程姜雯 潘瑛子 馬幸榮 王桂堂 李文祥

(1.西藏大學理學院, 拉薩 850000; 2.中國科學院水生生物研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控重點實驗室, 武漢 430072;3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院水產(chǎn)科學研究所, 拉薩 850032)

指環(huán)蟲屬(DactylogyrusDiesing, 1850)隸屬于單殖吸蟲綱(Monogenea)指環(huán)蟲目(Dactylogyridae)指環(huán)蟲科(Dactylogyridae), 是至今發(fā)現(xiàn)的物種多樣性最高的一個屬, 全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)900多種[1]。指環(huán)蟲宿主特異性較強, 一般一種指環(huán)蟲只寄生在一種宿主上[2]。絕大多數(shù)種類寄生于魚類的鰓部, 刺激鰓分泌黏液, 影響呼吸, 甚至破壞鰓組織, 引起病毒、細菌與真菌的繼發(fā)性感染, 導致魚類的大量死亡, 造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。寄生于鰱(Hypophthalmichthys molitrix)的鰱指環(huán)蟲(D.hypophthalmichthys)與小鞘指環(huán)蟲(D.vaginulatus), 及寄生于草魚(Ctenopharyngodon idellus)的鰓片指環(huán)蟲(D.lamellatus)等都給我國的淡水魚類養(yǎng)殖造成較大損失[4,5]。

鯽(Carassius auratus)是我國重要的養(yǎng)殖種類,在全國各地都有養(yǎng)殖, 隨著養(yǎng)殖密度的提高, 指環(huán)蟲病的發(fā)生日益嚴重和頻繁, 成為水產(chǎn)養(yǎng)殖危害最嚴重的寄生蟲病之一[6]。在我國, 報道的鯽鰓部寄生的指環(huán)蟲有8種之多[7], Li等[8]在湖北省自然湖泊和養(yǎng)殖池塘的鯽中發(fā)現(xiàn)了7種指環(huán)蟲, 分別為壞鰓指環(huán)蟲(D.vastator)、中型指環(huán)蟲(D.intermedius)、弧形指環(huán)蟲(D.arcuatus)、弓莖指環(huán)蟲(D.baueri)、美麗指環(huán)蟲(D.formosus)、望外指環(huán)蟲(D.inexpeatatus)和錨鉤指環(huán)蟲(D.anchoratus)。Tu等[9]利用形態(tài)特征和分子標記方法, 對華中地區(qū)養(yǎng)殖鯽(C.auratus)鰓上的美麗指環(huán)蟲(D.formosus)進行了形態(tài)學重描述和系統(tǒng)發(fā)育分析。Ling等[10]比較了華中地區(qū)鯽的壞鰓指環(huán)蟲和中型指環(huán)蟲的形態(tài)特征差異, 及18S rDNA+內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS-1)的分子序列差異。

隨著各國間的魚類引種和水產(chǎn)品貿(mào)易, 鯽寄生的指環(huán)蟲也被帶入到世界各地。在日本的金魚中發(fā)現(xiàn)了叉莖指環(huán)蟲(D.dukeiti)、美麗指環(huán)蟲、錨鉤指環(huán)蟲、弓莖指環(huán)蟲、中型指環(huán)蟲和壞鰓指環(huán)蟲6種指環(huán)蟲[11]; 在保加利亞發(fā)現(xiàn)了壞鰓指環(huán)蟲、中型指環(huán)蟲、弓莖指環(huán)蟲、美麗指環(huán)蟲和錨鉤指環(huán)蟲5種指環(huán)蟲[12]; 在印度[13]、 伊拉克[14]、伊朗[15]、墨西哥[16]、巴西[17]、古巴[18]和澳大利亞[19]等國家的金魚鰓上都報道了上述種指環(huán)蟲, 而這些指環(huán)蟲在中國都有報道。

