孔令環(huán),王雪野,邢明雨,呂作福,艾英莉,邵萬(wàn)艷,魏灼如

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

再生障礙性貧血(aplastic anemia,AA)是由于原因不明因素引起骨髓造血干細(xì)胞和(或)微環(huán)境損害，骨髓增生低下，外周血全血細(xì)胞減少的一組臨床綜合征，本質(zhì)上是由免疫異常介導(dǎo)的造血功能障礙疾病。以往認(rèn)為T(mén)h1細(xì)胞、Th2細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫應(yīng)答是AA發(fā)病機(jī)制中的主要環(huán)節(jié)，另有研究[1]表明Th17分泌的IL-17A在AA的免疫發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。本研究通過(guò)IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A等細(xì)胞因子水平變化，判斷Th1、Th2、Th17平衡狀態(tài)，了解機(jī)體免疫功能，進(jìn)一步探討AA的發(fā)病機(jī)制，有助于臨床探索新的AA治療方案。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2020年1月至2022年9月吉林省人民醫(yī)院血液科收治再生障礙性貧血初治病人54例，其中重型(SAA)25例，非重型(NSAA)29例。SAA組，男11例，女14例，年齡27-87歲，中位年齡58歲；NSAA組，男9例，女20例，年齡18-84歲，中位年齡58歲。免疫抑制劑治療有效組(貧血出血癥狀明顯好轉(zhuǎn)，不輸血，1個(gè)月內(nèi)血紅蛋白增長(zhǎng)30 g/L以上)16例，其中男6例，女10例，年齡21-64歲，中位年齡50歲。按照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[2]，符合再生障礙性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，選擇本院健康志愿者30例為對(duì)照組，男7例，女23例，年齡29-54歲，中位年齡44歲，均知情同意。

1.2 檢測(cè)方法

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子。受試者清晨空腹靜脈采血2 ml，EDTA抗凝，離心，血漿凍存在-80℃冰箱。試劑選購(gòu)BDTMCytometric Bead Array(CBA) Human Th1/Th2/Th17 CBA Kit;儀器為BD FACSCanto II流式細(xì)胞儀。同時(shí)常規(guī)進(jìn)行血常規(guī)及T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)并記錄結(jié)果。

1.3 操作步驟

1.3.1制備人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品是凍干粉，因此實(shí)驗(yàn)前需要重懸并進(jìn)行梯度稀釋。

1.3.2混合人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子捕獲微球 7種捕獲微球分別裝在7個(gè)小瓶中(A1-A7)，使用前應(yīng)將7種微球立即混在一起，混合的捕獲微球按需求移到實(shí)驗(yàn)管中。

1.3.3對(duì)熒光試劑處理好的人的Th1/Th2/Th17流式樣本進(jìn)行檢測(cè) 50 μl血漿+50 μl混合微球+50 μl PE抗體，避光3 h,加入Wash Buffer 1 ml,混合離心5 min,棄上清,加300 μl Wash buffer.混勻，上機(jī)。用儀器調(diào)整微球做儀器條件設(shè)置。檢測(cè)指標(biāo)有7個(gè)：IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IL-4。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AA病人外周血中細(xì)胞因子水平

NSAA組病人IL-2，TNF-α水平低,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);NSAA組病人IL-6，IFN-γ/IL-4水平高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NSAA組病人IL-10,IL-17A,IFN-γ水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1、2。

SAA組病人外周血中IL-2，IL-10水平低，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SAA組病人IL-17A，IFN-γ，IL-6，IFN/IL-4水平高，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1、2。

表1 AA病人IL-2、IL-10、IL-17A、IFN/TI-4水平

表2 AA病人IL-4、IL-6、TNF、IFN、水平

2.2 AA病人免疫抑制劑治療后,有效組IL-2、IL-10、IL-17A、IFN-γ/IL-4水平

AA病人免疫抑制劑治療后IL-2、IL-17A水平減低，與AA組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);IL-10、IFN-γ/IL-4水平與AA組比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 AA病人免疫抑制治療前后IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN/IL-4水平

