熊雅萍 馬慧妹 胡蓓娟 邱齊駿 洪一江

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031; 2.江西省水產(chǎn)動物資源與利用重點實驗室, 南昌 330031;3.撫州市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 撫州 334000)

軟體動物是海洋生物中最大、物種最豐富的門之一[1]。幾個世紀以來, 軟體動物貝殼的進化起源、結(jié)構(gòu)、模式和物理性質(zhì)一直是科學(xué)家關(guān)注的焦點。而貝殼是由95%—99%的碳酸鈣晶體和少于5%的有機質(zhì)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、糖蛋白、多糖和脂質(zhì))組成的多層結(jié)構(gòu)(棱柱層和珍珠層), 由貝類外套膜分泌的有機質(zhì)基質(zhì)和碳酸鈣晶體結(jié)合而成, 珍珠是倒轉(zhuǎn)過來的貝殼[2,3]。Cuif等[4]在對珍珠的結(jié)構(gòu)觀察后發(fā)現(xiàn), 棱柱層位于珍珠核部分, 珍珠層在外部, 碳酸鈣和不同的基質(zhì)蛋白形成不同的結(jié)晶, 其中棱柱層由方解石晶體構(gòu)成, 珍珠層由文石晶體構(gòu)成。外套膜分泌的有機質(zhì)基質(zhì)在碳酸鈣生物礦化中具有奇特的調(diào)節(jié)作用[5], 且珍珠層具有有序規(guī)則的平面隔室結(jié)構(gòu), 幾乎每個隔室中的文石晶體都垂直珍珠層平面的C軸方向[6], 雖然對珍珠形成的研究頗多[7—9], 但具體調(diào)控過程仍不清楚。

珍珠形成過程從中參與珍珠質(zhì)形成的基因有很多, 包括PIF、MSI60和Pearlin等[9]。其中, Pif是一種酸性基質(zhì)蛋白, 是珍珠形成的關(guān)鍵大分子, 參與文石的形成、珍珠層中文石片的結(jié)晶和隨后的堆積[10,11]。Suzuki等[7]發(fā)現(xiàn)在合浦珠母貝(Pinctada fucata)中PifcDNA編碼一個前體蛋白, 經(jīng)翻譯后裂解生成Pif 97和Pif 80。Pif 97具有兩個保守的功能域, 即血管性血友病因子A型(VWA)域和幾丁質(zhì)結(jié)合域, 它們可以結(jié)合幾丁質(zhì)微纖維并與其他蛋白質(zhì)相互作用,而Pif 80具有一些文石結(jié)合活性[7]。含有VWA蛋白質(zhì)的相互作用調(diào)節(jié)功能可能是形成貝殼基質(zhì)蛋白復(fù)合物的關(guān)鍵機制[12], 而Pif基因同時具有VWA結(jié)構(gòu)域和幾丁質(zhì)結(jié)合域共同作用, 可以將Pif97和Pif80、N16等其他與珍珠層形成相關(guān)的蛋白相互結(jié)合排列沉積, 從而形成有機框架, 并形成層狀珍珠層[13]。有研究表明Pif除了與珍珠層的形成有關(guān)外, 該基因的表達水平跟分泌珍珠質(zhì)的速率密切相關(guān)[14]。池蝶蚌中缺乏對Pif基因的研究, 影響了我們對池蝶蚌中Pif基因在形成珍珠過程中其功能的理解。

池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是一種淡水育珠蚌, 具有生長快、外套膜厚、抗病能力強等特點,所產(chǎn)珍珠優(yōu)珠率高, 是我國主要的淡水育珠蚌之一[15]。目前關(guān)于池蝶蚌育珠機制研究較少, 本實驗通過對池蝶蚌中的Pif基因進行分子全長的克隆和其表達分析, 探討HsPif的序列特征及其相關(guān)功能, 為今后池蝶蚌的養(yǎng)殖與育珠提供更多科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗中所用未進行植核的、張閉有力的3齡健康池蝶蚌取自江西省撫州市水產(chǎn)科學(xué)研究所國家級池蝶蚌良種場, 從良種場取回后放入已曝氣的水箱中暫養(yǎng)1周, 以適應(yīng)新環(huán)境, 每2天換1次水。植核池蝶蚌取自于江西萬年夏清華珠寶有限公司。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

