鄒有瑞，李嘉麟，黃 靈，馬 悅，馬 輝

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的腫瘤之一[1],約占腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的80%[2]。主要治療方式是手術(shù)治療及輔助放化療。高級別膠質(zhì)瘤患者的平均生存時間只有15個月[3],其發(fā)病機制需要進一步明確。近年來，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號在腫瘤發(fā)病機制中的作用逐漸被深入研究，生長因子受體RAS、肌醇5′-磷酸酶、C末端調(diào)節(jié)蛋白、AKT的表達水平在大多數(shù)實體瘤中都有不同程度的改變[4]，這種信號級聯(lián)上下游效應器及相關(guān)的調(diào)控被認為是有吸引力的研究靶點。本研究通過使用新型PI3K/AKT信號通路抑制劑SH-6和LY294002處理膠質(zhì)瘤細胞，分析PI3K/AKT通路中重要蛋白表達的變化，觀察膠質(zhì)瘤細胞的生物學功能的變化，并探討其可能的致病機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本實驗于2020年7月至2021年6月在寧夏醫(yī)科大學寧夏醫(yī)學科學技術(shù)研究中心開展。U251 MG細胞系(人腦星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞)，形態(tài)為上皮細胞樣，培養(yǎng)特性為貼壁生長,購自中國科學院上海細胞庫；DMEM、胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；兔抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH抗體購自英國艾博抗公司；辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中橋生物科技公司；胰蛋白酶和青霉素、鏈霉素購自上海碧云天有限公司；二幸可寧酸(Bicinchoinic acid，BCA)法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自江蘇凱基公司；TranswellTM小室、基質(zhì)膠(Matrigel)購自美國康寧公司；CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技有限公司；Mil-lex-HV PVDF 膜(孔徑0.45 μm)、增強化學發(fā)光試劑盒購自美國默克密理博公司；4%多聚甲醛購自上海索萊寶公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；Multiskan GO型酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):將U251細胞從液氮中取出，迅速復蘇后置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，隔1 d更換培養(yǎng)基，待細胞生長至80%左右進行傳代，傳3到5代后，取處在對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 藥物處理:按照藥物使用說明書將處在對數(shù)生長期的U251細胞按3×105個/孔接種于6孔板內(nèi),待細胞貼壁后，對不同組細胞分別進行處理。對照組細胞不做任何處理；在DMSO組中加入與SH-6和LY294002混合液相同體積的DMSO溶液；在聯(lián)合組細胞中加入SH-6和LY294002混合液。繼續(xù)細胞培養(yǎng)后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 Western-Blot法檢測各組膠質(zhì)瘤細胞中PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白的表達：收集各組U251細胞并提取全蛋白，用BCA試劑盒對蛋白濃度進行定量，以20 μg/孔的上樣量用10% SDS-PAGE進行電泳分離總蛋白,電泳結(jié)束后，在電流270 mA、功率30～35 W條件下轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜置于50 g/L脫脂牛奶中封閉2 h。分別按照Marker上的分子量標記將PVDF膜剪下，之后分別加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT(稀釋度都為1∶2 000)一抗在4 ℃過夜孵育。PBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(稀釋度為1∶5 000)，室溫孵育1 h，洗膜，用增強化學發(fā)光試劑盒曝光顯影，并分析條帶灰度值。

1.2.4 流式細胞術(shù)

1.2.4.1 檢測細胞凋亡:將各組貼壁的膠質(zhì)瘤細胞消化脫壁，使其成為單細胞懸液并等分為兩份,其中一份用PBS離心洗滌2遍棄上清液，向每組中加入500 μL的1×Binding Buffer工作液重懸后，在避光的條件下向每組細胞中加入5 μL Annexin V-PE 和10 μL 7-AAD，輕柔混勻后孵育5 min，最后上機檢測并分析。

