程曉洪，李家富，宋昕雨，陳俞瑾，王歡

心力衰竭（heart failure，HF）是各種心血管疾病的晚期階段，其病死率、患病率逐年升高，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。研究表明，心室重構(gòu)引起的心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制［2］，其中心肌纖維化是心肌重塑過程中心功能由代償轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥數(shù)闹匾h(huán)節(jié)［3］，因此，深入研究心肌纖維化機(jī)制，尋找治療心力衰竭的新靶點(diǎn)對保護(hù)心功能至關(guān)重要。胰高血糖素樣肽1（GLP-1）是結(jié)腸和小腸遠(yuǎn)端的L細(xì)胞分泌的胃腸激素，通過刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌和胃排空，從而降低餐后血糖［4］。GLP-1受體激動(dòng)劑（GLP-1RA）是GLP-1的同源性近似物，不會(huì)被體內(nèi)的二肽酰肽酶-4（DDP-4）快速降解，彌補(bǔ)了GLP-1的不足。除降糖效應(yīng)，GLP-1還因能降低糖尿病患者的心血管事件風(fēng)險(xiǎn)而被廣泛關(guān)注［5-7］，且這種心血管的獲益，在非糖尿病患者中也得到了證實(shí)［8］。度拉糖肽是美國禮來公司研發(fā)的新型長效GLP-1受體激動(dòng)劑，其安全性和有效性已在隨機(jī)對照研究中得到證實(shí)［9］。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種高效的廣譜抗癌藥物，但是其可引起時(shí)間及劑量依賴性的心臟毒性，限制其在臨床上的應(yīng)用［10］。報(bào)道表明DOX致心力衰竭機(jī)制與其氧化應(yīng)激損傷、心肌細(xì)胞代謝障礙、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂和活化線粒體凋亡途徑等有關(guān)［11］，因此DOX致大鼠心力衰竭模型已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究中方便可行的常用模型。本研究于2021年1—8月通過比較此模型從而探究GLP-1R激動(dòng)劑改善阿霉素誘導(dǎo)心肌纖維化大鼠心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制，且目前國內(nèi)鮮見此類報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與主要試劑健康雄性SD大鼠40只，購自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（川）2018-0017，實(shí)驗(yàn)中充分保證動(dòng)物福利、給予動(dòng)物人道關(guān)懷，動(dòng)物處置也符合倫理學(xué)原則。鹽酸阿霉素（貨號(hào)SD9280）、凝膠制備試劑盒（貨號(hào)AS1012）、RIPA總蛋白裂解液（貨號(hào)AS1004）、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（貨號(hào)AS1086）、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（貨號(hào) AS1086）、Exendin（9-39）（貨號(hào) HY-P0264）均購自ASPEN公司，General cGMP ELISA Kit（貨號(hào)ELK8144）、Rat GLP1 ELISA Kit（貨號(hào)ELK8502）、Rat INS ELISA Kit（貨號(hào)ELK2370）、Rat NT-ProBNP ELISA Kit（貨號(hào)ELK8211）購自ELK Biotechnology公司，葡萄糖（Glu）測試盒說明書（貨號(hào)F006-1-1）購自南京建成公司，GLP-1（貨號(hào)D381211）購自vetter pharmafertigung Gmbh&co.KG公司。

1.2 主要儀器DYY-6C型電泳儀購自北京市六一儀器廠，TGL-16型冷凍離心機(jī)購自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，DR-200BS型酶標(biāo)儀購自Diatek公司，GNP9160型恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，HH-W-600型水浴鍋購自金壇市江南儀器廠，JT-12K型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)購自武漢俊杰電子有限公司，RM2016型病理切片機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司。

1.3 模型建立40只 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（10只）和心肌纖維化模型組（30只），造模組用阿霉素3 mg/kg，每周3次，連續(xù)2周，累積18 mg/kg腹腔注射，4周后超聲觀察心臟結(jié)構(gòu)與功能評(píng)估是否造模成功。成模后將心肌纖維化組采用隨機(jī)數(shù)字表法分為阿霉素組（DOX組）、阿霉素+度拉糖肽組（GLP-1RA組）、阿霉素+度拉糖肽+Exendin（9-39）組（EX-9-39組），每組10只。隨后GLP-1RA組予以度拉糖肽1 mg·kg-1·w-1皮下注射，連續(xù) 4周， EX-9-39組予以度拉糖肽 1 mg·kg-1·w-1皮下注射及 Ex9-39 200 μg·kg-1·d-1腹腔注射，連續(xù)4周，N組及DOX組予以等體積生理鹽水皮下注射。記錄末次體質(zhì)量，予以5%水合氯醛 300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，完善心臟超聲后處死大鼠，取標(biāo)本檢測。

