窖泥微生物群落的代謝情況與窖泥質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)。

1.2 己酸菌

己酸菌隸屬梭菌科，廣泛存在于窖泥中。有研究表明[12]，己酸菌在某些窖泥樣本中是主要的優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)濃香型白酒風(fēng)味的生成有著重要的作用。己酸菌在改良肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵后能得到乙酸、丁酸和己酸等多種酸[13]。GAO Z Z等[14]研究表明，己酸菌是窖泥和黃水中的重要微生物，與己酸的產(chǎn)生存在著重要的關(guān)聯(lián)。乙酸、丁酸和己酸是濃香型白酒中常見(jiàn)的酸性香氣物質(zhì)，其在發(fā)酵過(guò)程中可以與酒中的醇類(lèi)反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類(lèi)化合物，從而形成香氣物質(zhì)。這些酯類(lèi)物質(zhì)通常具有芳香或果香味道，是濃香型白酒中重要的香氣成分之一。乙酸、丁酸和己酸是賦予濃香型白酒獨(dú)特香氣的重要元素，它們也是相關(guān)酯形成的關(guān)鍵成分。韓珍瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，己酸菌在白酒生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的己酸，不僅僅有著賦予香氣、增強(qiáng)香味、減少刺激性的作用，同時(shí)還能與酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成一種稱為己酸乙酯的化合物。這種化合物是濃香型白酒獨(dú)特的主要香味成分之一。通過(guò)這種反應(yīng)，能夠改善濃香型白酒的風(fēng)味和口感。實(shí)際上，這個(gè)過(guò)程影響著濃香型白酒的風(fēng)格和質(zhì)量。胡承等[16]研究表明，窖泥的微生物群落主要是由厭氧異養(yǎng)菌和己酸菌等微生物構(gòu)成的，在酶的作用下，發(fā)生多種生化反應(yīng)，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而生成濃香型白酒的呈香物質(zhì)。近年來(lái)，隨著氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，窖泥中風(fēng)味物質(zhì)的分析也邁上了新的臺(tái)階。魯少文等[17]通過(guò)富集培養(yǎng)新型瘤胃梭菌（Clostridiumsp.）CPC-11并將其用于窖泥的養(yǎng)護(hù)中，使?jié)庀阈桶拙频闹饕L(fēng)味物質(zhì)（如己酸和己酸乙酯）在窖泥中積聚，從而增強(qiáng)窖泥品質(zhì)，提高白酒風(fēng)味質(zhì)量。

1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌屬（Bacillus）是廣泛分布于自然環(huán)境中的微生物，這類(lèi)微生物在食品的發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生各種風(fēng)味化合物。在自然條件下，濃香型白酒的發(fā)酵也常常會(huì)涉及到芽孢桿菌的作用[18]。事實(shí)上，窖泥中的芽孢桿菌也是濃香型白酒釀造的重要組成部分，從窖泥中分離得到了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Bacillus boronophilus）等芽孢桿菌屬中的物種[15]。它們都能夠代謝產(chǎn)生3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇等濃香型白酒重要的香味物質(zhì)，對(duì)于濃香型白酒的風(fēng)味特征起到一定的調(diào)節(jié)作用[19]。因此，研究窖泥中芽孢桿菌屬的分布、代謝規(guī)律及其與白酒風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)，對(duì)于提高濃香型白酒生產(chǎn)技術(shù)和品質(zhì)具有重要的意義。眾多研究結(jié)果表明，芽孢桿菌對(duì)濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生起著重要作用，并且芽孢桿菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物與窖泥中眾多物質(zhì)相互作用和反應(yīng)，維持著窖泥穩(wěn)定的酸堿度環(huán)境，并且芽孢桿菌的穩(wěn)定生長(zhǎng)可促使產(chǎn)甲烷菌（Methanogenic archaea）的生成[20]。劉燕梅等[19]從濃香型白酒的窖泥中分離出三種細(xì)菌，利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid analysis，PLFA）鑒定方法確認(rèn)它們分別是球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）和塵埃類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。研究發(fā)現(xiàn)，這三種細(xì)菌具備強(qiáng)大的產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)能力，而且它們所合成的化合物種類(lèi)繁多，主要包括高級(jí)醇、高級(jí)酮等芳香類(lèi)化合物。這些微量成分在濃香型白酒中的存在起到了關(guān)鍵作用，它們不僅能夠貢獻(xiàn)香氣，還能在風(fēng)味方面提供協(xié)同效應(yīng)，豐富白酒的口感和氛圍。因此，這些細(xì)菌產(chǎn)生的化合物在塑造濃香型白酒獨(dú)特風(fēng)味特征方面具有重要的放香、增香和調(diào)香功能。多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示，芽孢桿菌在濃香型白酒的香氣成分中扮演著重要角色，其次級(jí)代謝產(chǎn)物可能與其他窖泥微生物相互影響，從而維持了窖泥環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。這意味著芽孢桿菌不僅在香味方面對(duì)白酒貢獻(xiàn)巨大，同時(shí)也在維護(hù)窖泥生態(tài)平衡方面具有重要作用。侯小歌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、丁酸、己酸等香味物質(zhì)會(huì)在梭狀芽孢桿菌、乳酸片球菌等細(xì)菌的代謝過(guò)程中產(chǎn)生，并且會(huì)影響濃香型白酒風(fēng)味和品質(zhì)的形成。

