鄒峰余 韓亞康 羅 智 趙 濤 徐杰杰 譚肖英

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

魚粉(FM)具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸(AA)組成平衡、富含不飽和脂肪酸、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低等優(yōu)點(diǎn), 是水產(chǎn)動(dòng)物尤其是肉食性魚類的最佳蛋白質(zhì)來源。然而, 由于魚粉在水產(chǎn)行業(yè)中的大量使用,導(dǎo)致其資源緊缺, 需求與價(jià)格不斷上漲, 從而難以滿足水產(chǎn)行業(yè)日益增長的生產(chǎn)需求, 限制了水產(chǎn)飼料工業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)的快速、可持續(xù)發(fā)展[1]。不僅如此, 過度使用魚粉還會導(dǎo)致一系列的環(huán)境問題。在這種情況下, 尋找并開發(fā)一種可靠的植物蛋白源來替代魚粉成為當(dāng)今水產(chǎn)行業(yè)的熱點(diǎn)問題。棉籽粕是水產(chǎn)飼料中常見的植物蛋白來源。許多研究評價(jià)了棉籽粕作為魚粉替代品在草魚 (Ctenopharyngodon idella)[2]、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)[3]和大菱鲆 (Scophthalmus maximus)[4]中的作用。菜籽粕(RSM)由于蛋白質(zhì)含量高, 消化率高, 被認(rèn)為是魚粉的合適替代蛋白質(zhì)[5]。這兩種植物蛋白源被廣泛使用于替代魚粉作為水產(chǎn)飼料原料。然而棉籽粕用于飼料原料受游離棉酚、環(huán)丙烯脂肪酸的存在及賴氨酸和蛋氨酸含量低的限制[6]而菜籽粕中賴氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量較低, 并且含有各種抗?fàn)I養(yǎng)因子, 如硫代葡萄糖苷、芥酸、植酸、單寧和芥子堿, 這些都會對生長和新陳代謝產(chǎn)生負(fù)面影響[7]。

肌肉是復(fù)雜的機(jī)體組織, 是魚類軀干的主要可食部分。魚類肌肉生長是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程, 涉及肌纖維的增生和肥大, 是在肌源性調(diào)節(jié)因子(MRFs)和肌生長抑制素(MSTN)等一系列轉(zhuǎn)錄因子的控制下進(jìn)行的[8]。MRFs包括Myod、Myf5、Mrf4和Myog,在成肌細(xì)胞增殖和分化中起關(guān)鍵作用[9]。MSTN通過抑制魚的肌肉發(fā)生, 起到肌肉生長的負(fù)調(diào)控作用[10]。此外, 肌肉生長增加的過程還與蛋白質(zhì)積累有關(guān)[11]。肌肉的蛋白質(zhì)沉積是蛋白質(zhì)合成與降解平衡的結(jié)果。先前的研究表明, 在大鼠(Rattus norregicus)和虹鱒中, 雷帕霉素(TOR)的靶點(diǎn)是PI3K/AKT通路的下游成分, 在蛋白合成中起關(guān)鍵作用。TOR調(diào)節(jié)其下游效應(yīng)體核糖體S6激酶1(S6K1)和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1 (4E-BP1)的磷酸化, 最終促進(jìn)魚的蛋白質(zhì)合成[12]。

同時(shí), 隨著消費(fèi)者健康意識的提高, 人們越來越重視肉的品質(zhì)和營養(yǎng)成分。因此, 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)越來越關(guān)注飼養(yǎng)管理、飼料組成和應(yīng)激反應(yīng)等多種外部因素對魚類肌肉質(zhì)量的影響[13—15]。魚肉品質(zhì)受營養(yǎng)成分、理化和質(zhì)地參數(shù)等多方面的影響。營養(yǎng)成分主要表現(xiàn)為肌肉蛋白質(zhì)和脂肪含量。此外, 理化指標(biāo)例如羥脯氨酸含量, 以及質(zhì)地參數(shù)(硬度、彈性、內(nèi)聚性、黏性、咀嚼性和回彈性)也是衡量肉質(zhì)的重要指標(biāo)。