1.4 主要方法

1.4.1 心臟超聲 將大鼠稱重后用5%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后左側(cè)胸前區(qū)備皮，取仰臥位，固定在鼠板上，由心臟超聲科?？漆t(yī)師利用超聲診斷系統(tǒng)，選取胸骨旁左室乳頭肌短軸切面采集左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs），左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd），左心室縮短分?jǐn)?shù)（FS）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.4.2 組織標(biāo)本檢測 將取出的新鮮心肌組織固定于4%多聚甲醛中，脫水后包埋，修整好后制作成4 μm石蠟切片。HE染色觀察心臟組織形態(tài)學(xué)變化，Masson染色觀察心肌纖維化程度并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）測定蛋白水平 首先提取組織總蛋白；然后使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，用SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)PVDF膜；根據(jù)抗體說明書加入稀釋后的一抗，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，每次5 min；加入稀釋好的二抗，室溫孵育，搖床上洗4次，滴加新鮮配制的ECL混合溶液（A∶B=1∶1），暗室中曝光；將膠片進(jìn)行掃描存檔，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 取血清后用離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，收集上清液于1.5 mL EP管中，存于-80 ℃超低溫冰箱，按照Elisa試劑盒檢測NT-proBNP、GLP-1、血糖、胰島素等指標(biāo)，心肌組織取材后，速凍于-80 ℃保存，按照Elisa試劑盒檢測cGMP。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有資料使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所得到的數(shù)值以±s表示，多樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLP-1R激動(dòng)劑對血糖及胰島素的影響各組間血糖及胰島素的濃度比較，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）激動(dòng)劑對大鼠血糖及胰島素變化/± s

表1 胰高血糖素樣肽1受體（GLP-1R）激動(dòng)劑對大鼠血糖及胰島素變化/± s

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10血糖/（mmol/L）5.04±0.39 4.84±0.33 4.78±0.61 4.67±0.55 0.30 0.823胰島素/（pmol/L）1 436.18±30.06 1 483.91±68.97 1 503.54±42.26 511.71±44.60 1.46 0.297

2.2 GLP-1R激動(dòng)劑對心肌纖維化的影響

2.2.1 HE染色 N組心肌纖維染色均勻，排列整齊，走行正常，輪廓清晰，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞間隙正常；DOX組心肌纖維著色不均，排列紊亂，輪廓不清，細(xì)胞核散亂分布；GLP-1RA組心肌排列較整齊，輪廓大致清晰；EX9-39組細(xì)胞排列、輪廓清晰程度介于DOX組與GLP-1RA組之間。見圖1。

2.2.2 Masson染色 N組見極少膠原纖維沉積；DOX組可見大量膠原纖維沉積；GLP-1RA組膠原沉積較DOX組少；EX9-39組膠原沉積介于DOX組與DOX+GLP-1RA組之間。進(jìn)一步行CVF分析，與N組［（0.3±0.05%）］相比，DOX組［（5.88±0.13）%］CVF明顯升高（P＜0.05）；給予度拉糖肽治療后，GLP-1RA組［（0.83±0.14）%］CVF下降（P＜0.05）；予以GLP-1RA拮抗劑后，exendin9-39組CVF升高（P＜0.05）。見圖2。

2.3 Western blotting測定大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB、PKG、CaMKⅡ、p-RyR蛋白水平Western blotting結(jié)果顯示與N組相比，DOX組 GLP-1R、PKG、SERCA2a、p-PLB 水平降低（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平升高（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組GLP-1R、PKG、SERCA2a、p-PLB水平升高（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平降低（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組GLP-IR、PKG、SERCA2a、p-PLB水平部分降低（P＜0.05），PLB、p-RYR、CaMKⅡ水平升高（P＜0.05），見表2；圖3。

圖3 大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB、PKG、CaMKⅡ、p-RyR蛋白表達(dá)

