武振宇

(張家口市婦幼保健院 微生物科，河北 張家口075000)

宮頸病變嚴重程度差異代表著不同的治療難度與治愈成功率，早期宮頸癌篩查有助于降低高級別宮頸病變發(fā)生風(fēng)險，保障女性生命健康安全[1]。目前，臨床以陰道鏡病理活檢作為宮頸癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但該診斷方法具有侵入性且可能存在一定的并發(fā)癥風(fēng)險，因此在臨床實際中常通過人乳頭瘤病毒(HPV)-DNA等完成初步篩查，對高危型HPV感染或高度懷疑宮頸癌變的患者進一步實施病理活檢[2]。HPV-DNA對宮頸病變患者有較高的陽性檢出率，但隨著宮頸疾病的惡化，游離態(tài)病毒載量發(fā)生變化，導(dǎo)致部分宮頸疾病仍存在少數(shù)假陽性、假陰性等錯診或漏診事件，給患者帶來不必要的心理負擔(dān)[3]。吳秋珍等[4]研究提到，E6/E7 mRNA作為HPV病毒致癌基因直接標(biāo)志物，HPV E6/E7 mRNA高表達量表示癌基因高活性，HPV E6/E7 mRNA表達陽性則提示機體內(nèi)存在高度HPV感染，有必要繼續(xù)完成病理活檢或介入治療。而線粒體分裂蛋白1(FIS1) mRNA在宮頸癌患者體內(nèi)呈低表達量，進而無法抑制癌細胞增殖，促進疾病進展[5]。本研究旨在明確宮頸病變不同嚴重程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平及相關(guān)性，為后續(xù)完善宮頸癌初期篩查工作提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集張家口市婦幼保健院2021年1月-2021年7月行宮頸癌篩查的5666例標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)檢查前3 d內(nèi)進行陰道沖洗或陰道內(nèi)藥物治療者；(2)檢查前24 h內(nèi)有性生活史者或經(jīng)期者；(3)檢查時存在外陰、陰道及宮頸等組織損傷或感染者；(4)妊娠期、哺乳期女性或存在近半年內(nèi)妊娠史；(5)臨床各項資料不全。經(jīng)病理活檢確診650例宮頸病變患者，其中356例未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細胞(ASCUS)患者、218例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN) Ⅰ級患者、42例CIN Ⅱ級患者、24例CIN Ⅲ級患者、15例宮頸鱗狀細胞癌患者，年齡20-60歲，平均年齡(40.19±12.34)歲。

1.2 方法

1.2.1宮頸液基薄層細胞學(xué)檢查(TCT)檢查 通過陰道張開器、窺陰器將患者宮頸完全暴露于視野范圍內(nèi)，使用無菌棉球力度稍輕擦取宮頸分泌物，在宮頸外口、管內(nèi)用德同生物和諾森試驗專用宮頸刷取適量組織標(biāo)本置于含有細胞保存液的試管瓶內(nèi)送檢。包括5090例正常組(健康或慢性炎癥)、285例不典型鱗狀細胞(ASC)、183例鱗狀上皮內(nèi)低度病變(LSIL)、98例鱗狀上皮內(nèi)高度病變(HSIL)、10例宮頸癌。

1.2.2HPV-DNA檢查 將收集的宮頸組織標(biāo)本通過HC-2法檢測，包括4種低危HPV亞型(HPV6、11、42、43)與15種高危HPV亞型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73)，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：HPV-DNA≥1.0(ng/L)。

1.2.3FIS1 mRNA檢查 將適量宮頸組織標(biāo)本按RNA提取試劑盒說明書步驟提取RNA，通過逆轉(zhuǎn)率試劑盒說明書步驟將其轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書進行qRT-PCR擴增，引物由上海生工生物工程公司提供，檢測擴增產(chǎn)物的RNA表達，計算FIS1 mRNA相對表達量，獨立重復(fù)檢查2次以上，參考文獻[6]以其中位表達量為界分為FIS1 mRNA高表達量與FIS1 mRNA低表達量，將FIS1 mRNA低表達量判定為陽性。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢查 通過bDNA技術(shù)對采集的宮頸組織標(biāo)本進行檢測，將標(biāo)本置于離心管中，3000 r/min進行5 min離心，分離上清液后，添加2 ml雙重水，震蕩混勻，添加3 μl蛋白酶K、300 μl組織裂解液后于65℃條件下完成半小時的孵育，制成品通過宮頸穩(wěn)態(tài)檢測試劑盒測定，獨立重復(fù)檢查2次取平均值，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：HPV E6/E7 mRNA平均拷貝數(shù)值>1 pg/mL。