以TRIzol提取法從池蝶蚌的外套膜中提取總RNA, 用于qPCR的RNA則需從池蝶蚌的10個組織獲得, 10個組織分別為血細胞、性腺、肝胰腺、腎臟、鰓、閉殼肌、外套膜、斧足、腸道和心臟; 根據(jù)Prime Script? RT reagent Κit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒說明書要求合成qPCR所需的cDNA模板。

1.3 HsPif基因的全長克隆和測序

根據(jù)高通量轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選出HsPif基因的部分片段, 利用Primer 5.0設(shè)計中間片段擴增引物(F:5′-CAATGTCTCTCTGTCTCAAT-3′; R:5′-AT TCCAAGATTCAACTCCGT-3′)。隨后用各組織模板進行PCR擴增, 瓊脂凝膠電泳檢測后, 按照DNA回收試劑盒(OMEGA)說明書進行切膠回收,將得到的產(chǎn)物與pMD19-T載體連接, 于含Apm+培養(yǎng)基中培養(yǎng), 送至上海生物工程技術(shù)有限公司測序。比對分析獲得HsPif基因中間序列, 再根據(jù)該序列設(shè)計RACE-PCR引物(5′-RACE 1: 5′-CGGTG AGAACAATTCCAATCTG-3′; 5′-RACE 2: 5′-AGACT CCGTAATCCAAGATAAG-3′; 3′-RACE1: 5′-AATT CGCTTGTGTCTGTCTTCG-3′; 3′-RACE 2: 5′-GCCGA GTCATCAAGTTCAGACG -3′)。根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′ Kit User Manual試劑盒的要求合成HsPif基因5′端和3′端序列, 再與HsPif基因中間序列進行拼接, 從而獲得HsPif基因全長cDNA序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)在線工具分析池蝶蚌HsPif基因,使用Clustal W1.81進行氨基酸序列的比對, NCBI(ORF finder, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffin der/)上查找開放閱讀框, 分析蛋白結(jié)構(gòu), 推導(dǎo)氨基酸序列和比對氨基酸同源性。系統(tǒng)進化樹用軟件MEGA7.0中的NJ法構(gòu)建。

1.5 池蝶蚌各組織中HsPif的表達分析

分別提取池蝶蚌血細胞、性腺、肝胰腺、腎臟、鰓、閉殼肌、外套膜、斧足、腸道和心臟10個組織的總RNA, 按照PrimeScript? RT reagent Κit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒說明書將所提RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。根據(jù)獲得的池蝶蚌HsPif基因設(shè)計熒光定量引物(F: 5′-CAATGTCTCTCTGT CTCAAT-3′; R: 5′-ATTCCAAGATTCAACTCCGT-3′), 以池蝶蚌β-actin(F: 5′-AAGGTTACGCCCT TCCTCAT-3′; R: 5′-GCCATTTCCTGCTCAAAGTC-3′)內(nèi)參基因, 進行熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)檢測HsPif基因在10個不同組織中的表達水平。數(shù)據(jù)處理采用2–??Ct方法, 利用Excel 和 GraphPad Prism 8.3.0分析作圖。

1.6 珍珠囊形成過程中HsPif的表達分析

篩選張口有力、個體差異小的健康2齡池蝶蚌進行植核手術(shù), 挑選大小、重量差異較小的由貝殼制成的圓形紐扣和由1齡池蝶蚌外套膜制成的1 mm方形小片, 插入池蝶蚌外套膜內(nèi), 植核手術(shù)完成后,將其放入同一水環(huán)境中養(yǎng)殖, 并在植核手術(shù)進行的0、7d、15d、30d、60d、90d和120d進行外套膜/珍珠囊取樣, qPCR檢測HsPif的表達量的變化。