一種魚類寄生多種指環(huán)蟲, 這種現(xiàn)象在擬鯉(Rutilus rutilus)和大頭歐雅魚(Squalius cephalus)中有報道過[20], 這也給指環(huán)蟲的種類鑒定帶來了困難。對于指環(huán)蟲屬的分類鑒定, 主要采用形態(tài)學結(jié)合分子鑒定[21]。由于鯽的有些指環(huán)蟲種類的形態(tài)描述比較早, 且缺乏分子數(shù)據(jù), 本研究通過對我國鯽寄生指環(huán)蟲種類調(diào)查, 重新描述和測量形態(tài)學特征, 并提供分子分類數(shù)據(jù), 為鯽寄生指環(huán)蟲的種類鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 指環(huán)蟲樣品收集

鯽采自湖北省武漢市梁子湖(30°11′05.460′′N,114°37′33.984′′E), 共50尾。將活魚運回實驗室, 暫養(yǎng)于水族箱中。將實驗魚麻醉(MS-222)后, 在解剖鏡(Nikon C-DSS230)下, 用解剖針逐次分開鰓絲檢查。在發(fā)現(xiàn)指環(huán)蟲后, 用解剖針將其剝離, 放入清水中, 沖洗干凈。將蟲體活體直接在顯微鏡下觀察、拍照, 并進行初步的形態(tài)鑒定, 一部分蟲體用聚乙烯醇封片, 用作進一步的形態(tài)觀察和測量;另一部分蟲體用90%的酒精固定, 用作分子鑒定。

1.2 指環(huán)蟲的形態(tài)學鑒定

在顯微鏡(OLYMPUS-CKX41)下觀察蟲體形態(tài)結(jié)構(gòu), 并利用電子目鏡(Pro-MiceoScan 5630)進行拍照和形態(tài)描述。按照指環(huán)蟲的測量參數(shù)和標準[7],利用軟件(Scope Photo 3.0)對已經(jīng)拍照的指環(huán)蟲進行測量, 并對幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)進行繪圖。

1.3 指環(huán)蟲的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

DNA提取、擴增與測序除望外指環(huán)蟲與弓莖指環(huán)蟲外, 每種指環(huán)蟲選3只, 按照蛋白酶K、酚-氯仿抽提法提取指環(huán)蟲基因組DNA并選用特異性引物[21]擴增部分18S rDNA、全部的ITS1 rDNA及部分5.8S rDNA等片段; 引物序列分別為上游引物S1 (5′-ATTCCGATAACGAACGAGACT-3′); 下游引物H7 (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATACTCG-3′)或者IR8 (5′-GCTAGCTGCGTTCTTCATCGA-3′)。

PCR擴增體系為50 μL, 包括 20 ng左右的指環(huán)蟲基因組DNA、1.25 U的ExTaq聚合酶(TaKaRa)、1 μL 20 mmol/L的上下游引物、4 μL 2.5 mmol/L dNTP溶液、 5 μL含20 mmol/L MgCl2的10×PCR緩沖液, 最后用滅菌的雙蒸水定容到50 μL。擴增反應程序如下: 95℃ 預變性5min; 94℃變性1min,55℃退火1min, 72℃延伸1min30s, 35個循環(huán); 72℃后延伸10min。

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳分離, 切割目的條帶并回收DNA, 然后用pMD18-T載體(TaKaRa)進行連接, 轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中, 50 μL/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基均勻涂布并培養(yǎng)過夜。挑取陽性克隆, 再經(jīng)過PCR篩選, 將陽性克隆菌液送華大基因測序公司進行測序。

分子鑒定將獲得的指環(huán)蟲的DNA序列, 在NCBI中進行BLAST比對分析, 通過與數(shù)據(jù)庫中已提交的相似度最高的序列進行對比, 并比較其序列的堿基位點差異, 進一步確定指環(huán)蟲的種類。

