王 惠 ,賈永濤 ,方雨露 ,董長征*

（1.寧波大學 醫(yī)學院,浙江 寧波 315211;2.浙江省病理生理學技術(shù)研究重點實驗室,浙江 寧波 315211）

人腸道病毒屬小RNA 病毒科(Picornaviridae),腸道病毒屬(Enterovirus),包括腸道病毒 A 種(EV-A)、B 種(EV-B)、C 種(EV-C)和D 種(EV-D).EV-A 代表性血清型包括腸道病毒A 組71 型(Enterovirus A71,EV-A71)和柯薩奇病毒A 組16 型(Coxsackievirus A16,CV-A16)等;EV-B 代表性血清型包括?？刹《?8 型(Echovirus 18,E18)等;EV-C 代表性血清型包括脊髓灰質(zhì)炎病毒1 型(Polioviurs 1,PV1)、PV2 和PV3 等;EV-D 代表性血清型為EV-D68.E18 可引起手足口病、病毒性腦膜炎和急性胃腸炎等疾病[1-4],通常感染后癥狀較為輕微,但嚴重時也會危及生命[5].自1955 年在美國首次分離病毒毒株后,E18 感染鮮有報道,直到21 世紀E18 開始在全球流行,并且引起多起較大規(guī)模的疫情[6-9].2014—2016 年美國腸道病毒監(jiān)測報告顯示,E18 在最常引起疫情的腸道病毒中排第4 位[10].Chen 等[11]在2015—2016 年從我國6 個省份(山東、河北、山西、黑龍江、江蘇和云南)的手足口病、病毒性腦炎和病毒性腦膜炎病例中分離出34 株E18,測定其結(jié)構(gòu)蛋白(Viral Protein,VP)VP1 序列,并完成了其中6株的全基因組測序.2015—2020年,E18 在我國廣東[4,12]、河北[13]、山東[14]和云南[15]等省大量檢出,提示我國存在E18 暴發(fā)風險.

與其他腸道病毒相似,E18有一個長度約為7.4 kb 的單股正鏈RNA基因組,其病毒衣殼由60 個亞單位構(gòu)成[16-18].每個非對稱亞單位由VP1～VP4 構(gòu)成,其中VP4 位于衣殼內(nèi)表面,VP1～VP3 位于衣殼外表面,后者是病毒構(gòu)象表位的所在區(qū)域.抗原表位的確定對掌握病毒的致病機制[19-20]、監(jiān)測病毒的變異和進化[21]、研發(fā)抗病毒藥物[22-23]和疫苗[24-25]都有重要作用.然而,目前尚無針對E18 表位的研究報道.

本研究首先利用前期發(fā)展的生物信息學算法[17-18]對E18 構(gòu)象表位進行系統(tǒng)性預(yù)測,分析表位的分布規(guī)律;然后基于Nextstrain 平臺構(gòu)建E18 的分子進化樹,確定進化分支和決定進化分支的標志性氨基酸突變(分支突變);最后探索分支突變與表位以及病毒受體結(jié)合位置的關(guān)系,分析表位在E18 分子進化過程中的作用.研究結(jié)果可為E18 的監(jiān)測和預(yù)警提供參考.

1 材料與方法

1.1 E18 結(jié)構(gòu)蛋白的序列和結(jié)構(gòu)特征分析

從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫[26](https://www.rcsb.org)和NCBI Nucleotide數(shù)據(jù)庫[27](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)中分別下載E18 天然成熟顆粒的結(jié)構(gòu)蛋白的三維結(jié)構(gòu)文件(PDB ID: 6HBG[16];病毒毒株名: Metcalf,為簡便以下用PDB ID 指代病毒毒株)和其氨基酸序列(Accession ID: AAL37163).將PDB 文件和氨基酸序列導入在線工具ESPript 3.0[28](http://espript.ibcp.fr)中注釋二級結(jié)構(gòu)信息.使用PyMOL[29]繪制病毒衣殼的表面結(jié)構(gòu)圖.所有軟件和在線工具都采用默認參數(shù).