1.4 產(chǎn)甲烷菌

產(chǎn)甲烷菌是在厭氧條件下產(chǎn)生的，它產(chǎn)生的一些重要產(chǎn)物是濃香型白酒的重要香味成分。窖泥中有著豐富的產(chǎn)甲烷菌，這些產(chǎn)甲烷菌維持著窖泥的酸堿平衡以及整個(gè)厭氧消化體系的穩(wěn)定[22]。窖泥中主要的產(chǎn)甲烷菌為甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷桿菌屬（Methanobacterium）。這些甲烷產(chǎn)生菌能有效地利用發(fā)酵型細(xì)菌產(chǎn)生的氫氣，將其轉(zhuǎn)化為甲烷，從而防止氫氣在環(huán)境中積累，同時(shí)還抑制了脂肪酸的分解。由于這些甲烷產(chǎn)生菌在窖泥中調(diào)節(jié)了氫氣和乙酸的平衡，它們促進(jìn)了濃香型白酒中香味成分的生成[23]。產(chǎn)甲烷菌在窖泥中可以使酸性消化階段的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步分解，使酸堿度上升，并且甲烷菌能氧化分子狀態(tài)的氫，利用二氧化碳作為電子受體[24]。

研究表明，可以通過(guò)互營(yíng)細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌互營(yíng)合作實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酸的降解[25]。窖泥中含有豐富的產(chǎn)甲烷菌，而且窖泥中的產(chǎn)甲烷菌與多數(shù)細(xì)菌呈正相關(guān)[26]。在濃香型白酒的發(fā)酵過(guò)程中，甲烷桿菌屬是窖池中古菌群中數(shù)量最多的一類(lèi)。研究顯示，窖泥中的甲烷桿菌屬與氫孢菌屬以及產(chǎn)己酸菌屬之間存在著正向關(guān)聯(lián)，它們之間相互影響[27]。通過(guò)在窖泥中發(fā)現(xiàn)的各種短鏈脂肪酸的合成基因，得到了產(chǎn)甲烷菌與其他微生物相互作用的強(qiáng)有力證據(jù)。

2 濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)

2.1 酯類(lèi)物質(zhì)

濃香型白酒的主要風(fēng)味成分之一是己酸乙酯，其含量在評(píng)價(jià)白酒的質(zhì)量上具有重要作用。此外，丁酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯以及棕櫚酸乙酯等酯類(lèi)化合物，在白酒的化學(xué)成分中所占比例較高，被認(rèn)為是白酒主要的香味成分[28-29]。FAN W L等[30]通過(guò)氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactory，GC-O）技術(shù)分析和香氣萃取稀釋分析（aromaextractdilutionanalysis，AEDA）發(fā)現(xiàn)，劍南春和五糧液這兩種濃香型白酒中含有一系列重要的香氣化合物。其中，丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯以及己酸等酯類(lèi)化合物被認(rèn)定為主要的香氣成分。在這些化合物中，酯類(lèi)，尤其是乙酯，被認(rèn)為是這些濃香型白酒中最重要的芳香物質(zhì)。特香型白酒的獨(dú)特特征之一是其含有丙酸乙酯[31]，這種化合物的味道微澀，有芝麻和菠蘿的香氣[32]。研究發(fā)現(xiàn)[33]，通過(guò)引入企業(yè)自制富含營(yíng)養(yǎng)的酒窖泥，可以增加特香型白酒基礎(chǔ)酒中丙酸乙酯的濃度，從而賦予酒品更加獨(dú)特的風(fēng)味。另一方面，在濃香型白酒中，己酸乙酯是主要的芳香化合物之一，在白酒的微生物發(fā)酵過(guò)程中，酯類(lèi)的合成是一個(gè)重要步驟，主要是通過(guò)酸與醇在酯化酶的催化作用下形成的。因此，能夠賦予白酒獨(dú)特香氣的微生物包括兩類(lèi)：一類(lèi)是能夠產(chǎn)生香氣分子及其前體的微生物，另一類(lèi)是具備酯化酶活性的微生物，其量的變化對(duì)于濃香型白酒的品質(zhì)具有至關(guān)重要的影響[21]。此外，辛酸乙酯的香氣強(qiáng)度僅次于己酸乙酯，研究表明，微量添加辛酸乙酯到濃香型白酒中，可以賦予酒液明顯的水果香氣；適度的辛酸乙酯含量有助于增強(qiáng)酒體的復(fù)合香氣，起到積極的促進(jìn)作用，然而，當(dāng)辛酸乙酯含量過(guò)多時(shí)，會(huì)對(duì)酒體中其他香味成分產(chǎn)生抑制效應(yīng)，在濃香型白酒的風(fēng)味中也扮演著重要的角色[34]。這些香氣成分在白酒的制作過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，對(duì)于不同類(lèi)型的白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)獨(dú)特的特點(diǎn)。