1.2.5陰道鏡病理活檢 將擴陰器置于陰道內(nèi)，根據(jù)檢查對象具體生理構(gòu)造對屈光度、焦距進行微調(diào)，充分暴露宮頸上皮、血管及轉(zhuǎn)化區(qū)，使用復(fù)方碘酊與含3%醋酸棉球擦拭上述部位，監(jiān)測顏色轉(zhuǎn)變情況，若未著色則判定為陽性，進一步定位活檢，于光學(xué)顯微鏡下觀察細胞病變性質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

經(jīng)統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS24.0分析整理研究數(shù)據(jù)，例(n)與率(%)指代計數(shù)資料，行χ2檢驗或Fisher精確概率檢驗；計量資料以四分位數(shù)表示，兩組間采用秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析明確FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達陽性與宮頸病變嚴重程度的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率

以TCT不同診斷級別為參考，F(xiàn)IS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASC(P<0.05)。FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于LSIL(P<0.05)，見表1。

表1 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率[n(%)]

2.2 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量

以TCT不同診斷級別為參考，F(xiàn)IS1 mRNA拷貝數(shù)：宮頸癌HSIL>LSIL>ASC(P<0.05)，見表2。

表2 比較TCT不同診斷級別的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量[m(P25，P75)，pg/mL]

2.3 不同宮頸病變程度的HPV基因型分布

以病理活檢結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，4種低危HPV亞型(HPV6、11、42、43)與15種高危HPV亞型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52 、56、58、59、66、68、73)的HPV DNA陽性表達情況見表3。

表3 不同宮頸病變程度的HPV基因型分布(n)

2.4 不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率

以病理活檢結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)IS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASCUS、CIN Ⅰ級(P<0.05)，見表4。

2.5 比較不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量

FIS1 mRNA拷貝數(shù)：宮頸鱗狀細胞癌CIN Ⅲ級>CIN Ⅱ級>CIN Ⅰ級、ASCUS(P<0.05)，見表5。

表4 不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性檢出率[n(%)]

表5 比較不同宮頸病變程度的FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量[m(P25，P75)，pg/mL]

2.6 分析FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達量與宮頸病變嚴重程度的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，以病理活檢結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，宮頸病變嚴重程度與FIS1 mRNA表達量呈顯著負相關(guān)性(r=-0.881，P<0.05)，與HPV E6/E7 mRNA表達量呈顯著正相關(guān)性(r=0.903，P<0.05)。

3 討論

有關(guān)文獻[7]報道，全球?qū)m頸癌患病群體呈逐年增多趨勢，我國每年因?qū)m頸癌死亡的女性可達2-3萬。臨床研究[8]指出，推廣宮頸癌早期篩查有助于及時明確宮頸病變情況，進而完善治療，降低女性死亡風(fēng)險。HPV-DNA是臨床最常應(yīng)用的宮頸癌篩查方式，HPV-DNA檢查有助于獲得HPV感染及分型信息，進而明確宮頸病變嚴重程度，具有針對性高、成本低、適用范圍廣等優(yōu)點，但在高級別宮頸病變中可能存在一定的誤診或漏診風(fēng)險[9]。TCT是目前臨床較為可靠的宮頸疾病檢查技術(shù)，TCT的優(yōu)點在于對宮頸組織細胞標(biāo)本裂解更徹底，排除血細胞干擾，避免有效細胞自溶，且操作便捷，具有較高的陽性檢出率[10]。相關(guān)研究[11]提到，HPV感染進展至宮頸癌需要E6、E7癌基因參與，其可利用鈍化腫瘤抑制蛋白刺激異常細胞增殖，進而造成癌變，因此HPV E6/E7 mRNA的高表達量一定程度上提示宮頸惡意病變。FIS1是線粒體內(nèi)部參與裂變過程的關(guān)鍵分子，高表達量時可刺激線粒體裂變，并促使細胞凋亡，當(dāng)FIS1過表達時，宮頸癌HeLa細胞生長受限，當(dāng)其低表達時，宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移功能不受抑制[12]。以FIS1 mRNA中位表達量為界將低表達量判定為陽性，以HPV E6/E7 mRNA高表達量為陽性，同時以TCT、病理活檢結(jié)果分別為參考進一步分析FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變嚴重程度的相關(guān)性，對減少后續(xù)宮頸癌早期篩查群體的非必要有創(chuàng)檢查有所助益。