制備探針: 設(shè)計HsPif基因的特異性引物F和R,其中R包含T7啟動子序列, 提取HsPif基因的重組質(zhì)粒, 以F(5′-TAATACGACTCACTATAGGGCAAT GTCTCTCTGTCTCAAT-3′)、R(5′-ATTCCAAG ATTCAACTCCGT-3′)為反應(yīng)引物, 以HsPif基因的重組質(zhì)粒模板進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng), 將切膠回收純化得到的產(chǎn)物作為體外轉(zhuǎn)錄的模板, 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)T7 High Efficiency Transcription Kit和DIG RNA Labeling Kit(Roche) 說明書進行, 純化按照Easy RNA Purification Kit 試劑盒說明書進行。

取池蝶蚌外套膜, 在通用型組織固定液中固定1h, 經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋, 切片厚度6—8 μm,切片脫蠟至水。雜交反應(yīng)參考Enhanced Sensitive ISH Detection KitⅡ (AP)(BOSTER)說明書稍作改正進行, 將雜交操作完成的切片置于熒光導(dǎo)致顯微鏡下觀察, 標記其雜交反應(yīng)發(fā)生位置和放大標尺。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理采用2–??Ct方法計算, 以SPSS軟件進行差異性分析, 用GraphPad Prism進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 HsPif基因蛋白氨基酸組成分析

將測序得到的中間片段、5′端和3′端的序列進行拼接, 得到HsPif基因的cDNA全長為3457 bp,5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)為485 bp, 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)為363 bp, ORF框3072 bp, 共編碼1023個氨基酸, 推測編碼HsPif97和HsPif80兩種蛋白。預(yù)測分子量為110.484 kD, 理論等電點為4.67, 該蛋白為酸性蛋白。運用生物信息學(xué)預(yù)測其氨基酸組成成分, 結(jié)果表明天冬氨酸(Asp)含量最高, 占12.5%, 組氨酸(His)含量最低, 占1.32%。

2.2 HsPif蛋白的親水性和疏水性分析

將得到的HsPif氨基酸序列于ExPASY網(wǎng)站進行親疏水性的分析, 結(jié)果顯示, 疏水氨基(Ala、Cys、Ile、Met、Leu、Phe、Val)占30.4%, 親水性氨基酸(Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr)占69.6%, 總平均親水性指數(shù)為–0.566, 故HsPif為親水性氨基酸。

2.3 HsPif蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

使用NCBI網(wǎng)站中的SMART程序來對池蝶蚌Pif氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)域分析, 在N端從32到207位氨基酸中存在1個VWA, N端從536到733位氨基酸中有三個ChtBD2(幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)合域), 三個ChtBD2長度從左到右依次為85、53和48個氨基酸。

2.4 HsPif蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

使用Prabi程序?qū)if氨基酸的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和分析, 發(fā)現(xiàn)HsPif中α螺旋(Alpha helix, Hh)含量占19.63%, β折疊(Beta turn, Tt)占8.43%, 無規(guī)則卷曲(Random coil, Cc)占55.09%, 延伸鏈(Extended strand, Ee)占16.86%, 其中β折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲均勻的分布在HsPif蛋白質(zhì)中, 而α螺旋則主要分布在蛋白質(zhì)的前中部。

使用SWISS MODLE網(wǎng)址對HsPif蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測, 發(fā)現(xiàn)HsPif三級蛋白結(jié)構(gòu)模型中的α螺旋的分布與二級結(jié)構(gòu)中的分布情況一致, 主要分布在前中部, 說明其三級結(jié)構(gòu)預(yù)測是相對正確的(圖1)。

圖1 HsPif蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 The three-dimensional structure of HsPif protein

