歐陽雪梅 鄭毓毓 韓學(xué)凱 許如意 隋麗英

(天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院, 亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心, 天津 300457)

小型甲殼動(dòng)物鹵蟲(Artemia)廣泛分布于沿海鹽池和內(nèi)陸鹽湖高鹽水體中, 是鹵水生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的重要組成部分和生物調(diào)節(jié)者[1]。鹵蟲具有兩種生殖方式, 分別為孤雌生殖和兩性生殖, 同時(shí)雌性鹵蟲以卵生(Oviparous, OVI)、卵胎生(Ovoviviparous, OVOVI)兩種方式進(jìn)行繁育, 即雌性鹵蟲以產(chǎn)休眠卵或以生產(chǎn)無節(jié)幼體的方式來繁殖后代[2]。

鹵蟲的繁殖模式可能受內(nèi)在遺傳因子與外部環(huán)境因素的影響[3], 對(duì)于其繁殖模式形成的分子機(jī)制研究, 主要集中在休眠卵形成相關(guān)功能基因克隆和表達(dá)方面。目前已發(fā)現(xiàn)多種鹵蟲繁殖相關(guān)基因,如BAP1是一種參與調(diào)節(jié)G1/S期和休眠卵形成的分子, 有助于維持休眠卵的周期停滯[4]; 還鑒定了參與鹵蟲休眠卵形成過程的脅迫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄輔因子p8[5]。有研究報(bào)道, 在鹵蟲的卵生途徑中Afr-AMPKα基因的mRNA表達(dá)水平顯著降低, 這可能與鹵蟲的不同繁殖方式有關(guān)[6]。此外, 在鹵蟲中, 染色質(zhì)組蛋白的積累可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯, 影響胚胎發(fā)育, 并參與鹵蟲休眠胚胎形成過程[7]。然而目前哪些基因在鹵蟲產(chǎn)卵或產(chǎn)幼過程中起關(guān)鍵作用還不清楚, 其不同繁殖方式產(chǎn)生的內(nèi)在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

近年來轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于甲殼動(dòng)物發(fā)育、繁殖和免疫等方面的研究, 并用于發(fā)掘參與其各種生理過程的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路[8]。在鹵蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方面, 有報(bào)道采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行鹵蟲耐鹽相關(guān)基因挖掘, 為研究鹵蟲獨(dú)特的耐鹽機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料[9]; Diego等[10]構(gòu)建了雌雄差異轉(zhuǎn)錄組, 并開發(fā)了雌雄相關(guān)SNP標(biāo)記, 為鹵蟲和其他甲殼類動(dòng)物性別偏向基因的表達(dá)提供了重要信息。但迄今為止, 有關(guān)鹵蟲卵生和卵胎生不同繁殖模式的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究還未見報(bào)道, 相關(guān)的繁殖模式差異基因有待進(jìn)一步發(fā)掘。因此本實(shí)驗(yàn)利用Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建了孤雌生殖鹵蟲在卵生和卵胎生兩種繁殖模式下的轉(zhuǎn)錄組文庫,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋, 篩選與鹵蟲生殖相關(guān)的候選基因并開展表達(dá)研究, 為揭示其不同繁殖模式的發(fā)生機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選取新疆艾比湖孤雌生殖鹵蟲, 在28℃和光照條件下孵化培養(yǎng)。在6個(gè)1 L錐形瓶中每個(gè)飼養(yǎng)200只鹵蟲并投喂新鮮培養(yǎng)的鹽生杜氏藻Dunaliella salina。根據(jù)王智超[11]在對(duì)光誘導(dǎo)鹵蟲卵生卵胎生不同繁殖模式的研究, 得到相應(yīng)繁殖模式的鹵蟲, 以備后用。收集晚期胚胎的卵巢組織,解剖后迅速置于液氮中, –80℃冰箱中保存, 用于分析候選生殖相關(guān)基因在不同繁殖模式的表達(dá)情況。

1.2 文庫構(gòu)建與測(cè)序

從卵巢組織樣品中提取總RNA, 檢驗(yàn)其濃度、純度及完整性。在樣品檢測(cè)合格后, 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA, 并將其純化。經(jīng)末端修復(fù)和接頭連接后通過PCR富集得到最終的cDNA文庫, 并對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè), 然后在Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[12]。