1.2 E18 構(gòu)象表位的生物信息學預(yù)測

實驗室前期在Borley 算法[30]基礎(chǔ)上發(fā)展了人腸道病毒構(gòu)象表位的生物信息學預(yù)測算法,并成功地應(yīng)用于腸道病毒A 種(EV-A71、CV-A16[17])和D 種(EV-D68[31])的表位預(yù)測.預(yù)測算法主要包括以下3 步(詳見文獻[17-18]):

(1)在PDB 文件中刪除VP4 并生成復合鏈(圖1),將復合鏈整體看作一個蛋白質(zhì),代替單個結(jié)構(gòu)蛋白進行表位預(yù)測.

圖1 E18 復合鏈和衣殼表面結(jié)構(gòu)

(2)利用3 個表位預(yù)測工具Epitopia[32](http://epitopia.tau.ac.il)、Ellipro[33](http://tools.iedb.org/ellipro)以及DiscoTope[34](http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope)分別預(yù)測復合鏈的表位.三者的閾值均使用默認參數(shù)(0.174、0.3、-10.7).采用投票法,將同時被3 種工具預(yù)測為表位的氨基酸殘基作為一致性表位.

(3)提取中心鏈Chain 1(一個由VP1～VP3 組成的亞單位)上的一致性表位,并篩選處于病毒衣殼相對暴露面的殘基(其Cα到衣殼中心的距離超過所有Cα到衣殼中心的平均距離),獲得最終的預(yù)測結(jié)果.

1.3 基于Nextstrain 的E18 分子進化分析

Nextstrain[35]是免費的在線(https://nextstrain.org)或本地開源平臺,針對病毒基因/基因組數(shù)據(jù),通過強大的分子進化分析和數(shù)據(jù)可視化功能,追蹤病毒的分子進化和時空傳播路線.本研究通過本地化部署Nextstrain平臺,利用Nextstrain平臺的augur 病原體生物信息分析包,分別對E18 的VP1和全基因組序列進行分子進化分析,步驟如下:

(1)從VIPR 病毒數(shù)據(jù)庫[36](https://www.viprbrc.org/brc)和NCBI Nucleotide 數(shù)據(jù)庫[27](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)中下載所有長度＞700 bp的E18 VP1 序列和長度＞7 000 bp 的基因組序列,剔除信息不全序列(無病毒毒株分離國家或時間信息等).采用MAFFT 7[37]在線平臺(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server)進行多重序列比對,人工剔除異常序列(例如多重序列比對后通過人工核查發(fā)現(xiàn)存在蛋白質(zhì)翻譯錯誤,序列中存在超過3 個模糊堿基).最終獲得285 條E18 的VP1 序列和63 條基因組序列.

(2)利用augur 病原體生物信息分析包進行生物信息學和分子進化分析.align 命令調(diào)用內(nèi)嵌的MAFFT 軟件[37]進行多重序列比對,tree 命令調(diào)用IQ-tree工具[38]構(gòu)建分子進化樹(最大似然法),refine命令調(diào)用TreeTime 工具[39]構(gòu)建基于時間尺度的分子進化樹并對進化樹進行優(yōu)化,clade 命令標注進化分支(clade)和確定分支突變.由于表位僅分布在VP1～VP3 上,因此只標注了VP1～VP3 上的分支突變.最后利用Nextstrain 平臺的auspice 工具進行基于JavaScript 技術(shù)的網(wǎng)頁互動可視化展示.

(3)將獲得的分支突變與表位、病毒受體結(jié)合位置利用RIVEM 工具[40-41]繪制在E18 衣殼表面結(jié)構(gòu)圖上,即足跡圖(roadmap),分析分支突變與表位以及受體結(jié)合之間的關(guān)系.新生兒 Fc 受體(Neonatal Fc Receptor,FcRn)是?？刹《竟灿玫拿撘職な荏w,埃可病毒借助FcRn 感染宿主細胞并釋放病毒基因組.雖然E18 的結(jié)合位置尚未確定,但E6 和E30 與FcRn 的結(jié)合位置已經(jīng)確定[19-20],可以通過序列比對的方式確定E18 的模擬結(jié)合位置.

