豆 玲

(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州730046)

布魯氏菌主要侵害動(dòng)物生殖系統(tǒng)，引起流產(chǎn)，而病原體能夠以精液、流產(chǎn)胎衣、乳腺分泌液等排出，人是終末宿主。目前，動(dòng)物布魯氏菌病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要以RBPT和SAT等2種免疫學(xué)方法檢測(cè)為主。上述兩種方法抗原與血清用量較大，易感染人，且SAT檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)難以實(shí)現(xiàn)。人類通過(guò)直接或間接接觸炭疽芽孢桿菌可引起傳染，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全亦具有嚴(yán)重威脅。炭疽主要以細(xì)菌和血清檢測(cè)為主，細(xì)菌學(xué)檢測(cè)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，存在一定的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。血清學(xué)檢測(cè)目前尚無(wú)商品化診斷試劑盒，因而僅限于一些專門的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。牛結(jié)核病目前以皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)診斷為主。該方法費(fèi)時(shí)，操作難度大，必須進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)操作，誤差大，假陽(yáng)性較多。甘肅省歷來(lái)就是布病、炭疽、結(jié)核病的頻發(fā)地區(qū)。因此，尋求并建立一種簡(jiǎn)單，迅速，系統(tǒng)準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，是保障畜牧業(yè)發(fā)展以及人類健康的迫切需要。PCR方法具有很高的檢出率，并且克服了常規(guī)方法耗時(shí)的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷中。本研究通過(guò)建立可一次性檢測(cè)三種病原的三重PCR檢測(cè)方法，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，為動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品混合病菌的快速診斷提供了技術(shù)支撐。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結(jié)核病、布魯氏菌病陽(yáng)性滅活菌、炭疽芽孢疫苗來(lái)源同文后參考文獻(xiàn)第二和第九條提供的出處。

1.1.2 主要試劑 所購(gòu)買試劑同文后參考文獻(xiàn)第二和第九條提供的出處。

1.1.3 主要儀器 小型高速離心機(jī)(sigma)、梯度PCR儀(德國(guó)Biometra T1)、凝膠成像處理系統(tǒng)(UVIvpro)等。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)與合成引物 布氏菌序列為BM21、結(jié)核菌序列為IS6110、炭疽質(zhì)粒PXO1，利用Primer6.0軟件，設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，由上海生工生物合成，其堿基序列、序列與擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1 多重 PCR 引物

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 對(duì)布魯氏菌液、炭疽芽孢疫苗和結(jié)核桿菌液進(jìn)行滅活后各取100 μL，用一管式口腔拭子試劑盒提取模板DNA。

1.2.3 擴(kuò)增目的基因片段 以提取的三種模板DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用棋盤法對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最適合的擴(kuò)增程序見表2。

表2 多重 PCR 反應(yīng)程序

1.2.4 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定 回收電泳產(chǎn)物，參照文后參考文獻(xiàn)第二和第九條〗中提供的方法進(jìn)行鑒定。對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序，并與在GenBank已登錄的序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)同源性高低來(lái)鑒定PCR產(chǎn)物的正確性。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 建立好的三重PCR方法，對(duì)常見的巴氏桿菌、沙門氏菌等基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比對(duì)特異性。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA濃度，對(duì)其按10倍倍比稀釋后進(jìn)行PCR方法檢測(cè)。

1.2.7 多重PCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用 對(duì)臨床上采集的23份病料進(jìn)行多重PCR方法檢測(cè)，并與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算其符合率。符合率=(陽(yáng)性數(shù)/總數(shù))×100%

2 結(jié)果

2.1 布魯氏菌、炭疽桿菌、結(jié)核桿菌單一PCR擴(kuò)增

單一PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳可見，退火溫度在56℃時(shí)，PCR擴(kuò)增出布魯氏菌核酸DNA約255 bp，炭疽桿菌核酸DNA約329 bp，結(jié)核桿菌核酸DNA約129 bp三條特異性目的片段，大小與預(yù)期相符(如圖1)，確定了三重PCR的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃5min，變性94℃ 30S，退火56℃ 30S，延伸72℃ 60S，共35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)物;1:結(jié)核;2:布氏菌;3:炭疽