1.3 從頭組裝和功能注釋

為獲取后續(xù)分析所需的參考序列, 將測(cè)序得到的原始序列進(jìn)行過濾, 首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估, 將帶接頭的、低質(zhì)量的數(shù)據(jù)過濾得到測(cè)序讀段, 后將獲得的測(cè)序讀段用Trinity[13]軟件進(jìn)行序列拼接, 將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄本序列, Corset層次聚類并去冗余后得到最長(zhǎng)Cluster序列進(jìn)行后續(xù)的分析。為獲得全面的基因功能信息, 將拼接所得的序列與NR、NT、PFAM、KOG、KO、SwissProt、GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋[14]。

1.4 差異表達(dá)基因

將測(cè)序讀段運(yùn)用Bowtie 2進(jìn)行比對(duì), 利用DEG-seq得到鹵蟲卵生和卵胎生兩種繁殖模式間的差異表達(dá)基因[14], 在篩選過程中, 以qvalue<0.005且log2|fold_change|>1為篩選閾值。為了獲得關(guān)于差異表達(dá)基因更多信息, 通過KEGG通路富集和GO功能對(duì)其進(jìn)行分析[15]。

1.5 qRT-PCR分析

從轉(zhuǎn)錄組篩選的差異基因中, 參照轉(zhuǎn)錄組注釋并結(jié)合文獻(xiàn)查找篩選得到Serine/threonine-like kinase(SLK)、Double sex and mab-3 related transcription factor(Dmrt)、Feminization-1(fem-1)和5-hydroxytryptamine receptor gene(5-HT), 以及參與原始生殖細(xì)胞的遷移和維持的Nanos和調(diào)節(jié)成熟促進(jìn)因子亞基的周期蛋白cyclin B等6個(gè)候選生殖相關(guān)基因并進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1), 以β-actin作為內(nèi)參基因?qū)麓汽u蟲卵巢不同繁殖模式的mRNA表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè), 采用2–??Ct法[16]計(jì)算目的基因在生殖腺不同繁殖模式的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.6 候選生殖相關(guān)基因的蛋白結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過在線軟件對(duì)候選生殖相關(guān)基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(https : //www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html); 采用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫對(duì)候選生殖相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì), 分析與其他物種的相似性; 利用MEGA7.0軟件將不同物種的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 Unigene的組裝和功能注釋

從原始數(shù)據(jù)中將低質(zhì)量序列剔除后, 共得到了94901316條序列, 從頭組裝后得到97146條unigene(表2), 長(zhǎng)度大于2000 bp的有12338條, 平均長(zhǎng)度為1023 bp, N50 unigene有1558個(gè), N90 unigene有450個(gè)。

表2 Unigene序列在公共數(shù)據(jù)庫中的注釋結(jié)果Tab.2 Comment results of the unigene sequence in the public database

將獲得的97146條Unigene 數(shù)據(jù)信息分別在蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(Pfam)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swiss Prot)、非冗余蛋白數(shù)據(jù)(NR)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫和基因組百科全書(KEGG)七大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)注釋。結(jié)果顯示, 注釋率最高的是GO數(shù)據(jù)庫, 達(dá)到37.39%; 注釋率最低的為NT數(shù)據(jù)庫中, 僅為13.01%(表2)。轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳至基因組數(shù)據(jù)中心,登錄號(hào)為: PRJNA788349。

2.2 差異表達(dá)基因分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得卵生和卵胎生鹵蟲卵巢的1452個(gè)差異表達(dá)基因, 上調(diào)基因與下調(diào)基因分別為601個(gè)和851個(gè)(圖1)。

圖1 卵胎生與卵生鹵蟲卵巢中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因Fig.1 Up-regulated and down-regulated differentially expressed genes in ovoviviparous vs oviparous Artemia ovary