2 結(jié)果

2.1 E18 的結(jié)構(gòu)蛋白特征和構(gòu)象表位預(yù)測結(jié)果

E18 病毒顆粒6HBG 的結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2 和VP3 的長度分別為287、260 和239 個氨基酸殘基,由8 條反向平行的β 鏈(βB-βI)構(gòu)成β 桶(β-barrel),鏈之間的部分為環(huán)區(qū)(loop),兩端為 N-端(Nterminus)和C-端(C-terminus),如圖1和圖2所標注.E18 的衣殼表面結(jié)構(gòu)如圖1 所示,衣殼表面有峽谷(canyon)、峽谷兩側(cè)的“邊緣”(rim)、“平臺”(puff)和“突起”(knob)等結(jié)構(gòu)特征以及五倍軸、三倍軸和二倍軸等三維結(jié)構(gòu)標記.

E18 構(gòu)象表位預(yù)測結(jié)果見表1 及圖1 和圖2.E18 共有27 個氨基酸殘基預(yù)測為表位,分布在VP1(BC 環(huán)、DE 環(huán)、HI 環(huán)和C-端)、VP2(EF 環(huán)和HI 環(huán))和VP3(N-端knob 區(qū)域、BC 環(huán)和C-端).與EV-A[17]和EV-D[31]相似,E18 的構(gòu)象表位也聚集成三簇(表1 和圖1): site 1、site 2 和site 3,分別位于峽谷的“北側(cè)邊緣”區(qū)域、峽谷南側(cè)的“平臺”區(qū)域、峽谷南側(cè)的“突起”區(qū)域和三倍軸區(qū)域.其中VP1 BC 環(huán)和C-端、VP2 EF 環(huán)是E18 表位的主要構(gòu)成區(qū)域.

表1 E18 構(gòu)象表位的預(yù)測結(jié)果

圖2 E18 結(jié)構(gòu)蛋白的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)注釋

2.2 E18 的分子進化分析

利用Nextstrain 平臺的augur 病原體生物信息分析包,分別構(gòu)建了基于E18基因組和VP1序列的時間尺度的分子進化樹,分別簡稱為基因組進化樹(圖3(a))和VP1進化樹(圖3(b)),兩者具有一致的拓撲結(jié)構(gòu),都分為A、B、C 三個進化分支,C 分支又分為C1 和C2 兩個子分支,原株Metcalf 不屬于任何一個分支.以序列數(shù)較多的VP1 進化樹為例,大約1946 年Metcalf 從A、B、C 三個分支的共同祖先A～C 中分歧出來,并于1955 年在美國首次分離.1970 年分子進化樹首先分歧出A 分支;1979 年又分歧出B 和C 分支;最后在1989 年C 分支分歧成C1 和C2 兩個子分支.C 分支尤其是C2 分支是目前流行的病毒分支.A 分支由2 株來自中國的病毒毒株構(gòu)成.B分支有1株來自埃塞俄比亞,其余都來自印度.C1 分支主要來自法國、德國、俄羅斯、瑞典和澳大利亞.C2 分支全球分布廣泛,其中分離病毒毒株數(shù)最多的國家為中國(168 株)、法國(14 株)、澳大利亞(14 株)、日本(13 株)和美國(7 株).

每個進化分支都有若干個決定進化分支的分支突變.以包含VP1～VP3 的基因組進化樹為例(圖3(a)),A 分支的分支突變?yōu)閂P1 C-端的T271A 和D275E,B 分支的分支突變?yōu)閂P1 C-端的K271S、A285V 和T286S.C1 的分支突變包括VP1 C-端的D275E 以及R6K、VP2 EF 環(huán)的S159P、VP3 的V2I和H182N.C2 的分支突變包括VP1 C-端的G257S、A262V、A285V 以及I42L 和I92V,VP2 的T74S,VP3 knob 的V58I 以及N11T.從圖3(a)可以發(fā)現(xiàn),分子進化樹上多數(shù)(61.2%)的分支突變都位于表位處,即分支進化伴隨著表位處的氨基酸突變,尤其是VP1 C-端是突變熱點區(qū)域.此外,還有VP2 的EF 環(huán).VP1 進化樹(圖3(b))也表現(xiàn)為高度一致,絕大多數(shù)分支突變在兩種進化樹上分布一致,但由于序列數(shù)目差異較大(285 比63),個別分支突變產(chǎn)生了差異,例如VP1 進化樹B～C 分支上的突變D129E 成為基因組進化樹C 分支上的突變.