系統(tǒng)發(fā)育分析本研究共獲得5種指環(huán)蟲DNA序列, 另從GenBank獲得其他用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的指環(huán)蟲DNA序列37條,Thaparocleidus vistulensis作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外類群(表1)。將提取的序列導入MAFFT v7.313[22], 對DNA序列進行多重序列比對, 隨后將序列導入PhyloSuite v1.2.2[23]的Gblocks進行修剪校正。用ModelFinder[24]軟件對優(yōu)化的數(shù)據(jù)進行最優(yōu)模型選擇。采用MrBayes v3.2.6[25]構(gòu)建貝葉斯推論法(Bayesian inferences, BI)的系統(tǒng)發(fā)育樹, 模型選擇為GTR+F+I+G4, 馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process,MCMC)設置為2條鏈獨立運行2000000代。每1000代對系統(tǒng)樹抽樣, 前25%舍棄, 根據(jù)剩余樣本構(gòu)建一致樹(Consensus tree)并計算相關(guān)參數(shù), 以后驗概率(Posterior probability, PP)來表示各分支的可信性。使用IQ-TREE v1.6.8[26]構(gòu)建最大似然法(Maximum likelyhood, ML)的系統(tǒng)發(fā)育樹, 自動選擇最優(yōu)模型,模型選擇為TIM3+F+I+G4, 標準自展值設置為1000代。系統(tǒng)發(fā)育樹的美化則通過iTOL v6 (https://itol.embl.de/)[27]及Adobe Illustrator 2021 25.0完成。

表1 系統(tǒng)發(fā)育分析中所用指環(huán)蟲種名及其宿主種名、GenBank 登錄號、18S+ITS1+5.8S rDNA長度及采樣地點Tab.1 List of Dactylogyrus species used in the study and their host, GenBank accession number, 18S+ITS1+5.8S rDNA length and sampling location

此外, 在系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上, 選取部分壞鰓指環(huán)蟲和中型指環(huán)蟲序列, 基于雙參數(shù)模型 (Kimuratwo-parameter) 來計算序列的遺傳距離。

2 結(jié)果

2.1 指環(huán)蟲的形態(tài)學鑒定

通過對鯽寄生指環(huán)蟲的形態(tài)特征比較, 分別鑒定為壞鰓指環(huán)蟲(D.vastatorNybelin, 1924)、中型指環(huán)蟲(D.intermediusWegener, 1909)、弧形指環(huán)蟲(D.arcuatusYamaguti, 1942)、美麗指環(huán)蟲(D.formosusKulwiec, 1927)、弓莖指環(huán)蟲(D.baueriGussev, 1955)、望外指環(huán)蟲(D.inexpeatatusIsjumova, 1955)和叉莖指環(huán)蟲(D.dulkeitiBychowsky,1936)。下面是7種指環(huán)蟲的形態(tài)學特征描述, 形態(tài)測量均采用μm為度量單位。

壞鰓指環(huán)蟲蟲體體型較大, 長467—1016(n=8), 寬124—353。錨鉤長30—72, 較粗壯, 鉤柄長35—84。腹葉長13—44, 背葉長9—25, 鉤尖長5—15, 呈波浪狀。后吸器的7對邊緣小鉤發(fā)育完全,形狀相似, 長27—77。聯(lián)結(jié)棒單一, 長47—106, 寬4—15。交配管呈斜管狀, 末端較尖, 長31—72, 后端帶一基座, 長21—65, 寬6—24, 輔助交配器與交配管基部連接, 末端分兩支, 其中一支橫向朝前勾著交配管, 長26—73 (圖1)。

圖1 壞鰓指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.壞鰓指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.背聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.1 D. vastator and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks; c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

中型指環(huán)蟲蟲體長268—901(n=13), 寬108—251。錨鉤長16—27, 較為纖細, 鉤柄長15—25。腹葉明顯長于背葉, 腹葉長8—16, 背葉長3—7, 鉤尖長6—13。后吸器的7對邊緣小鉤發(fā)育完全, 形狀相似, 長19—36。聯(lián)結(jié)棒單一, 長23—39,寬2—4。交配管呈斜管狀, 末端較尖, 長23—53, 后端帶一基座, 長11—55, 寬6—22, 輔助交配器與壞鰓指環(huán)蟲相似, 末端分兩支, 其中一支橫向朝前勾著交配管, 長22—59 (圖2)。