GO數(shù)據(jù)庫涵蓋3個(gè)方面(圖2): 生物過程(Biological process)、細(xì)胞組成(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示: 注釋到生物過程數(shù)據(jù)庫中的差異表達(dá)基因有1243個(gè),其中22.84%富集在有機(jī)氮化合物代謝, 碳水化合物衍生物代謝過程占11.19%; 注釋富集至分子功能數(shù)據(jù)庫的有530個(gè)差異表達(dá)基因, 17.13%為結(jié)構(gòu)分子活性, 幾丁質(zhì)結(jié)合占6.06%; 富集至細(xì)胞組分的有306個(gè), 細(xì)胞組分占11.54%, 核蛋白復(fù)合體占7.11%,核糖體蛋白占6.41%。

圖2 GO富集分析圖Fig.2 Enrichment scatter diagram of GO pathway

在本研究中, 對(duì)卵生、卵胎生的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析, 共富集到220條代謝調(diào)節(jié)通路, 挑選了富集最顯著的20條信號(hào)通路條目在圖3中進(jìn)行展示。表3為卵生和卵胎生差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)基因富集的前10個(gè)信號(hào)通路, 其中上調(diào)富集基因數(shù)目最多的通路為蛋白質(zhì)消化吸收, 下調(diào)富集基因數(shù)目最多的為核糖體通路。

表3 鹵蟲表達(dá)上調(diào)和下調(diào)基因富集的10個(gè)信號(hào)通路Tab.3 The top -ten enriched pathways of up -regulated and down-regulated unigene in Artemia

圖3 KEGG pathway富集散點(diǎn)圖Fig.3 Enrichment scatter diagram of KEGG pathway

從KEGG富集通路中篩選后利用NCBI比對(duì),挑選可能對(duì)鹵蟲不同生殖模式起到調(diào)控作用的基因, 并結(jié)合文獻(xiàn)查找獲得了Serine/threonine-like kinase(SLK)、Double sex and mab-3 related transcription factor(Dmrt3)、Feminization-1(fem-1)和5-hydroxytryptamine receptor gene(5-HT), 以及參與原始生殖細(xì)胞的遷移和維持的Nanos和調(diào)節(jié)成熟促進(jìn)因子亞基的周期蛋白cyclin B共6個(gè)候選生殖相關(guān)基因。

2.3 候選生殖相關(guān)基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

對(duì)SLK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第334—581位氨基酸為 MPP_PPP_family結(jié)構(gòu)域(圖4A)。對(duì)Dmrt3蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第68—208位氨基酸為 DM superfamily結(jié)構(gòu)域(圖4B)。對(duì)Fem-1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第92—183位氨基酸、第158—240位氨基酸、第44—116位氨基酸都為Ank_2結(jié)構(gòu)域, 第527—571位氨基酸為 Ank_2超家族結(jié)構(gòu)域, 第486—582位氨基酸為ANKYR結(jié)構(gòu)域(圖4C)。對(duì)CyclinB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第61—190位氨基酸為CYCLIN_CCNB1-like_rpt1結(jié)構(gòu)域, 第195—315位氨基酸為CYCLIN_SF 超家族結(jié)構(gòu)域(圖4D)。對(duì)5-HT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域,其中第32—371位氨基酸為7tmA_5-HT7結(jié)構(gòu)域(圖4E)。對(duì)Nanos蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該蛋白共包含1個(gè)結(jié)構(gòu)域, 其中第232—279位氨基酸為zf-nanos結(jié)構(gòu)域(圖4F)。

2.4 候選生殖相關(guān)基因的相似性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

分別對(duì)候選生殖相關(guān)基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知,SLK基因氨基酸序列與昆蟲綱中的馬鈴薯的SLK序列相似性最高(圖5A)。Dmrt3基因氨基酸序列與兩棲綱、鰓足綱(節(jié)肢動(dòng)物門)相關(guān)物種的Dmrt3基因氨基酸序列相對(duì)較近, 其中Dmrt3基因與兩性鹵蟲和鹽湖鹵蟲的Dmrt3序列相似性最高(圖5B)。fem-1基因氨基酸序列與鰓足綱(節(jié)肢動(dòng)物門)和橈足綱相關(guān)物種的fem-1基因氨基酸序列相對(duì)較近,其中fem-1基因與兩性鹵蟲的fem-1序列相似性最高(圖5C)。cyclinB基因氨基酸序列與輻鰭魚綱(脂鯉科)相關(guān)物種的cyclinB基因氨基酸序列相對(duì)較近(圖5D)。5-HT基因氨基酸序列與介形蟲的5-HT序列相似性最高(圖5E)。Nanos基因氨基酸序列與昆蟲綱的相關(guān)物種的Nanos基因氨基酸序列相對(duì)較近, 其中Nanos基因與多胚跳小蜂和竹節(jié)蟲的Nanos序列相似性最高(圖5F)。