1.2.4.2 檢測細胞周期:向各組細胞中加入約0.5 mL預冷染色緩沖液，重懸細胞并重復一次。1 000 r/min左右離心3～5 min。棄上清液，加入0.5 mL培養(yǎng)基重懸細胞。用1 mL的槍頭反復吸取混勻細胞避免成團。最后向各組細胞中加入4 μL的RedNucleus I染色液，緩慢并充分混勻，在避光常溫條件下孵育20 min后上機分析。

1.2.5 細胞侵襲試驗:將無菌Transwell小室放于24孔板中，Transwell小室為上室，下室為24孔板。上下室均含有培養(yǎng)液，以聚碳酸酯膜相隔。Matrigel基質(zhì)膠按1∶9比例稀釋后，取50 μL加入Transwell小室，放于4 ℃冰箱中風干過夜。第2 d用槍頭吸干析出水化培養(yǎng)基。用不含血清的DMEM培養(yǎng)基將各組細胞稀釋到2×105個/mL。取200 μL細胞懸液于上室,下層培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。之后用棉簽擦去小室上層細胞,用30 g/L的多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，待風干后,顯微鏡觀察不同視野下的細胞數(shù)，拍照并統(tǒng)計穿過基質(zhì)膠的細胞個數(shù)。穿過基質(zhì)膠的結(jié)晶紫染色陽性細胞被認為是侵襲的細胞。

1.2.6 劃痕實驗:將各組U251細胞按照5×105/孔的密度種植到6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后用1 mL槍頭垂直于6孔板的底部劃線并用PBS洗掉脫落的細胞。用倒置顯微鏡在0、24 h時觀察劃痕的寬度，并統(tǒng)計在24 h內(nèi)劃痕向內(nèi)遷移的距離(μm)。

1.2.7 CCK-8實驗:將每組U251細胞稀釋至密度為2×104個/mL,吸取100 mL細胞懸液于96孔板中,在37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在0、24、48、72 h向96孔板中加入10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h;用酶標儀檢測不同時間點波長450 nm處的吸光度值，利用吸光度值反應細胞增殖能力并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 SH-6和LY294002聯(lián)合處理抑制PI3K/AKT信號通路中相關(guān)蛋白的表達：Western-blot檢測結(jié)果顯示，與對照組、DMSO組比較，聯(lián)合組中p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT的比例顯著降低(t=26.0,P<0.05);對照組、DMSO組之間差異無統(tǒng)計學意義(t=0.42,P>0.05)，見圖1(封二)。

2.2 SH-6和LY294002聯(lián)合處理抑制細胞的侵襲能力:每個視野Transwell檢測結(jié)果表明，聯(lián)合組的侵襲細胞數(shù)量為(549.3±17.50)個，明顯弱于對照組的(1 462±29.70)個及DMSO組的(1 653±35.44)個，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2(封二)。

2.3 SH-6和LY294002聯(lián)合處理后細胞遷移能力明顯降低:計算后得知，24 h時對照組、DMSO組、聯(lián)合組細胞遷移的距離分別為(42.87±6.03)μm、(43.20±6.25)μm 、(81.67±6.51)μm,聯(lián)合組細胞系的遷移能力距離明顯低于其他2組。

2.4 SH-6和LY294002聯(lián)合處理促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡:使用Annexin V-PE/7-ADD對細胞進行雙染并用流式分析后可以看得出，對照組U251細胞凋亡率為(1.06±0.12)%,DMSO組為(2.15±0.05)%，聯(lián)合組為(8.27±0.15)%，聯(lián)合組U251細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)。

2.5 SH-6和LY294002聯(lián)合處理對U251細胞周期的影響:流式細胞儀檢測各組膠質(zhì)瘤細胞周期的結(jié)果為在24 h后，對照組細胞在G0/G1期的比例為(4.41±0.19)%，DMSO組為(9.37±0.07)%，聯(lián)合組為(27.45±0.08)%，聯(lián)合組G0/G1期細胞比率增加(P<0.05),結(jié)果表明SH-6和LY294002聯(lián)合處理阻滯U251細胞周期在G0/G1期，見圖3(封二)。