2.3 AA病人細(xì)胞因子與血細(xì)胞(WBC,HB,PLT,ANC中性粒細(xì)胞比例,淋巴細(xì)胞比例)相關(guān)性

SAA組:IFN-γ與ANC有相關(guān)性,r=-0.563,P=0.003;IL-6與ANC有相關(guān)性,r=-0.477,P=0.016;Th1/Th2與ANC有相關(guān)性，r=-0.444，P=0.026。NSAA組：IL-6與WBC有相關(guān)性,r=-0.464,P=0.011;IL-6與淋巴細(xì)胞有相關(guān)性，r=-0.467,P=0.011。

2.4 AA病人外周血細(xì)胞因子之間以及與T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性

NSAA組：IL-10與CD8+T細(xì)胞有相關(guān)性,r=0.369,P=0.049;IL-10與B淋巴細(xì)胞有相關(guān)性,r=-0.532,P=0.003;IL-17A與IFN-γ有相關(guān)性,r=0.544,P=0.002;IL-2與IL-17A有相關(guān)性,r=0.443,P=0.016;IL-2與IFN-γ有相關(guān)性,r=0.545,P=0.002;IL-2與IL-4有相關(guān)性,r=0.531,P=0.003。

SAA組：IFN-γ與IL-6有相關(guān)性,r=0.487,P=0.014;IL-10與IL-6有相關(guān)性，r=0.662,P=0.001；IL-2與IL-4有相關(guān)性,r=0.463,P=0.02;IL-4與B淋巴細(xì)胞有相關(guān)性，r=-0.409,P=0.042；IL-4與CD8+T細(xì)胞有相關(guān)性，r=0.422,P=0.035。

3 討論

AA 的發(fā)病與免疫異常密切相關(guān)[3-4]。尤其是CD4+T細(xì)胞功能紊亂，CD4+T細(xì)胞主要分為T(mén)h1和Th2。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，主要參加細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6、和IL-10等，刺激B淋巴細(xì)胞增殖并產(chǎn)生抗體，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答過(guò)程。IFN-γ和IL-4分別是Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵的細(xì)胞因子，常用IFN-γ/IL-4代表Th1/Th2平衡。Th1/Th2平衡是免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，病理?xiàng)l件下Th1/Th2極化異?；蛉毕輩⑴c自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，再障患者呈現(xiàn)Th1細(xì)胞極化現(xiàn)象，造血負(fù)調(diào)控因子IL-2、TNF-α、IFN-γ水平增高，Th1/Th2細(xì)胞比例明顯失衡。Kaito[7]等通過(guò)檢測(cè)再障患者IST治療后外周血Th1/Th2細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，治療有效者Th1細(xì)胞數(shù)量、Th1/Th2比例均低于治療無(wú)效者，進(jìn)一步說(shuō)明Th1淋巴細(xì)胞在再障發(fā)病中占優(yōu)勢(shì)。結(jié)論與本研究一致，AA病人(包括SAA和NSAA病人)Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。還發(fā)現(xiàn)SAA病人Th1/Th2與ANC呈負(fù)相關(guān)，證明Th1淋巴細(xì)胞在再障發(fā)病中占優(yōu)勢(shì)；SAA組與NSAA組之間TH1/TH2無(wú)顯著性差異，提示Thl細(xì)胞的增多與疾病的嚴(yán)重性無(wú)關(guān)。

Th17細(xì)胞是一種新的CD4+T細(xì)胞亞群，參與炎癥、感染、自身免疫性疾病等多種病理過(guò)程[8]。IL-17A是Th17細(xì)胞分泌的最具特征性的細(xì)胞因子，屬于IL-17細(xì)胞因子家族中的一員。IL-17A是一種致炎因子，具有獨(dú)立的分化發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)制,能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血負(fù)調(diào)控因子[9]。本研究中，SAA組的IL-17A水平高于對(duì)照組，IST治療后明顯降低，與陸翔等[10]報(bào)道一致,IL-17A能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌高水平的IL-6,TNF-α等造血負(fù)調(diào)控因子,抑制骨髓造血，參與AA病理過(guò)程。免疫抑制劑治療后IL-17A水平明顯降低，對(duì)骨髓抑制作用減低，造血恢復(fù)，所以血紅蛋白濃度升高。IL-17A在SAA與NSAA中表達(dá)水平有顯著性差異，所以分泌IL-l7A的Th17細(xì)胞與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。隨著IST治療，IL-l7A水平降低,IL-17在疾病嚴(yán)重程度及治療療效中表達(dá)不同，提示其可以作為AA診斷及預(yù)后的重要指標(biāo)。