圖5 SLK、Dmrt3、Fem-1、CyclinB、5-HT和Nanos蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of SLK, DMRT3, Fem-1, CyclinB, 5-HT and Nanos proteins

2.5 qRT-PCR驗(yàn)證和鹵蟲候選生殖相關(guān)基因的表達(dá)分析

qRT-PCR的結(jié)果表明, 所選的與生殖相關(guān)候選基因在卵生和卵胎生兩種繁殖模式中的表達(dá)量具有顯著性差異。SLK、Dmrt3、fem-1、cyclin B、5-HT和Nanos在鹵蟲卵巢中的表達(dá)量均為卵生高于卵胎生(P<0.05; 圖6)。

圖6 SLK、Dmrt3、fem-1、cyclinB、5-HT和Nanos基因在不同繁殖模式下的表達(dá)情況Fig.6 Expression of SLK, Dmrt3, fem-1, cyclinB, 5-HT and Nanos genes in different reproductive modes of Artemia oocysts

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

本研究以卵生和卵胎生生殖方式的孤雌鹵蟲為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 獲得了97146條非冗余Unigene序列, 其中注釋到已知基因的Unigene為37.39%, 注釋率相對(duì)較低。在其他關(guān)于甲殼動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比對(duì)注釋的報(bào)道中也出現(xiàn)了許多未被注釋到的情況, 如日本沼蝦(Macrobrachium nipponensis)轉(zhuǎn)錄組中只有23.89%為被注釋的序列[17], 銀色小長(zhǎng)臂蝦(Palaemonetes argentinusfan)中注釋到的序列只有24%[18], 而凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的注釋率也只有37.28%[19]。出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組注釋率低的原因可能是在目前公共基因數(shù)據(jù)庫中相關(guān)物種基因注釋信息有限。而隨著鹵蟲基因組測(cè)序結(jié)果的完成與公布, 這些潛在的與生殖相關(guān)功能基因有望得到進(jìn)一步挖掘。

已有研究證實(shí), 甲殼動(dòng)物的卵巢發(fā)育受到內(nèi)部因子如類固醇激素、神經(jīng)多肽、神經(jīng)遞質(zhì)以及外源環(huán)境因子的綜合調(diào)控[14,20—24]。本研究從GO富集數(shù)據(jù)庫中篩選到一些參與卵泡細(xì)胞發(fā)育、卵母細(xì)胞分化、生殖細(xì)胞發(fā)育、卵殼形成和性腺發(fā)育等過程的基因, 這些基因可能參與鹵蟲不同繁殖模式的生殖過程。Unigene在KOG真核直系同源數(shù)據(jù)庫中注釋到參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂、染色體分裂及核苷酸運(yùn)輸和代謝等相關(guān)基因, 可能與鹵蟲生殖有關(guān)。另外從KEGG代謝通路注釋分析中, 篩選到一些代謝通路如甾體激素生物合成[25]、PI3K-Akt信號(hào)通路[26]、TGF-beta信號(hào)通路[27—29]及Wnt信號(hào)通路[30], 這些都與甲殼動(dòng)物卵巢的發(fā)育和成熟相關(guān), 因此我們推斷這些代謝通路可能參與鹵蟲不同生殖模式的發(fā)生過程。