弧形指環(huán)蟲蟲體較小(n=28), 長96—490,寬23—106。錨鉤較長, 長81—160, 伸出體外很多,鉤柄長52—85。腹葉較長, 長27—106, 背葉不明顯,鉤尖長20—74。后吸器的6對邊緣小鉤發(fā)育完全,第7對邊緣小鉤雛形, 發(fā)育完全的邊緣小鉤長15—37。聯(lián)結(jié)棒單一, 相對較短, 長17—51, 寬8—11。交配管為一弧形細管, 基部較寬, 逐漸向末端變細,長30—76, 輔助交配器較短, 長23—53 (圖3)。

圖3 弧形指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.弧形指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.3 D.arcuatus and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks; c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

美麗指環(huán)蟲蟲體較小, 長218—462(n=11),寬48—97。錨鉤較短, 長49—79, 鉤柄長28—52。腹葉長24—45, 鉤尖長10—22。后吸器發(fā)育完全的邊緣小鉤有6對, 形狀相似, 第7對雛形, 長17—31。聯(lián)結(jié)棒單一, 兩端向內(nèi)彎曲膨大, 類似馬蹄形, 長18—42, 寬2—7。交配管較短, 呈斜管狀, 末端較尖,長14—30, 后端帶一基座, 呈貝殼狀, 輔助交配器分三支, 其中一支略微朝前勾著交配管, 長11—25 (圖4)。

圖4 美麗指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.美麗指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.4 D.formosus and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks; c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

弓莖指環(huán)蟲蟲體較小, 長120—369(n=6),寬19—73。錨鉤較短, 長40—52, 鉤柄長23—30。腹葉長18—30, 背葉不明顯, 鉤尖長16—21。后吸器具有7對發(fā)育完全的邊緣小鉤, 長14—21。聯(lián)結(jié)棒單一, 較長, 中間有一波形, 長26—37, 寬2—4。交配器似弓形, 交配管為弧形管狀, 長26—38, 輔助交配器分為3支, 前兩支彎曲包著交配管, 長25—40(圖5)。

圖5 弓莖指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.弓莖指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.5 D.baueri and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks, c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

望外指環(huán)蟲體型較小, 長110—301(n=6),寬16—57。錨鉤較短, 長54—60, 鉤柄長32—35。腹葉長25—34, 背葉不明顯, 長2左右, 鉤尖長21—26。后吸器具有7對發(fā)育完全的邊緣小鉤, 長15—25。聯(lián)結(jié)棒單一, 較長, 長32—39, 寬2—4。交配器為管狀, 末端細長, 長17—54, 輔助交配器呈棒狀, 末端膨大, 上部分似尖刀狀, 長20—36 (圖6)。

圖6 望外指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.望外指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.6 D.inexpeatatus and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks; c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

叉莖指環(huán)蟲體型較小, 長357—480(n=17),寬65—106。錨鉤纖細, 長37—57, 鉤柄長21—31。腹葉長19—25, 有稍稍扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)象, 背葉不明顯, 鉤尖長15—31。后吸器具有7對發(fā)育完全的邊緣小鉤,長15—31。聯(lián)結(jié)棒細長, 長30—46, 寬2—4。交配管細長, 末端膨大, 長22—30, 輔助交配器底部細長,在上部分為兩支, 呈樹枝狀, 整個輪廓略似“Y” 字形, 長18—33 (圖7)。

圖7 叉莖指環(huán)蟲整體及幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(a.叉莖指環(huán)蟲整體; b.錨鉤及邊緣小鉤; c.交配器; a′.中央大鉤; b′.邊緣小鉤; c′.聯(lián)結(jié)棒; d′.交配器)Fig.7 D.dulkeiti and its sclerotized structures (a.whole worm; b.anchors and marginal hooks; c.copulatory organ; a′.anchors;b′.marginal hooks; c′.dorsal bar; d′.copulatory organ)