2.2 PCR產(chǎn)物鑒定

分析結(jié)果顯示，PCR陽(yáng)性質(zhì)粒與參照的炭疽、布氏菌、結(jié)核的苷酸序列同源性在98.0%以上，表明產(chǎn)物為預(yù)期擴(kuò)增的目的片段。

2.3 三重PCR的特異性試驗(yàn)

用建立的三重PCR方法檢測(cè)三種基因組DNA，均能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性目的條帶，但對(duì)巴氏桿菌、沙門氏菌以及鏈球菌混合作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均未檢測(cè)到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，從而證實(shí)了所建多重PCR方法具有很好的特異性。結(jié)果如圖2所示。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)物;1:炭疽、布魯氏菌、結(jié)核菌;2:沙門氏菌、巴氏桿菌;3:鏈球菌、結(jié)核桿菌;4:巴氏桿菌、布魯氏菌;5:炭疽桿菌、鏈球菌;6:布氏菌、結(jié)核桿菌、沙門氏菌;7:炭疽桿菌、布魯氏菌、巴氏桿菌;8:炭疽桿菌、鏈球菌、結(jié)核桿菌;9:沙門氏菌、巴氏桿菌、鏈球菌;10:鏈球菌、沙門氏菌

2.4 三重PCR的敏感性試驗(yàn)

對(duì)三種病菌的濃度進(jìn)行測(cè)定，再分別進(jìn)行10倍梯度的倍比稀釋，經(jīng)多重PCR方法擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，該多重PCR方法對(duì)三種病菌的敏感性分別可達(dá)313fg/μL、345fg/μL以及322fg/μL以下。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì); 1:未稀釋;2:10倍稀釋;3:102倍稀釋;4:103倍稀釋;5: 104倍稀釋;6: 105倍稀釋7:106倍稀釋

2.5 三重PCR的重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)倍比稀釋的三種DNA梯度重復(fù)檢測(cè)5次，并對(duì)相同樣品分別進(jìn)行5次三PCR與單一PCR擴(kuò)增檢測(cè)，所有檢測(cè)結(jié)果一致。

2.6 三重PCR檢測(cè)方法的可靠性

對(duì)三重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同源性進(jìn)行分析比較，可達(dá)99%～100%，充分證明了該三重PCR方法的可靠性。

2.7 三重PCR方法的臨床應(yīng)用

用建立的多重PCR檢測(cè)臨床上的23份病料，其結(jié)果如圖4。第7、16、20號(hào)三重PCR檢測(cè)結(jié)果樣品為陽(yáng)性，這與布病試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果符合率為100%；第20、22、23、24號(hào)樣品多重PCR檢測(cè)結(jié)果試驗(yàn)呈陽(yáng)性，與PPD結(jié)果符合率為100%；同時(shí)第20號(hào)臨床病料布魯氏菌核酸和結(jié)核桿菌核酸雙重陽(yáng)性。

M:DNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì); 1:炭疽桿菌、布魯氏菌、結(jié)核桿菌;2～24:臨床病料

3 討論

布病、炭疽、結(jié)核這三種人獸共患病不但給甘肅省養(yǎng)殖畜牧業(yè)的發(fā)展帶來(lái)威脅與巨大的損失，且對(duì)人類的健康威脅嚴(yán)重。病原的分離鑒定培養(yǎng)或者傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，單一PCR方法具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但是對(duì)多種病毒混合感染的鑒定不能實(shí)現(xiàn)。

本研究通過(guò)優(yōu)化PCR擴(kuò)增程序，建立三重PCR方法，通過(guò)試驗(yàn)均顯示檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠?？梢淮涡钥焖贆z測(cè)鑒別布氏菌病、炭疽和結(jié)核三種病原體，這對(duì)于鑒別診斷臨床多種病原體混合感染的病料上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和實(shí)用價(jià)值。在采樣時(shí)僅用采集鼻腔棉拭子，相比于傳統(tǒng)的采集發(fā)病動(dòng)物血清和組織樣本的生物安全風(fēng)險(xiǎn)較低，并能夠較好的避免獸醫(yī)工作人員感染上述人獸共患病。