2.5 HsPif的同源比對和系統(tǒng)進化樹

將得到的HsPif序列于NCBI網(wǎng)站上進行蛋白比對, 結(jié)果顯示HsPif與三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)的同源性最高, 為97.97%, 其次是同源性為37.71%的厚殼貽貝(Mytilus coruscus), 同大珠母貝(Pinctada maxima)、黑蝶貝(Pinctada margaritifera)和蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis)的同源性分別為36.18%、35.92%和31.10%。HsPif蛋白序列與其他貝類的同源對比, 池蝶蚌含有保守的VWA結(jié)構(gòu)域和相對保守的ChtBD2(幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)合域)。

HsPif和其他含有Pif基因的其他貝類構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 結(jié)果顯示貝類中的Pif主要分為兩大支,HsPif與三角帆蚌聚為一支, 其他貝類聚為另一支,如圖2說明HsPif在進化的過程中趨向保守。

圖2 池蝶蚌及其他物種Pif的系統(tǒng)進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of HsPif from Hypriosis schlegelii and other species

2.6 組織熒光定量分析

通過qPCR檢測池蝶蚌各個組織HsPif基因的表達水平,HsPif基因在性腺的表達水平設(shè)為1, 外套膜套膜區(qū)表達量最高, 肝胰腺、外套膜中央膜區(qū)和外套膜邊緣膜區(qū)較高, 而心臟、血細胞和腎臟表達水平較低(圖3)。這說明HsPif基因主要表達場所為外套膜, 而外套膜是珍珠質(zhì)分泌的主要場所, 推測HsPif基因與珍珠的形成有一定關(guān)系。

圖3 HsPif mRNA在池蝶蚌不同組織中的相對表達水平Fig.3 The relative expression level of HsPif mRNA in different tissues of Hypriosis schlegelii

2.7 分子原位雜交

為了進一步確定HsPif基因的確切表達位置,確定其在珍珠形成中的作用, 進行原位雜交反應(yīng),結(jié)果顯示, 主要在池蝶蚌外套膜的緣膜部上皮細胞發(fā)生雜交反應(yīng), 表明HsPif基因與珍珠質(zhì)的形成有關(guān)(圖4)。

圖4 HsPif基因在池蝶蚌外套膜中原位雜交結(jié)果Fig.4 Results of in situ hybridization of HsPif gene in the mantle of Hypriosis schlegelii

2.8 珍珠形成早期HsPif基因在珍珠囊中的表達分析

取池蝶蚌植核手術(shù)后0、7d、15d、30d、60d、90d和120d七個時間點珍珠囊樣品, 采用qPCR技術(shù)對HsPif基因進行表達量分析, 結(jié)果表明, 植核后第7天顯著降低, 隨后升高, 在第60天達到最高,第90天Pif的表達量顯著降低, 隨后表達量升高(圖5)。

圖5 池蝶蚌進行植核手術(shù)后不同時期HsPif的表達量變化Fig.5 Changes in the expression of HsPif in different periods after nucleus grafting

3 討論

貝類Pif基因由Suzuki等[7]在合浦珠母貝珍珠層中首次分離并報道, Pif是珍珠質(zhì)中的一種酸性基質(zhì)蛋白, 該基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后形成Pif97和Pif80, 參與文石的形成與堆積。本實驗對池蝶蚌Pif基因(HsPif)進行全長克隆和功能鑒定, 分析HsPif基因的全長序列發(fā)現(xiàn): 該基因含有VWA和ChtBD2結(jié)構(gòu)域, 在各種細胞外基質(zhì)蛋白中, VWA結(jié)構(gòu)域的功能通常與蛋白質(zhì)之間的相互作用的調(diào)節(jié)有關(guān)[16], 且Pif可與其他珍珠層形成相關(guān)的蛋白相互結(jié)合[16], 推測該基因與珍珠層的形成有關(guān)。這與其他貝類中的Pif基因及其同系物都具有VWA和ChtBD2結(jié)構(gòu)域相似[7,13],說明了Pif基因的保守性較高。分析HsPif基因的同源比對性和構(gòu)建進化樹結(jié)果顯示:HsPif與三角帆蚌Pif在同一支上, 說明池蝶蚌與三角帆蚌有較近的親緣關(guān)系, 且與其他貝類在同一大支上, 這也驗證了Pif基因保守性較高。HsPif基因可能與其同系物具有相似的珍珠層生物礦化機制。