2.2 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究共獲得壞鰓指環(huán)蟲、中型指環(huán)蟲、弧形指環(huán)蟲、美麗指環(huán)蟲與叉莖指環(huán)蟲5種指環(huán)蟲的18S+ITS1+5.8S rDNA序列。BLAST結(jié)果顯示, 壞鰓指環(huán)蟲的1045 bp的序列(KC876016)與捷克的壞鰓指環(huán)蟲(AJ564159)相似度為96.37%, 存在38個位點差異; 中型指環(huán)蟲的1013 bp的序列(KC876017)與捷克的中型指環(huán)蟲(AJ564139)相似度為99.01%,存在10個位點的差異; 弧形指環(huán)蟲的997 bp的序列(KC876019)與捷克的錨鉤指環(huán)蟲(D.anchoratus)(AJ564111)相似度為95.29%, 在GenBank中為首次提交; 美麗指環(huán)蟲的1002 bp的序列(KC876018)與捷克的美麗指環(huán)蟲(AJ564135)相似度為99.90%, 僅存在1個位點的差異; 叉莖指環(huán)蟲的1049 bp的序列(KC876020)與捷克的叉莖指環(huán)蟲(AJ564126)相似度為99.71%, 僅存在3個位點的差異。

用貝葉斯法和最大似然法構(gòu)建的BI樹和ML樹樹形完全一致, 支持率大小略有差別。不同地區(qū)的中型指環(huán)蟲聚集在一起, 再與壞鰓指環(huán)蟲形成一支;叉莖指環(huán)蟲、弧形指環(huán)蟲與美麗指環(huán)蟲聚為一支,寄生于鯽的所有指環(huán)蟲聚為一大支(BI 0.99/ML 100; 圖8)。

圖8 基于18S rDNA+ITS1 rDNA聯(lián)合序列構(gòu)建的(BI/ML)指環(huán)蟲系統(tǒng)發(fā)育樹, 分支上的數(shù)字為貝葉斯后驗概率(BPP)/最大似然法(ML)自展支持率Fig.8 Phylogenetic trees (BI/ML) of Dactylogrus spp.based on combined partial 18S rDNA and ITS1 sequences, rooted Thaparocleidus vistulensis.Numbers along branches represent the Bayesian posterior probability value and the bootstrap values of maximum likelihood

基于18S＋ITS1 rDNA聯(lián)合序列遺傳距離分析顯示, 壞鰓指環(huán)蟲的種內(nèi)遺傳距離為0.004—0.058,中型指環(huán)蟲的種內(nèi)遺傳距離為0.007—0.013, 壞鰓指環(huán)蟲與中型指環(huán)蟲的種間遺傳距離為0.046—0.064(表2)。其中壞鰓指環(huán)蟲(KJ854363與AJ564159)、(KM487695與AJ564159)和(KJ854363與KC876 016)的種內(nèi)遺傳距離(0.058/0.051/0.048)較大, 僅稍小于壞鰓指環(huán)蟲與中型指環(huán)蟲的種間遺傳距離。進一步分析發(fā)現(xiàn), 與18S區(qū)相比, 壞鰓指環(huán)蟲的變異主要發(fā)生在ITS-1區(qū)(表3)。

表2 感染鯽的壞鰓指環(huán)蟲和中型指環(huán)蟲的18S＋ITS1 rDNA聯(lián)合序列基于雙參數(shù)模型的遺傳距離Tab.2 The genetic distances based on Kimura-two-parameter between Dactylogyrus vastator and Dactylogyrus intermedius infecting C.auratus, for combined partial 18S rDNA and ITS1 sequences

表3 感染鯽的壞鰓指環(huán)蟲和中型指環(huán)蟲的ITS1序列基于雙參數(shù)模型的遺傳距離Tab.3 The genetic distance based on Kimura-two-parameter between D.vastator and D.intermedius infecting C.auratus, for ITS1 sequences