表2 各組大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB結(jié)果/± s

表2 各組大鼠心肌組織GLP-1R、SERCA2a、PLB、p-PLB結(jié)果/± s

注：GLP-1R為胰高血糖素樣肽-1受體，SERCA2a為肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵，PLB為受磷蛋白，p-PLB為磷酸化受磷蛋白，PKG為蛋白激酶G，CaMKⅡ?yàn)殁}調(diào)蛋白激酶Ⅱ，p-RyR為磷酸化蘭尼堿受體。①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 GLP-1R 0.61±0.05 0.29±0.01①0.49±0.01②0.10±0.01③229.73＜0.001 SERCA2 ATPase 0.72±0.06 0.06±0.01①0.41±0.04②0.20±0.16③193.81＜0.001 P-PLB 0.42±0.05 0.06±0.01①0.32±0.08②0.19±0.02③31.58＜0.001 PLB 0.10±0.01 0.66±0.04①0.17±0.03②0.37±0.04③187.08＜0.001 PKG 0.70±0.07 0.10±0.02①0.40±0.01②0.20±0.02③162.36＜0.001 p-CaMKⅡ0.05±0.01 0.60±0.04①0.16±0.05②0.29±0.01③161.99＜0.001 p-RyR2 0.08±0.01 0.03±0.02①0.01±0.00②0.19±0.01③184.52＜0.001

2.4 Elisa檢測cGMP、GLP-1水平Elisa結(jié)果顯示，與N組相比，DOX組cGMP、GLP-1有所下降（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組cGMP、GLP-1升高（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組cGMP、GLP-1部分下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠環(huán)單磷酸鳥苷（cGMP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平/± s

表3 各組大鼠環(huán)單磷酸鳥苷（cGMP）、胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 cGMP 3 011.70±279.34 1 281.95±110.86①2 247.14±231.04②1 721.72±109.05③42.69＜0.001 GLP-1 357.64±50.89 194.67±24.58①691.97±77.99②269.18±37.64③54.03＜0.001

2.5 對心功能的影響心臟超聲結(jié)果顯示，與N組相比，DOX組LVDs、LVDd、NT-proBNP明顯上升，LVEF、FS降低（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組LVDs、LVDd、NT-proBNP降低 ，LVEF、FS升高（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組LVDs、LVDd、NT-proBNP上升，LVEF、FS值降低（P＜0.05）。見表4；圖4。

表4 各組大鼠心臟左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs），左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）比較/± s

表4 各組大鼠心臟左室收縮末期內(nèi)徑（LVDs），左室舒張末期內(nèi)徑（LVDd）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）比較/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 LVDd/mm 3.82±0.29 6.00±0.52①4.60±0.21②5.53±0.12③27.77＜0.001 LVDs/mm 2.45±0.34 4.00±0.34①2.99±0.06②3.55±0.66③22.76＜0.001 LVEF 84.33±4.04 68.33±1.53①81.00±3.61②74.00±2.00③17.26 0.001 NT-proBNP/（ng/L）0.13±0.03 0.99±0.07①0.34±0.06②0.60±0.05③144.44＜0.001

圖4 各組大鼠心臟超聲圖：A為N組；B為DOX組；C為GLP-1RA組；D為EX9-39組

2.6 GLP-IR對各組心質(zhì)量/體質(zhì)量（HW/BW）的影響結(jié)果顯示，與N組相比，DOX組HW/BW明顯上升（P＜0.05）；與DOX組相比，GLP-1RA組HW/BW降低（P＜0.05）；與GLP-1RA組相比，EX9-39組HW/BW有所上升（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠心質(zhì)量（BW）、體質(zhì)量（HW）、心質(zhì)量/體質(zhì)量（HW/BW）比較/± s

表5 各組大鼠心質(zhì)量（BW）、體質(zhì)量（HW）、心質(zhì)量/體質(zhì)量（HW/BW）比較/± s

注：①與N組比較，P＜0.05。②與DOX組比較，P＜0.05。③與GLP-1RA組比較，P＜0.05。

組別N組DOX組GLP-1RA組EX9-39組F值P值鼠數(shù)10 10 10 10 BW/g 433.00±29.31 295.33±44.66 348.67±20.84 326.33±20.26 11.29 0.003 HW/mg 1 091.67±242.41 1 172.67±101.30 1 122.33±93.04 1 222.33±98.56 0.45 0.722 HW/BW/（mg/g）2.50±0.40 4.00±0.34①3.22±0.11②3.74±0.68③17.69 0.001