本研究結(jié)果顯示，以TCT不同診斷級別為參考，F(xiàn)IS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對LSIL、HSIL、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASC。FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于LSIL。以病理活檢結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)IS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達對CIN Ⅱ級、CIN Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌的陽性檢出率高于ASCUS、CINⅠ級。這說明FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA陽性表達可能更易提示高惡化程度宮頸疾病。這與馬亞琪等[13]研究結(jié)果相符。研究結(jié)果還表明，以TCT不同診斷級別為參考，F(xiàn)IS1 mRNA拷貝數(shù)：宮頸癌、HSILHSIL>LSIL>ASC；以病理活檢結(jié)果為診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)IS1 mRNA拷貝數(shù)：宮頸鱗狀細胞癌、CIN Ⅲ級CIN Ⅲ級>CIN Ⅱ級>CIN Ⅰ級、ASCUS。兩種不同參考結(jié)果均表明FIS1 mRNA拷貝數(shù)隨宮頸疾病的惡化而呈現(xiàn)減少趨勢，而HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)隨宮頸疾病的惡化呈現(xiàn)增加趨勢。目前，有關(guān)FIS1 mRNA在宮頸病變領(lǐng)域的研究資料不足，暫時無法進一步結(jié)合更多過往研究成果完成對照。王蘭英等[14]研究則提到，HPV E6/E7 mRNA較HPV-DNA更有助于區(qū)分宮頸病變不同嚴重程度，部分支持了本研究結(jié)論，這是因為隨HPV感染時間延長，游離態(tài)病毒減少，而整合態(tài)病毒中L1片段已缺失，HPV DNA可能無法準(zhǔn)確檢測，但其中的E6/E7 mRNA仍舊表達[15]。進一步通過Pearson相關(guān)性分析明確FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變程度的關(guān)系，結(jié)果顯示，宮頸病變嚴重程度與FIS1 mRNA表達量呈顯著負相關(guān)性，與HPV E6/E7 mRNA表達量呈顯著正相關(guān)性。證明兩種mRNA分子均與不同嚴重程度宮頸病變存在因果聯(lián)系，即當(dāng)FIS1 mRNA表達量越低而HPV E6/E7 mRNA表達量越高時，女性更易發(fā)生高級別宮頸病變。楊詠梅等[16]研究也部分支持了這一結(jié)果。FIS1是細胞代謝基礎(chǔ)過程的參與分子，可結(jié)合動力相關(guān)蛋白分裂線粒體，進而刺激細胞凋亡，當(dāng)發(fā)生宮頸病變或?qū)m頸疾病惡化時，F(xiàn)IS1分子生物學(xué)功能發(fā)生異常，表現(xiàn)為表達水平降低[17]。另外，HPV E6/E7 mRNA與致癌基因緊密關(guān)聯(lián)，可參與抑癌基因降解過程，并破壞細胞周期的正常調(diào)節(jié)能力，影響細胞無規(guī)則繁殖，HPV E6/E7 mRNA的檢測有助于評價女性是否存在因攜帶HPV高危亞型感染而導(dǎo)致的宮頸病變以及宮頸疾病不同惡化程度。

綜上所述，F(xiàn)IS1 mRNA表達水平與宮頸病變程度存在顯著負相關(guān)性，HPV E6/E7 mRNA表達水平與宮頸病變程度存在顯著正相關(guān)性，檢測FIS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA在早期宮頸癌篩查中均具有一定臨床意義。