3 討論

通過形態(tài)學和分子鑒定, 在梁子湖的鯽鰓部共發(fā)現(xiàn)7種指環(huán)蟲, 即壞鰓指環(huán)蟲、中型指環(huán)蟲、弧形指環(huán)蟲、弓莖指環(huán)蟲、美麗指環(huán)蟲、望外指環(huán)蟲及叉莖指環(huán)蟲。

3.1 指環(huán)蟲的形態(tài)學鑒定

形態(tài)上, 壞鰓指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 蟲體體型較大, 其錨鉤背葉和腹葉粗壯, 分叉明顯, 靠近鉤尖有波浪狀突起。與國內(nèi)外陳啟鎏[7]、Ling等[10]、Ogawa等[11]和Borisov[12]報道的同種個體相比, 本研究報道的壞鰓指環(huán)蟲錨鉤總長(30—72vs.32—39vs.30—36vs.37—44vs.35—45)較長; 同時我們觀察到壞鰓指環(huán)蟲背聯(lián)結(jié)棒有凹痕, Borisov[12]也報道了該現(xiàn)象, 而Ling等[10]報道的壞鰓指環(huán)蟲其背聯(lián)結(jié)棒較為光滑。

中型指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤背葉和腹葉分叉明顯, 但較為纖細; 輔助交配器末端分兩支, 其中一只橫向朝前勾著交配管。中型指環(huán)蟲的后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)與壞鰓指環(huán)蟲較為相似, 但壞鰓指環(huán)蟲的錨鉤總長(30—72vs.16—27)和背聯(lián)結(jié)棒[(47—106)×(4—15)vs.(23—39)×(2—4)]比中型指環(huán)蟲更大一些, 且鉤尖呈波浪狀。本研究報道的中型指環(huán)蟲與國內(nèi)外報道的同種個體的形態(tài)特征描述[7,10—12]基本一致。

弧形指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤較長, 伸出體外很多; 具有較長的腹葉, 背葉不明顯;交配管為弧形細管, 較為彎曲, 輔助交配器較短, 呈鞭狀[7]。其錨鉤與美麗指環(huán)蟲和弓莖指環(huán)蟲的較相似, 但弧形指環(huán)蟲的錨鉤更長(81—160vs.49—79vs.40—52)。與國內(nèi)陳啟鎏[9]報道的同種個體相比, 本研究報道弧形指環(huán)蟲的背聯(lián)結(jié)棒較大[(17—51)×(8—11)vs.(18—24)×(3—5)]。

美麗指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤背葉不明顯; 聯(lián)結(jié)棒兩端向內(nèi)彎曲膨大, 類似馬蹄形;交配管呈斜管狀, 輔助交配器為樹狀分枝。美麗指環(huán)蟲的后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的形態(tài)與弧形指環(huán)蟲較為相似, 但美麗指環(huán)蟲的錨鉤總長僅為弧形指環(huán)蟲的一半, 且通過交配器官形態(tài)可以區(qū)別這兩種指環(huán)蟲。與國內(nèi)外陳啟鎏[7]、Tu等[9]、Ogawa等[11]、Borisov[12]和Tancredo等[17]報道的同種個體相比, 本研究報道美麗指環(huán)蟲的背聯(lián)結(jié)棒較長(18—42vs.16—24vs.16—19vs.16—23vs.13—20vs.23—26)。

弓莖指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤背葉不明顯; 交配器似弓形。本研究報道的弓莖指環(huán)蟲與國內(nèi)外報道的同種個體的形態(tài)特征描述[7,11,12,17]基本一致。望外指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤背葉不明顯; 輔助交配器呈棒狀, 末端膨大, 上部分似尖刀狀。與陳啟鎏[7]報道的同種個體相比,本研究報道望外指環(huán)蟲的錨鉤總長較長(54—60vs.37—48)。叉莖指環(huán)蟲與其他6種指環(huán)蟲相比: 其錨鉤腹葉有稍稍扭轉(zhuǎn)的現(xiàn)象, 背葉不明顯; 輔助交配器底部細長, 在上部分為兩支, 整個輪廓略似“Y”字形[7]。叉莖指環(huán)蟲、望外指環(huán)蟲和弓莖指環(huán)蟲的錨鉤形態(tài)相似, 主要依據(jù)交配器官形態(tài)來區(qū)分。