圖3 E18 的分子進化樹

利用足跡圖(圖4)將上述分支突變與表位、受體結(jié)合位置都標注在E18 的衣殼表面結(jié)構(gòu)圖上,分析三者之間的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn),大多數(shù)E18衣殼表面的分支突變(黑色實線圈)都位于表位上或附近,而且表位的3 個site 均被突變覆蓋;受體FcRn 模擬結(jié)合位置(白色虛線橢圓)僅有2 個突變.這提示表位處的突變產(chǎn)生了新的進化分支,但盡量避開受體結(jié)合位置,以免影響病毒與宿主細胞的結(jié)合能力.這兩個突變位點對受體結(jié)合能力的影響需要進一步實驗研究.

圖4 E18 足跡圖

3 討論

病毒構(gòu)象表位測定的金標準是冷凍電鏡技術(shù)[19-20,23],但冷凍電鏡技術(shù)門檻高,現(xiàn)階段難以常規(guī)應(yīng)用.免疫逃避實驗是傳統(tǒng)測定構(gòu)象表位的常用方法[42-43],但只能通過突變體確定部分表位,同時也費時費力.生物信息學算法具有高通量和相對準確的特點,能夠為實驗性研究提供候選靶標,輔助實驗性研究.傳統(tǒng)的生物信息學表位預(yù)測算法具有普適性,但如果直接用來預(yù)測腸道病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的表位,由于未考慮“結(jié)構(gòu)蛋白嵌在衣殼中”這個生物學結(jié)構(gòu)特征,預(yù)測結(jié)果必然有大量的假陽性[17,30,44].本研究使用實驗室前期發(fā)展的表位預(yù)測算法,其最大優(yōu)勢在于將生物信息學算法和腸道病毒的衣殼結(jié)構(gòu)特征密切結(jié)合,大大提高了算法的可靠性[17].在不同腸道病毒種型(EV-A 和EV-D)表位預(yù)測的實際應(yīng)用中,通過對比實驗結(jié)果可以確認算法具有較高的準確性[17,31].當然,生物信息學算法不可避免地存在自身的缺陷和限制.例如,算法僅能對已測定三維結(jié)構(gòu)的腸道病毒進行表位預(yù)測;算法的精確性受到三維結(jié)構(gòu)精確性的嚴重影響;算法的預(yù)測原理基于表位的病毒學假設(shè)(衣殼表面突出區(qū)域更易與抗體或受體結(jié)合),而這種假設(shè)需要在實踐中通過實驗性研究不斷驗證和改進,算法也隨之更新.

作為EV-B 代表性血清型之一的E18,它的構(gòu)象表位與EV-A(EV-A71 和CV-A16[17])和EV-D(EV-D68[31])一樣呈現(xiàn)三簇分布規(guī)律.VP1 BC 環(huán)和C-端、VP2 EF 環(huán)是腸道病毒共有的表位,VP1 GH環(huán)是EV-A 特有的表位,VP1 DE 環(huán)是EV-D 特有的表位,E18 則未發(fā)現(xiàn)特異性表位.即使表位分布高度相似,但表位上的氨基酸突變決定了不同血清型腸道病毒的抗原性差異[17,45].與EV-D68[31]相似,VP1 C-端和VP2 EF 環(huán)是E18 的突變熱點區(qū)域,每一個E18 進化分支的形成都伴隨著氨基酸突變.目前尚未見能中和E18 的單克隆抗體(單抗)的相關(guān)報道,但同屬EV-B 的E30 已報道有兩個單抗4B10和6C5[46].單抗4B10 主要結(jié)合E30 峽谷南側(cè)的VP1 C-端和VP2 EF 環(huán),單抗6C5 結(jié)合位點包括峽谷北側(cè)的VP1 BC 環(huán)、DE 環(huán)、EF 環(huán)和HI 環(huán),而這些位點大多數(shù)都是E18 的表位區(qū)域,提示這些表位區(qū)域易與單抗結(jié)合.