2.2 酸類(lèi)物質(zhì)

己酸、乙酸和丁酸是濃香型白酒中的三種重要有機(jī)酸，它們?yōu)榘拙茙?lái)了愉悅的香氣，因其在原酒中的含量較高。酒中適度的酸味能夠使白酒口感更加豐富，而酸味不足則可能導(dǎo)致白酒口味單調(diào)。這些酸類(lèi)物質(zhì)在白酒中還具有另一個(gè)重要的作用，就是作為揮發(fā)性香味物質(zhì)酯類(lèi)的合成前體。它們通過(guò)與醇類(lèi)反應(yīng)，在酵母和微生物的作用下生成各種香味豐富的酯類(lèi)化合物[35]。其中，己酸具有增強(qiáng)香氣、助于形成香氣、減輕酒體的刺激感，并在口感上產(chǎn)生緩沖平衡的作用。此外，己酸還是濃香型白酒的主要香氣成分之一，己酸乙酯的前體[36-37]。杜相林[38]研究對(duì)比了新老窖泥制作的白酒，分析了原酒中上、中、下三個(gè)糟層的五種主要揮發(fā)性酸類(lèi)物質(zhì)。結(jié)果表明，在這兩種窖泥酒體中，酸類(lèi)物質(zhì)的含量從高到低依次是乙酸、己酸、丁酸、戊酸和庚酸。綜合而言，新窖泥酒體相對(duì)于老窖泥酒體，其乙酸和己酸的總含量較高。張建敏等[39]研究顯示，適度的酸度可以調(diào)整白酒的風(fēng)格，提升其口感和適口性。

2.3 醇類(lèi)物質(zhì)

醇類(lèi)化合物在白酒中具有醇甜的風(fēng)味特點(diǎn)，并能夠起到助香的作用，對(duì)于白酒的風(fēng)味形成和酒體的豐滿濃厚具有重要作用。這些醇類(lèi)化合物可以與窖泥中的微生物產(chǎn)生的酯化酶一同作用，與酸類(lèi)物質(zhì)共同生成酯類(lèi)化合物。醇類(lèi)不僅僅賦予酒香和味道，同時(shí)也是醇甜和助香特點(diǎn)的主要來(lái)源，對(duì)于形成白酒的風(fēng)味以及增進(jìn)酒體的豐滿和濃郁具有關(guān)鍵影響[40]。段明松等[41]研究表明，對(duì)新舊窖泥制作的白酒，取其上、中、下三個(gè)糟層的原酒中的8種主要醇類(lèi)化合物進(jìn)行了分析。正丁醇、仲丁醇、2,3-丁二醇、正己醇和β-苯乙醇這5種化合物在老窖泥的上層酒到新窖泥的下層酒中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)。其中，正丁醇和仲丁醇帶有微苦的味道，適量的含量能夠增加白酒的醇厚感和余味。2,3-丁二醇和正己醇具有甜味，隨著含量的增加，能夠?yàn)榘拙茙?lái)醇甜感。而β-苯乙醇則具有玫瑰花的香氣，為白酒賦予了獨(dú)特的花香特點(diǎn)。

3 結(jié)論

濃香型白酒的功能性微生物在生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中主要依賴于窖泥作為生態(tài)載體。窖泥中的功能性微生物種類(lèi)以及它們之間的相互作用在濃香型白酒的風(fēng)味形成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些微生物種類(lèi)在釀造過(guò)程中參與了復(fù)雜的代謝反應(yīng)，產(chǎn)生了各種化合物，其中包括影響白酒風(fēng)味的關(guān)鍵成分。它們的相互作用可以影響代謝產(chǎn)物的種類(lèi)和含量，從而直接影響到白酒的香氣特點(diǎn)和品質(zhì)。然而，需要注意的是，窖泥中影響濃香型白酒風(fēng)味的物質(zhì)并不是在實(shí)驗(yàn)室條件下單一成分的簡(jiǎn)單存在。相反，這些物質(zhì)是由己酸菌、產(chǎn)甲烷菌（Methanogenus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等多種微生物共同存在的有機(jī)整體所組成，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的相互作用體系。例如，產(chǎn)甲烷菌并不直接產(chǎn)生濃香型白酒風(fēng)味化合物，但是產(chǎn)甲烷菌會(huì)解除已酸菌代謝產(chǎn)物氫的抑制作用，在同一窖池環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌和己酸菌具有相同的變化趨勢(shì)[42]?；诮涯辔⑸矬w系的復(fù)雜性，需要從整體微生物群落水平研究窖泥微生物群落與產(chǎn)香化合物組成之間的關(guān)系，影響白酒風(fēng)味的功能微生物還有待于進(jìn)一步研究。