3.2 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

18S rDNA V4區(qū)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1)現(xiàn)已成為指環(huán)蟲分子鑒定的常用分子標記[10,28]。本研究共獲得5種指環(huán)蟲基因序列, 中型指環(huán)蟲、美麗指環(huán)蟲和叉莖指環(huán)蟲與?imková等[21]的研究中測得的相應的指環(huán)蟲序列相似度高達99.0%以上, 與形態(tài)鑒定的結(jié)果一致。弧形指環(huán)蟲為首次提交的基因序列, 所測得3個弧形指環(huán)蟲的基因序列完全相同。壞鰓指環(huán)蟲與捷克壞鰓指環(huán)蟲(AJ564159)[21]相似度最高, 為96.37%。進一步基于18S＋ITS1 rDNA聯(lián)合序列的遺傳距離分析發(fā)現(xiàn), 壞鰓指環(huán)蟲的種內(nèi)遺傳距離為0.004—0.058。Ling等[10]和Chaudhary等[13]也報道了壞鰓指環(huán)蟲較低的18S＋ITS1 rDNA聯(lián)合序列相似性, 及較大種內(nèi)變異的現(xiàn)象。在其他指環(huán)蟲中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象, Benovics等[29]調(diào)查發(fā)現(xiàn)基于18S＋ITS1 rDNA聯(lián)合序列,D.folkmanovae的種內(nèi)遺傳距離為0.002—0.037,D.rarissimus的種內(nèi)遺傳距離為0.001—0.030。

較高的種內(nèi)遺傳變異可能與指環(huán)蟲的宿主特異性有關(guān)。寄生于鯽的壞鰓指環(huán)蟲的宿主除了同屬的銀鯽(C.gibelio)[30]和黑鯽(C.carassius)[31], 還有鯉科魚類中的鯉(C.carpio)[7,32]、黑龍江野鯉(C.haematopterus)[32]、Cyprinion watsoni[31]、B.barbus[33]和Vimba vimba[34], 甚至在麥穗魚(P.parva)[35]、棒花魚(Abbottina rivularis)[35]和管臀魚(Aulopyge huegelii)[36]上也有壞鰓指環(huán)蟲的報道。這些調(diào)查結(jié)果表明壞鰓指環(huán)蟲的宿主特異性并沒有其他指環(huán)蟲那么嚴格。Benovics等[29]在調(diào)查巴爾干地區(qū)鯉科魚類寄生指環(huán)蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時, 發(fā)現(xiàn)低宿主特異性的指環(huán)蟲具有廣泛的種內(nèi)遺傳變異, 即使是在寄生于同一魚類地理區(qū)域的同一宿主中的同種指環(huán)蟲的兩個種群之間, 也發(fā)生了種群間的遺傳變異。Benovics等[37]還發(fā)現(xiàn)低宿主特異性的維氏指環(huán)蟲(D.vistulae)的同一種群內(nèi)的個體間也存在較高的遺傳多樣性。

宿主特異性是單殖吸蟲與其宿主協(xié)同進化的驅(qū)動力, “宿主內(nèi)成種”(Intrahost speciation)和“宿主轉(zhuǎn)換”(Host switching)是單殖吸蟲發(fā)生遺傳變異和呈現(xiàn)物種多樣性的重要進化事件, 這可能也是壞鰓指環(huán)蟲存在較高種內(nèi)遺傳變異的原因。盡管壞鰓指環(huán)蟲具有較高的種內(nèi)遺傳變異, 但其種內(nèi)遺傳距離仍小于壞鰓指環(huán)蟲與中型指環(huán)蟲之間的遺傳距離。