2.6 SH-6和LY294002聯(lián)合處理抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖能力:隨著細胞培養(yǎng)時間的增加，各組細胞的增殖能力均呈增長趨勢，但聯(lián)合組細胞在72小時的吸光度值為0.86±0.67，明顯低于對照組的1.57±1.2、DMSO組的1.37±1.16，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4(封二)，顯示聯(lián)合組U251細胞在24、48、72 h時相對于對照組和DMSO組增殖能力下降。

3 討論

盡管醫(yī)療技術(shù)發(fā)展十分迅速，膠質(zhì)瘤相關(guān)診療技術(shù)已取得進步，但是膠質(zhì)瘤患者預后并沒有得到根本性的提高[5-6]。PI3K/AKT信號通路在調(diào)節(jié)細胞的增殖及凋亡方面有著重要作用[7-8]。PI3K/AKT的激活受到嚴格把控，受細胞外生長因子、氨基酸及葡萄糖的可用性的影響[9]。PI3K/AKT信號通路由有磷酸化磷脂酰肌醇3羥基的脂類激酶活性的PI3K及下游AKT組成，分為Ι、Ⅱ、Ⅲ型[9]，PI3K在細胞中激活磷脂酰肌醇激酶，同時也能調(diào)控AkT分子的活性。PI3K磷酸化后也可激活后影響細胞內(nèi)相關(guān)生物學信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控細胞的增殖、凋亡等[10-12]。眾所周知，腫瘤細胞內(nèi)部的代謝錯綜復雜，并非完全由一條通路代謝失調(diào)所引起。基于此，當我們同時使用兩種抑制劑后，該信號通路中的蛋白表達將會發(fā)生哪些變化呢？PI3K/AKT信號發(fā)生變化后該腫瘤細胞的細胞周期是怎么變化的呢？PI3K/AKT信號通路與細胞周期、細胞增殖等關(guān)系究竟如何呢？他們之間的相互作用關(guān)系如何？至今在國內(nèi)外尚未見相關(guān)文獻報道。本文使用了該通路抑制劑LY294002及最新的磷脂酰肌醇磷酸類似物SH-6。SH-6在肌醇環(huán)的第三位缺失羥基，并且有能夠修飾的脂肪族側(cè)鏈，具有更高的代謝穩(wěn)定性[13]。本研究采用Western-Blolt檢測PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白分子的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，相對于對照組及DMSO組，SH-6聯(lián)合LY294002可顯著抑制PI3K/AKT信號通路中p-AKT、p-PI3K的表達，AKT、PI3K的表達卻無明顯變化，p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K的比例降低。由此推測，聯(lián)合使用SH-6和LY294002可抑制膠質(zhì)瘤細胞中PI3K/AKT信號通路的表達，能有效抑制PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵蛋白磷酸化。最后我們通過細胞劃痕實驗、Transwell、流式分析實驗，CCK-8實驗進一步檢測SH-6和LY294002聯(lián)合處理對細胞增殖、侵襲及遷移能力的作用，結(jié)果顯示聯(lián)合組細胞增殖、遷移、侵襲能力均弱于對照組及DMSO組，而凋亡率明顯高于對照組及DMSO組(P<0.05)，表明SH-6和LY294002聯(lián)合處理可抑制PI3K/AKT信號通路，從而明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移、侵襲等生物學能力[14]。其原因可能是蛋白經(jīng)過磷酸化修飾后在PI3K/AKT信號通路中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)，蛋白的磷酸化修飾被抑制后，下游相關(guān)信號分子被進一步抑制，對腫瘤細胞生物學功能產(chǎn)生重要調(diào)控作用[15]。

綜上所述，同時抑制PI3K/AKT信號通路中的情況下能夠影響AKT/PI3K通路上相關(guān)蛋白磷酸化表達量的變化，從而進一步影響人腦膠質(zhì)瘤細胞的侵襲及遷移。本研究揭示了聯(lián)合使用SH-6和LY294002在抑制膠質(zhì)瘤細胞惡性表型中的重要作用，為今后膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的治療靶點。