在貝類中, 生物礦化主要發(fā)生在外套膜, 鈣離子和碳酸氫鈣離子結(jié)合, 達到飽和狀態(tài)后發(fā)生結(jié)晶、沉積[17]。貝類的外套膜可分為邊緣膜區(qū)(Marginal zone, MO)、套膜區(qū)(Pallial zone, MP)和中央膜區(qū)(Central zone, MC) 3個部分[18,19]。邊緣膜區(qū)負責(zé)分泌形成棱柱層的大分子物質(zhì), 中央膜區(qū)和套膜區(qū)主要是負責(zé)分泌形成珍珠層的有機質(zhì)[19,20]。本實驗對3齡池蝶蚌的組織表達檢測中可發(fā)現(xiàn):HsPif基因在各組織均有表達, 該基因在套膜區(qū)、中央膜和邊緣膜區(qū)膜較高, 而心臟、血細胞和腎臟表達水平較低, 且HsPif基因在套膜區(qū)中顯著高表達, 說明該基因與珍珠層的形成相關(guān)。在本實驗中, 除了組織表達分析外, 為了了解HsPif基因在外套膜中的確切表達位置, 進行了分子原位雜交實驗, 結(jié)果顯示, 主要在外套膜緣膜上皮細胞檢測到雜交信號,進一步表明HsPif有可能參與珍珠層的形成過程。

珍珠是由軟體動物分泌的生物礦物而形成的珠粒, 是由軟體動物外套膜受外來刺激或自身病變形成的珍珠囊分泌形成。在珍珠產(chǎn)業(yè)中, 外套膜移植物與宿主外套膜的結(jié)締組織融合形成完整的珍珠囊, 珍珠囊細胞開始分泌基質(zhì)蛋白來控制晶體生長, 最終形成珍珠[21]。因此, 珍珠囊在珍珠層的生物礦化中類似于外套膜。本研究分析了珍珠形成過程中HsPif在珍珠囊中的表達, 結(jié)果顯示HsPif在第7天表達量極低, 植核后的7d內(nèi), 植核手術(shù)傷口還未愈合, 處于外套膜小片與蚌體自身外套膜組織相互融合的過程, 未分泌珍珠質(zhì), 這與王烈華等[22]的研究結(jié)果相似, 在珍珠囊扁平細胞出現(xiàn)時才開始(植核后7—15d)分泌珍珠質(zhì); 在15d后HsPif表達水平上升, 說明珍珠囊已初步形成, 開始有少量珍珠質(zhì); 30d時,HsPif的表達水平降至對照組水平, 表達量相對較低, 這可能是處于珍珠形成的不規(guī)則碳酸鈣沉積階段, 珍珠囊內(nèi)基質(zhì)蛋白表達低[4]。HsPif在第30至第60天顯著表達, 表明HsPif為CaCO3提供了成核位點, 珍珠層已形成[4,23]。理論上, 形成珍珠層后HsPif應(yīng)該是穩(wěn)定表達的。而在植核第90天后出現(xiàn)顯著降低, 這可能是受天氣或者其他外部條件的刺激而導(dǎo)致蚌體發(fā)生其他免疫反應(yīng), 阻礙珍珠質(zhì)的穩(wěn)定分泌?？傊? 本文首次從池蝶蚌中克隆出Pif基因的cDNA全長序列, 且池蝶蚌植核手術(shù)后珍珠囊中Pif基因的表達說明其與珍珠層的形成有關(guān), 為進一步研究珍珠的形成提供參考。