IL-10具有免疫抑制和抗炎作用，通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能，從而抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生造血負(fù)調(diào)控因子如IFN-γ,TNF等，抑制NK細(xì)胞活化，下調(diào)免疫應(yīng)答。同李文靜等[11-12]研究一致,本研究中發(fā)現(xiàn)AA組病人IL-10水平減低，免疫抑制作用降低，對(duì)Th1抑制減低，分泌更多造血負(fù)調(diào)控因子，抑制骨髓造血功能，促進(jìn)AA的發(fā)生。Asano等[13]觀察IL-10對(duì)造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)IL-10能顯著增強(qiáng)CFU-E的形成，或許可以利用IL-10作為AA的支持性治療工具，通過(guò)抑制IFN-γ而促進(jìn)紅系造血島的形成，對(duì)AA具有治療作用。

Chen等報(bào)道[14],IFN-γ等抑制性因子通過(guò)Fas通路、半胱天冬酶和相關(guān)促凋亡基因的上調(diào)降低造血基因的表達(dá)，上調(diào)IFN-γ基因增強(qiáng)小鼠凋亡基因表達(dá)及活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞，增加造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞破壞。Capone等[15]證明微量?jī)?nèi)源性IFN-γ即產(chǎn)生強(qiáng)大抑制效應(yīng)，所以低濃度IFN-γ足以產(chǎn)生骨髓抑制。與本研究相符，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)SAA病人IFN-γ、IL-6與ANC呈負(fù)相關(guān)，NSAA病人的IL-6與WBC、淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；SAA組病人IFN-γ和IL-6水平高于對(duì)照組，NSAA組IL-6水平高于對(duì)照組；可以認(rèn)為造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ和IL-6直接參與了AA疾病的發(fā)生過(guò)程。本研究中AA病人IFN-γ比例增加，IST治療后比例降低，同報(bào)道一致[12]，說(shuō)明IFN-γ也是AA區(qū)別其他血液病所導(dǎo)致的血細(xì)胞減少的標(biāo)志之一。

另外，Dutta等[16]研究證實(shí)，骨髓和外周血中，IL-2,TNF-α,andIFN-γ水平均升高，而且PBP和BMP中的3種細(xì)胞因子水平均呈正相關(guān)。所以檢測(cè)外周血中IL-2,TNF-α,and IFN-γ因子水平可以代替骨髓，判斷骨髓造血的抑制程度，更方便臨床觀察和治療。

有研究報(bào)道[17]，體外高濃度的IL-2可以提高Treg的數(shù)量，提出臨床AA治療除了標(biāo)準(zhǔn)IST外，低劑量和/或低親和力IL-2治療AA的潛在作用，以擴(kuò)大自體Treg細(xì)胞的數(shù)量，改善患者的臨床預(yù)后。本研究中SAA和NSAA病人IL-2水平均低，免疫抑制劑治療有效組IL-2水平繼續(xù)減低。如果能提高AA病人體內(nèi)IL-2水平或許可以改善體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量和功能，給AA治療找出一條新思路。

造血的免疫調(diào)節(jié)因素包括各種細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子之間互相調(diào)節(jié)[18-19]。例如，本研究中NSAA組病人IL-2與IL-17A,IFN-γ，IL-4均呈正相關(guān);IFN-γ與IL-17A、IL-2有相關(guān)性；SAA組：IL-6與IFN-γ、IL-10有相關(guān)性；IL-4與IL-2有相關(guān)性。當(dāng)造血負(fù)調(diào)控因子占主導(dǎo)時(shí)，骨髓造血功能受抑制，則導(dǎo)致AA的發(fā)生；免疫抑制治療后，造血負(fù)調(diào)控因子減少，則造血恢復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，AA病人主要是IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-10、IL-2水平異常，直接或間接參與了造血調(diào)控，與骨髓造血衰竭相關(guān)，是AA發(fā)病機(jī)制中的主要環(huán)節(jié)。調(diào)控機(jī)體內(nèi)的白介素水平，或許能成為疾病治療和預(yù)防的新途徑。