3 討論

本研究采用超聲評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)及功能，結(jié)果表明，度拉糖肽治療后可使大鼠心室腔縮小、心功能改善、NT-proBNP有所下降，Exendin9-39作為一級(jí)競爭性GLP-1受體拮抗劑，部分抑制了度拉糖肽的保護(hù)作用，這表明GLP-1R激動(dòng)劑可在一定程度上通過改善射血功能、心臟收縮及舒張功能參與心室重構(gòu)，結(jié)合度拉糖肽治療后可上GLP-1及GLP-1R，而同時(shí)予以度拉糖肽及Exendin9-39則降低了GLP-1、GLP-1R的表達(dá)，這更加進(jìn)一步表明GLP-1R激動(dòng)劑可能通過GLP-1R參與了心室重構(gòu)的過程。

研究表明，正常情況下，GLP-1刺激胰島素分泌是依賴血糖濃度的，隨著血糖濃度降低，GLP-1促胰島素分泌作用降低，當(dāng)該作用降低到一定閾值時(shí)GLP-1不顯示活性［12］，而本實(shí)驗(yàn)中，各組間血糖及胰島素未見明顯改變，這也表明GLP-1R的降糖效應(yīng)具有葡萄糖依賴性，符合既往研究規(guī)律。

心肌重構(gòu)是指心臟為適應(yīng)各種負(fù)荷增加，在結(jié)構(gòu)及功能上發(fā)生適應(yīng)性代償改變，長期持續(xù)高負(fù)荷最終失代償引起心力衰竭，表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化、間質(zhì)細(xì)胞增生等改變［13］。生理情況下，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維構(gòu)成心肌膠原網(wǎng)絡(luò)支架，在保護(hù)心肌細(xì)胞、維持心臟幾何構(gòu)型和僵硬度等方面起著十分重要的作用［14］，心肌纖維化是指Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維沉積，導(dǎo)致心室壁僵硬度增加從而影響心臟功能。本研究中，與正常組相比，阿霉素組心質(zhì)量/體質(zhì)量比明顯升高，Masson染色顯示阿霉素組大量膠原纖維沉積，CVF高，心肌纖維化嚴(yán)重，予以度拉糖肽治療后可改善心肌細(xì)胞肥厚以及心肌纖維化程度，這表明GLP-1R激動(dòng)劑一定程度上能改善心室重構(gòu)，而同時(shí)予以度拉糖肽和Exendin9-39則部分拮抗了度拉糖肽作用，這更加說明了GLP-1R激動(dòng)劑至少部分是通過GLP-1R發(fā)揮作用的。

鈣循環(huán)紊亂是心衰后的主要特征，可同時(shí)降低心臟收縮及舒張功能，同樣影響心臟重構(gòu)，增加心律失常的風(fēng)險(xiǎn)［15］。心衰時(shí)興奮收縮偶聯(lián)受損，特別是SERCA2a表達(dá)降低，導(dǎo)致鈣離子增高，肌質(zhì)網(wǎng)鈣容量降低，同時(shí)CaMKⅡ磷酸化增加，鈣滲漏的增加［16］，上述變化綜合使鈣瞬變幅值降低，降低心肌收縮力。Western blotting結(jié)果顯示度拉糖肽可上調(diào)PKG、SERCA2a、p-PLB水平，而降低PLB、p-RYR、p-CaMKⅡ，結(jié)合Elisa結(jié)果，度拉糖肽可使cGMP升高，可以推測GLP-1R激動(dòng)劑可能通過增加SERCA2a表達(dá)，增加PLB的磷酸化而減少PLB對SERCA2a功能的抑制作用，同時(shí)減少磷酸化的CaMKⅡ蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞鈣循環(huán)的調(diào)節(jié)。且既往研究表明，GLP-1R激動(dòng)劑可在大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中可激cGMPPKG［17］，提示 cGMP-PKG 是 GLP-1R 的下游信號(hào)通路，而PKG信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)SERCA2a表達(dá)與鈣循環(huán)密切相關(guān)，同時(shí)，PKG信號(hào)通路通過降低CaMKⅡ的磷酸化水平，影響下游的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，降低RYR磷酸化，結(jié)合本研究各組PKG、cGMP變化，我們可以合理推測GLP-1R激動(dòng)劑可參與鈣循環(huán)的調(diào)節(jié)可能與cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，GLP-1R激動(dòng)劑在不影響血糖情況下，可以改善心肌纖維化、緩解心肌肥厚，從而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，其保護(hù)作用可能與cGMP-PKG通路有關(guān)，這為心衰的治療提供了新思路。