以往關(guān)于植物蛋白源替代魚粉的研究主要集中在生長性能、腸道健康、抗氧化和免疫等方面,而對肌肉生長以及肉質(zhì)影響的研究較少。在草魚中發(fā)現(xiàn), 使用高比例的菜粕(27%)以及棉粕(27%)混合替代魚粉以及豆粕后, 對草魚的生長性能和肉質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[16]。在草魚飼料中添加不超過15%的苜蓿草粉時(shí), 對其生長性能無顯著影響, 且能提高其肌肉品質(zhì)及血清抗氧化能力[17]。在大口黑鱸(Micropterus salmoides)中, 當(dāng)用濃縮棉籽蛋白(CPC)替代日糧中70%的魚粉, 會對其生長性能以及肉質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響[18]。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是一種淡水特種經(jīng)濟(jì)魚類, 廣泛分布于我國各大水系中, 其肌肉蛋白高且脂肪少, 營養(yǎng)豐富, 肉質(zhì)鮮美, 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)以黃顙魚為研究對象, 測定肌肉組織營養(yǎng)成分、肌纖維直徑、肌肉質(zhì)構(gòu)、肌纖維發(fā)育相關(guān)基因和TOR通路相關(guān)基因表達(dá)以及抗氧化指標(biāo), 旨在探究菜粕和棉粕復(fù)合替代飼料中魚粉對黃顙魚肌肉組織發(fā)育性能及肌肉品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用魚及飼養(yǎng)管理

黃顙魚幼魚選自湖北省武漢市某漁場。在正式試驗(yàn)開始前, 黃顙魚幼魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)2周, 對其進(jìn)行馴化。在暫養(yǎng)結(jié)束后, 選擇體質(zhì)健康、規(guī)格均勻、平均體重為(2.38±0.10) g的黃顙魚幼魚450尾, 隨機(jī)分成5個(gè)組, 每組3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)30尾, 放入15個(gè)圓形養(yǎng)殖桶中。養(yǎng)殖采用脫氯自來水, 并且持續(xù)曝氣至溶氧飽和。在試驗(yàn)期間, 每天人工定時(shí)投喂2次(08:30和16:30), 投喂至飽食(表1),投喂前清理缸內(nèi)糞便, 持續(xù)10周。每2周稱重1次,并且徹底清理魚缸；每天記錄死魚的數(shù)量及飼料攝食量。養(yǎng)殖期間每周兩次測定水質(zhì)參數(shù), 控制水溫在28.3—29.4℃, 溶解氧濃度約為6.37—6.67 mg/L, NH4-N不超過0.1 mg/L。

表1 試驗(yàn)飼料配方及主要營養(yǎng)物質(zhì)Tab.1 Ingredients and proximate compositions of the experimental diets (g/kg dry matter)

1.2 樣品采集

在飼喂試驗(yàn)結(jié)束時(shí), 禁食24h后對每個(gè)魚缸中的魚進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。然后每個(gè)魚缸隨機(jī)選取12尾魚, 在放有50 mg/L苯佐卡因的桶中麻醉。取其中6尾魚的左側(cè)肌肉樣本, –20℃冷凍保存, 用于肌肉成分分析。同時(shí), 從這6尾魚的右側(cè)取得肌肉樣品, 測定理化指標(biāo)。另外6尾魚的左側(cè)肌肉標(biāo)本在液氮中急速冷凍過后, –80℃保存, 用于酶活性、基因表達(dá)等分析。此外, 將其中3尾魚的右側(cè)肌肉用模具切成1 cm×1 cm×1 cm的肌肉塊, 用于紋理參數(shù)的測定。另外取2尾魚右側(cè)肌肉用于組織學(xué)分析。

1.3 粗成分以及羥脯氨酸含量測定

黃顙魚肌肉進(jìn)行水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分的分析。樣品在105℃烘干至恒重后求得水分含量; 粗蛋白的測定采用全自動(dòng)定氮儀(N/6.2); 用索氏抽提法以乙醚為抽提劑測定粗脂肪含量; 在電爐上將樣品炭化后, 于馬福爐中(550℃)灼燒12h測得樣品灰分。采用Periago等[19]報(bào)道的方法測定肌肉羥脯氨酸含量, 將肌肉樣品酸水解后, 用分光光度法測定其中羥脯氨酸氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛反應(yīng)后的產(chǎn)物, 從而測算羥脯氨酸含量。

1.4 肌肉質(zhì)構(gòu)的測定

采用TA.XT PLUS 質(zhì)構(gòu)儀(Stable Micro Systems, 戈德爾明, 英國)進(jìn)行魚肉組織分析，以質(zhì)構(gòu)剖面分析法測定肌肉組織的質(zhì)構(gòu)特性(TPA9)[20]。每個(gè)缸選取大小相近的3尾魚取同一位置的背部肌肉, 于室溫下以8 mm圓柱形探針測定肌肉組織的硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性和彈性等指標(biāo)。