本研究分別基于E18 的VP1 和基因組序列構(gòu)建了時間尺度的分子進化樹.VP1 進化樹包含的序列數(shù)較多(285 條),能夠更加準確地確定進化關(guān)系和推斷分歧時間,但VP1 進化樹僅能獲得VP1 上的分支突變.基因組進化樹雖然序列數(shù)較少(63 條),但能獲得VP1～VP3 上的分支突變.基因組進化樹和VP1 進化樹具有高度一致的拓撲結(jié)構(gòu)和VP1 上的分支突變,一方面證明本研究確定的分支突變高度可靠,另一方面基因組進化樹補充了VP1 進化樹缺乏的VP2 和VP3 上的分支突變,尤其是VP2 EF 環(huán)和VP3 knob 這兩個重要表位區(qū)域.參照Chen 等[11,13]研究結(jié)果,將E18 分為A、B、C 三個主要分支,原株Metcalf 未劃入任何分支.相較于A 分支和B 分支,C 分支是E18 的主要流行分支,96.8%分離的病毒毒株都屬于C 分支.C 分支分為C1 分支和C2 分支,其中C1 分支在2013 年后未再流行,而C2 分支病毒毒株廣泛分離于近年來的病毒性腦膜炎和手足口病疫情中,提示C2 分支可能具有較強的傳染力和毒力,但尚未有E18傳染力和毒力的進一步研究報道.分子進化樹(圖3)顯示,E18 進化分支的形成伴隨著表位處的氨基酸突變,尤其是VP1 C-端和VP2 EF 環(huán)是突變熱點區(qū)域.之前的研究發(fā)現(xiàn)[4-5,11]多個VP1 上的多個重要突變位點,包括R6K、N10D、R84N、M104L、Y215F、I216V、V262T/A 和D275E 等.VP1 BC 環(huán)是E18重要的表位區(qū)域(圖1 和圖2).有研究發(fā)現(xiàn)[17,31],VP1 BC 環(huán)是EV-A 和EV-D 共有的重要表位.BC環(huán)上的R84N 是C 分支的分支突變,A 和B 分支均為R,幾乎所有C 分支均為N(2 株為S),進一步驗證了表位VP1 BC 環(huán)對腸道病毒的重要性.K6R 和T262V 是C2 的分支突變,D275E 則是C1 的分支突變(圖3).從Nextstrain平臺構(gòu)建的VP1 進化樹上可以清晰看到,D10N、Y215F、I216V、S257G 和H287R 都是C2 分支中國株的標志性氨基酸突變,M104L 則是其中一大簇病毒毒株上的標志性突變.E18 的分子進化分析,一方面從另一個角度間接地驗證了表位預(yù)測的準確性,另一方面也提示表位處的重要氨基酸突變及相應(yīng)病毒毒株的時空傳播路線是腸道病毒監(jiān)測和預(yù)警分析的重點.

對于流感病毒和冠狀病毒,由于接種疫苗和廣泛感染產(chǎn)生群體免疫,使得病毒處于正選擇進化壓力下,因此不僅表位突變頻繁,而且受體結(jié)合區(qū)域也存在廣泛突變,從而產(chǎn)生免疫逃避[47-48].而對于腸道病毒,由于新生兒不斷補充易感群體[49],使得多數(shù)腸道病毒并沒有面臨顯著的進化壓力,因此相對突變速率要慢一些(E18 的VP1 約為5.6×10-3替換·(位點·a)-1,與其他腸道病毒相似),在表位區(qū)域存在較弱的正選擇壓力,其他區(qū)域則偏向中性進化[50].E18 受體結(jié)合區(qū)域也更加保守,其足跡圖提供了佐證.但隨著E18 的廣泛流行,人群血清中普遍存在中和抗體,病毒面臨越來越強的正選擇壓力,表位也會突變得更加頻繁,需要密切監(jiān)測其抗原性是否會發(fā)生較大改變,出現(xiàn)類似EVA71 那樣的大規(guī)模疫情[51].

生物信息學在流感病毒的優(yōu)勢病毒毒株預(yù)測方面取得了巨大成功[52-54],為流感疫苗的研發(fā)和準備提供了重要的技術(shù)支撐.對腸道病毒表位生物信息學的研究,可為進一步通過實驗鑒定構(gòu)象表位、病毒的監(jiān)測和預(yù)警以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)提供重要支持.