3.2 生殖相關(guān)候選基因表達(dá)分析

鹵蟲產(chǎn)卵和產(chǎn)幼的機(jī)制復(fù)雜, 可能與p26基因[31]、卵殼[32]、卵黃蛋白和外部環(huán)境因素有關(guān)[3,33]。本研究的不同生殖模式中的319個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集至抗原處理和呈遞、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程、PI3K-Akt信號(hào)通路、核糖體、吞噬體等KEGG通路中, 這些代謝通路對(duì)于鹵蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)起到調(diào)控作用。為進(jìn)一步探究這些過程是否與鹵蟲不同繁殖模式的生殖過程有關(guān), 從這些通路中篩選到了可能與鹵蟲不同生殖模式相關(guān)的候選基因SLK、Dmrt3、cyclin B、Nanos、fem-1和5-HT, 對(duì)鹵蟲在不同繁殖模式下生殖相關(guān)基因進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和表達(dá)情況分析。研究發(fā)現(xiàn)上述6個(gè)基因預(yù)測(cè)得到的蛋白結(jié)構(gòu)域與之前報(bào)道的相應(yīng)基因保守結(jié)構(gòu)域一致, 且均與生殖相關(guān)。這預(yù)示著本研究所選6個(gè)生殖候選基因在鹵蟲中可能同樣參與生殖發(fā)育過程。

在關(guān)于卵胎生鹵蟲研究中發(fā)現(xiàn),SLK主要參與調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等過程[34], 并且胚胎發(fā)育時(shí)期SLK蛋白表達(dá)量比卵母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期高[35]。對(duì)Artemia franciscana的雌蟲及雄蟲做轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),Dmrt相關(guān)基因調(diào)控性腺分化過程中蛻皮素的生物合成, 并參與性別決定過程, 表明鹵蟲中Dmrt基因參與生殖腺的早期發(fā)育[36]。對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)fem-1基因研究發(fā)現(xiàn), 該基因的表達(dá)量在卵巢組織和睪丸組織中最高, 并且在早期胚胎發(fā)育時(shí)高度表達(dá), 說明該基因?qū)τ谛韵侔l(fā)育后期有潛在作用, 同時(shí)與中華絨螯蟹的生殖密切相關(guān)[37]。在克氏原螯蝦(Procarabarus clarkii)中發(fā)現(xiàn)cyclin B基因在細(xì)胞分化、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和減數(shù)分裂周期過程中都發(fā)揮著重要作用, 說明cyclin B在甲殼類卵母細(xì)胞成熟調(diào)控中起著不可或缺的翻譯激活作用[38]。5-HT既是神經(jīng)遞質(zhì)又是神經(jīng)激素, 存在于卵巢和雄激素腺中, 并對(duì)性腺成熟產(chǎn)生影響。5-HT基因在遠(yuǎn)洋梭子蟹(Portunus pelagicus)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢中存在, 并可能通過作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些生殖激素對(duì)遠(yuǎn)洋梭子蟹的繁殖起著關(guān)鍵作用[39]。Nanos基因在成年雌性斑馬魚(Brachydanio rerio)生殖系的初期卵母細(xì)胞中表達(dá), 對(duì)于斑馬魚卵母細(xì)胞的持續(xù)產(chǎn)生起著重要作用[40]; 在多倍體銀鯽(Carassius gibelio)中發(fā)現(xiàn),Nanos2在生殖干細(xì)胞中呈現(xiàn)出偏向表達(dá)的特征, 調(diào)控卵巢早期胞囊的發(fā)育過程[41]。在本研究中, 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到SLK、Dmrt、fem-1、cyclin B、5-HT和Nanos的表達(dá)情況, 在鹵蟲不同繁殖模式下, 以上基因在鹵蟲卵生繁殖模式中的表達(dá)量均顯著高于卵胎生表達(dá)量, 因此推測(cè)這些基因可能更多參與鹵蟲休眠卵形成過程。

4 結(jié)論

利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了鹵蟲卵生和卵胎生差異轉(zhuǎn)錄組文庫, 結(jié)合KEGG富集通路及GO功能分類對(duì)兩種繁殖模式間的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。挑選6個(gè)生殖相關(guān)候選基因, 分別對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析其在不同生殖模式下的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)SLK、Dmrt3、cyclin B、fem-1、5-HT和Nanos在卵生鹵蟲卵囊的表達(dá)量顯著高于卵胎生鹵蟲, 說明這些基因可能更多地參與鹵蟲休眠卵形成過程, 影響鹵蟲卵生繁殖模式形成。在后續(xù)研究中將進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)精確地靶向敲降目的基因,檢測(cè)出下游基因表達(dá)量的變化, 并結(jié)合蛋白印跡技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因功能進(jìn)行深入研究。