1.5 組織學(xué)分析

石蠟包埋白色肌肉橫斷面(5 μm), 蘇木精-伊紅染色評價(jià)肌肉形態(tài)。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片, 利用Image J軟件, 測量每尾魚各切片約300個(gè)相鄰肌纖維的數(shù)量和直徑。將肌纖維分為3個(gè)直徑范圍(≤20 μm, 20—50 μm, 以及≥50 μm)。肌纖維頻率表示為每一種直徑級別肌纖維的數(shù)量占肌纖維總數(shù)的比率。

1.6 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析

參考文獻(xiàn)方法[21], 黃顙魚肌肉總RNA的提取按照說明書進(jìn)行, 通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測其質(zhì)量, 使用Nanodrop ND-2000(NanoDrop Technolo-gies, 美國)分光光度計(jì)測定其濃度和純度, 根據(jù)TaKaRa(中國, 大連)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書, 合成第一鏈cDNA, 保存于–20℃。熒光定量引物在表2中給出, 選擇了6個(gè)管家基因(β-actin、b2m、rpl7、hprt、ubce、18S RNA和gadph)檢測轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性。使用(https://genorm.cmgg.be/)geNorm分析,rpl7和gadph的基因表達(dá)水平最為穩(wěn)定。因此, 將基因表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為rpl7和gadph的幾何平均值, 通過2–??Ct方法計(jì)算相對表達(dá)相對于對照的倍數(shù)變化。

表2 熒光定量引物Tab.2 Primers used for real-time PCR

1.7 抗氧化酶活和脂質(zhì)過氧化分析

丙二醛(Malondialdehyde, MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase, TSOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(Catalase, CAT)測定試劑盒和總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司, 測定操作按說明書進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析, 以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示結(jié)果。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析前, 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)評估不同處理的正態(tài)性。各處理組間顯著性使用單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn),P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異, 采用不同字母表示不同水平替代飼喂組間差異顯著性。此外, 進(jìn)行了線性以及二次項(xiàng)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 肌肉粗成分及羥脯氨酸含量

由表3可知, 隨著飼料中的棉粕和菜粕的混合替代升高, 肌肉中的粗蛋白和粗脂肪含量下降, 其中, 對照組和RM10 組無顯著差異, 而當(dāng)替代水平達(dá)到20%及以上時(shí), 粗蛋白和粗脂肪含量顯著性降低, 而水分與灰分則在各組中無顯著差異。此外,肌肉中的羥脯氨酸含量隨著替代水平升高而下降。

表3 不同水平復(fù)合植物蛋白源替代魚粉后黃顙魚肌肉粗成分、羥脯氨酸含量(鮮重基礎(chǔ))Tab.3 The crude composition and hydroxyproline content of yellow catfish muscle after replacing fish meal with mixed plant protein sources at different levels (wet weight basis)

2.2 肌肉質(zhì)構(gòu)以及肌纖維直徑級別分布

如圖1和表4所示, 菜粕和棉粕的混合替代影響了肌肉的微觀結(jié)構(gòu), 替代組的肌纖維直徑小于對照組, 定量結(jié)果顯示, 直徑大于等于50 μm的肌纖維的數(shù)量隨著替代水平升高而降低, 而直徑小于20 μm的纖維數(shù)量則呈現(xiàn)上升趨勢。RM10組與對照組中直徑大于等于50 μm的肌纖維數(shù)量沒有顯著性差異, 其他試驗(yàn)組的顯著降低。

表4 黃顙魚肌肉纖維直徑頻率百分比Tab.4 Muscle fibers cellularity and percentage frequency of yellow catfish

圖1 不同水平混合植物蛋白源替代魚粉對白肌橫斷面顯微結(jié)構(gòu)影響Fig.1 The effect of different levels of mixed plant protein sources in place of fish meal on the microstructure of white muscle cross-section

試驗(yàn)黃顙魚肌肉硬度在各組間沒有顯著差異,RM40組的彈性以及咀嚼性顯著高于對照組, RM10以及RM20組的內(nèi)聚力以及黏性顯著高于其他組,對照組以及RM30替代組的黃顙魚肌肉回復(fù)力顯著高于其他組(表5)。

表5 不同水平混合植物蛋白源替代魚粉對黃顙魚肌肉質(zhì)構(gòu)影響Tab.5 The effect of different levels of mixed plant protein sources in place of fish meal on the muscle texture of yellow catfish

2.3 肌肉發(fā)育相關(guān)基因及蛋白代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

飼料中混合植物蛋白源替代魚粉后顯著降低了akt1、mtorc1和s6k1的mRNA水平, 升高了4ebp1的mRNA水平。肌肉纖維發(fā)育相關(guān)基因myod、myog和mrf4的mRNA水平隨著替代水平升高逐漸升高,而myf5與mstn的基因表達(dá)在各組間無顯著差異(圖2)。

圖2 飼料中混合植物蛋白源替代魚粉對黃顙魚肌肉中TOR通路及肌纖維發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of mixed plant protein sources in place of fish meal on the expression of TOR pathway and muscle fiber developmentrelated genes in the muscle of yellow catfish

2.4 肌肉組織抗氧化能力及氧化損傷

RM10組黃顙魚肌肉中的MDA含量、CAT及T-AOC活性與對照組沒有顯著性差異。當(dāng)菜粕和棉粕混合替代20%及以上水平魚粉時(shí), 黃顙魚肌肉組織的T-SOD和CAT活性下降, 總抗氧化能力(TAOC)顯著性下降, MDA含量顯著性上升(表6)。

表6 黃顙魚肌肉抗氧化能力以及MDA水平Tab.6 Antioxidant ability and MDA level of yellow catfish muscle

3 討論

3.1 復(fù)合植物蛋白源替代對魚類肌肉營養(yǎng)成分及羥脯氨酸含量的影響

魚肉的品質(zhì)一部分反映在消費(fèi)者所關(guān)心的營養(yǎng)價(jià)值上, 蛋白質(zhì)及脂肪含量代表了肉的主要營養(yǎng)價(jià)值, 在本研究中隨著混合植物蛋白源替代魚粉的水平達(dá)到20%及以上時(shí), 肌肉中的粗脂肪和粗蛋白呈現(xiàn)下降的趨勢。究其原因可能是由于菜粕及棉粕當(dāng)中的氨基酸不平衡, 尤其是必需氨基酸中賴氨酸和蛋氨酸的相對缺乏, 以及抗?fàn)I養(yǎng)因子如游離棉酚、植酸、單寧和硫代葡萄糖苷等導(dǎo)致魚體對于飼料當(dāng)中的營養(yǎng)物質(zhì)吸收及利用率下降。Johnston等[22]報(bào)道, 肉的硬度一部分上可以由肌肉膠原蛋白含量所影響。羥脯氨酸是膠原蛋白中的主要氨基酸, 常用于反映組織中膠原蛋白含量, 膠原蛋白通過維持肌肉組織的完整性來影響肌肉質(zhì)地, 本研究發(fā)現(xiàn), 飼料中混合植物蛋白源替代后魚粉后會導(dǎo)致肌肉組織中羥脯氨酸的含量下降, 間接反應(yīng)肌肉中膠原蛋白含量的下降, 從而不利于肉質(zhì)。

3.2 復(fù)合植物蛋白源替代對魚類肌肉質(zhì)構(gòu)及肌纖維直徑的影響

此外, 肌肉質(zhì)地特征如硬度、彈性、黏性、內(nèi)聚力、咀嚼性和回復(fù)性是評價(jià)魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn), 混合植物蛋白源替代對于黃顙魚的肌肉硬度無顯著性影響, 另外, 替代增加了肉的彈性、內(nèi)聚力和咀嚼性, 與草魚中的研究結(jié)果部分相似[17], 此結(jié)果說明混合植物蛋白源替代對黃顙魚肌肉質(zhì)構(gòu)有一定的影響, 這些影響可能是由于菜粕和棉粕飼料中的氨基酸不平衡及抗?fàn)I養(yǎng)因子使肌肉組織的結(jié)構(gòu)與組成發(fā)生變化所導(dǎo)致的[23,24]。此外, 肌肉纖維直徑對肉的質(zhì)地特征有很大影響[15]。肉的硬度與白肌纖維的直徑呈負(fù)相關(guān), 因?yàn)榕c較軟的肉相比, 硬肉的肌肉纖維較小[25]。在我們的研究結(jié)果中, 植物蛋白源過度替代會導(dǎo)致黃顙魚肌肉纖維中直徑≥50 μm的纖維頻率下降, 此結(jié)果表明了復(fù)合蛋白源的過度替代導(dǎo)致的氨基酸不平衡及抗?fàn)I養(yǎng)因子的毒性作用可能會通過阻礙肌纖維肥大過程來影響魚肉的質(zhì)地并且損害肌肉的生長。

3.3 復(fù)合植物蛋白源替代對魚類肌肉發(fā)育相關(guān)基因的影響

此外, 與對照組相比, 替代組的大部分肌肉發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢, 這種上升趨勢反映了替代后肌肉發(fā)生再生的可能性較大, 可能提示著機(jī)體產(chǎn)生更多的肌肉細(xì)胞來補(bǔ)償菜籽粕和棉籽粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子所造成的損傷。有相關(guān)研究報(bào)道,用抗?fàn)I養(yǎng)因子更低的發(fā)酵植物蛋白源替代日糧中菜粕, 會導(dǎo)致草魚肌肉中更低的MRFs的基因表達(dá)量[26]。據(jù)Alami-Durante等[27]報(bào)道, 蛋氨酸缺乏會導(dǎo)致虹鱒肌肉中的myf5、myod和mrf4等基因的表達(dá)顯著上升。此外, 還有研究報(bào)道,MRFs基因的表達(dá)是對肌肉重量減少以及肌肉損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)[28], 同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn), 隨著替代水平上升, 肌纖維中≤20 μm的纖維數(shù)量出現(xiàn)上升, 這些都側(cè)面映證菜粕與棉粕的過量替代可能會導(dǎo)致黃顙魚肌肉生長性能下降及產(chǎn)生生理損傷。

3.4 復(fù)合植物蛋白源替代對魚類蛋白代謝相關(guān)基因的影響

TOR是AKT/PI3K途徑的下游成分, 在TOR信號通路被激活后, 可以通過抑制4E-BP1的活性、激活S6K1的活性來促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯[12]。4E-BP1是一種小分子轉(zhuǎn)錄抑制劑, 會抑制蛋白質(zhì)的翻譯啟動(dòng)。本研究發(fā)現(xiàn)植物蛋白源過度替代魚粉會導(dǎo)致黃顙魚肌肉中tor基因的相對表達(dá)量顯著下降, 這與肝臟的報(bào)道結(jié)果類似[29]。此外, 植物蛋白源下調(diào)了下s6k1基因的表達(dá), 上調(diào)4e-bp1的表達(dá), 因此, 這可能是導(dǎo)致肌肉中蛋白質(zhì)含量下降, 肌纖維直徑減小的潛在分子機(jī)制。

3.5 復(fù)合植物蛋白源替代對魚類肌肉抗氧化能力及氧化損傷的影響

肌肉品質(zhì)與肌肉的氧化損傷程度密切相關(guān),SOD和CAT是抗氧化防御的第一道防線, SOD催化O2–轉(zhuǎn)化為H2O2, 而后CAT催化H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[30]。目前, 關(guān)于飼料中植物蛋白源對于魚類肌肉抗氧化性能的研究較少, 相關(guān)研究表明, 植物蛋白源中的抗?fàn)I養(yǎng)因子對魚類的抗氧化酶以及免疫系統(tǒng)產(chǎn)生危害, 從而損害健康,抑制生長[31]。在本研究中, 隨著復(fù)合植物蛋白源替代水平升高, 黃顙魚肌肉中T-SOD及CAT活性下降,T-AOC也同樣隨之下降。這些指標(biāo)的變化表明肌肉組織抗氧化能力下降, 并且導(dǎo)致MDA水平的上升, MDA是機(jī)體中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物, 脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物, 能間接反應(yīng)機(jī)體氧化損傷的程度。肌肉組織中這種抗氧化能力下降, 產(chǎn)生氧化損傷的原因可能要?dú)w因于菜粕及棉粕中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究以黃顙魚為研究對象, 圍繞菜粕與棉粕復(fù)合替代對黃顙魚的肌肉生長以及肌肉品質(zhì)展開研究, 基于試驗(yàn)結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn), 從黃顙魚肌肉的生長與品質(zhì)角度來看, 菜粕與棉粕復(fù)合替代水平在10%左右是最適宜的。而高水平替代會導(dǎo)致肌肉組織中的TOR通路基因表達(dá)下調(diào), 肌纖維調(diào)控相關(guān)基因發(fā)生紊亂, 以及抗氧化能力下降引起的氧化損傷, 表現(xiàn)為肌肉組織中營養(yǎng)成分的下降, 肌纖維肥大的受阻, 從而不利于肌肉的生長及品質(zhì)。