陳婷，仲麗娟，高鳳婷

1.江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院病理科，江蘇東臺(tái) 224200；2.江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇東臺(tái) 224200；3.江蘇省南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院病理科，江蘇南京 211800

大腸腺癌為臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，隨我國(guó)飲食習(xí)慣、生活方式改變，腸道黏膜刺激性增加，大腸腺癌發(fā)生率逐漸增加，主要表現(xiàn)為腹痛、腹脹、便血等癥狀，隨病癥進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)消瘦、體質(zhì)量迅速下降、乏力、腹部包塊等癥狀，威脅其生命安全，需盡早診斷治療[1-2]。Raf-1蛋白激酶，為Raf基因編碼的蛋白產(chǎn)物，具絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，具促進(jìn)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化、細(xì)胞程序性死亡等作用，其水平升高可能會(huì)增加組織癌變風(fēng)險(xiǎn)[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具促進(jìn)血管新生重要因子，其水平升高可刺激局部血管數(shù)量增加，為局部組織增殖提供血運(yùn)支持，而惡性腫瘤組織生長(zhǎng)速度快，VEGF水平相應(yīng)增加，考慮可將其應(yīng)用至惡性腫瘤診斷中[4]。但目前為止，在大腸腺癌患者臨床診斷中，應(yīng)用Raf-1、VEGF診斷相關(guān)研究較少。為此，本次研究選取江蘇省東臺(tái)市人民醫(yī)院2021年1—12月期間收治的60例大腸腺癌患者為研究對(duì)象，探究上述兩種指標(biāo)對(duì)其診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院60例大腸腺癌患者為研究對(duì)象，男32例、女28例，年齡46~76歲，平均（62.10±4.27）歲；體質(zhì)指數(shù)（body mass index,BMI）18~32 kg/m2，平均（25.41±3.02）kg/m2；分化程度：低分化21例、中高度分化39例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；浸潤(rùn)深度：未突破漿膜層23例、突破漿膜層37例；Dukes分期：A期6例、B期19例、C期24例、D期11例。研究經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織診斷確診；②年齡≥18歲；③無(wú)精神系統(tǒng)疾病，可配合完成研究；④患者對(duì)研究知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織不滿足免疫組化法檢驗(yàn)者；②術(shù)前接受化療或放療治療者；③局部手術(shù)治療史者；④手術(shù)治療不耐受者。

1.3 方法

儀器及設(shè)備：顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS，CX40）；自 動(dòng) 切 片 機(jī)（德 國(guó) Leical，RM2245）；鼠抗人VEGF單克隆抗體（購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)）；鼠抗人Raf-1單克隆抗體（購(gòu)自LAB VISION）。

方法：樣本采用10%福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度為4 μm），蘇木素-伊紅染色，置于載玻片（涂有多聚賴氨酸），烤片（60℃，2 h）；二甲苯脫蠟、酒精梯度脫水；緩沖液浸泡（0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液，pH 6.0），加熱至100℃后保溫10 min后自然冷卻；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)沖洗，3次/min，共沖洗2次，甩去多余液體，滴加50 μL3%內(nèi)源性過(guò)氧化氫阻斷劑，孵育（室溫，10 min），甩去多余液體，加一抗，過(guò)夜（4℃）；PBS沖洗，5 min/次，共沖洗3次；甩去多余液體，滴加二抗，室溫孵育（30 min），PBS沖洗，3 min/次，共沖洗3次；甩去多余液體，滴加20 μL鏈霉素抗生物素過(guò)氧化物酶溶液；去掉PBS溶液，滴加100 μLDAB顯色液完成顯色反應(yīng)，后以蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化后，PBS沖洗；酒精梯度干燥脫水，二甲苯透明，樹膠封片后鏡下觀察。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較兩種指標(biāo)在大腸腺癌中的陽(yáng)性檢出率。①Raf-1蛋白激酶陽(yáng)性檢出標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒[5]；②VEGF陽(yáng)性檢出標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性[6]；以PBS一抗為陰性對(duì)照；400倍鏡下隨機(jī)選擇切片內(nèi)5個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量200個(gè)，共計(jì)1 000個(gè)細(xì)胞；陰性標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量≤10%，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量>10%；③聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：任意一種指標(biāo)為陽(yáng)性，即為聯(lián)合檢查陽(yáng)性。（2）比較不同特征（腫瘤直徑、不同分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、Dukes分期）下Raf-1蛋白激酶、VEGF陽(yáng)性檢出率。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種指標(biāo)在大腸腺癌中陽(yáng)性檢出率

Raf-1蛋白激酶聯(lián)合VEGF對(duì)病灶陽(yáng)性檢出率為60.00%，較其單獨(dú)診斷高（28.33%、41.67%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩種指標(biāo)在大腸腺癌中陽(yáng)性檢出率

2.2 兩種指標(biāo)在不同特征大腸腺癌中陽(yáng)性檢出率

VEGF在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度突破漿膜層、Dukes分期為C期+D期中陽(yáng)性檢出率分別為62.50%、54.05%、54.29%，較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度未突破漿膜、Dukes分期為A期+B期27.78%、21.74%、24.00%高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF在不同腫瘤直徑、腫瘤分化程度中陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤直徑、分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、Dukes分期中陽(yáng)性檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩種指標(biāo)在不同特征大腸腺癌中陽(yáng)性檢出率 [n(%)]

3 討論

Raf蛋白激酶，由raf基因編碼完成，其中Raf-1蛋白激酶廣泛存在于終末分化組織[7-8]。在大腸癌發(fā)生過(guò)程中，Raf-1蛋白激酶表達(dá)增高，可使MAPKs通路被激活，抑制大腸癌組織中Colo-205、SW480細(xì)胞中P27KIP1、P21WAF1等抑癌基因表達(dá)，加速細(xì)胞周期，使癌基因、未能修復(fù)完成的受損基因大量聚集、合成，刺激腸黏膜細(xì)胞異常增生，最終刺激大腸腺癌產(chǎn)生[9-10]。

VEGF主要功能為刺激血管生成，在對(duì)腫瘤影響中，VEGF會(huì)直接作用在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，增加血管通透性，使血漿纖維素向外滲出，為血管新生提供細(xì)胞遷移途徑，在為腫瘤組織提供血運(yùn)同時(shí)，為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供網(wǎng)絡(luò)通道[11-12]。

本次研究中，對(duì)大腸腺癌組織的Raf-1蛋白激酶、VEGF陽(yáng)性檢出率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，兩種指標(biāo)聯(lián)合檢查后陽(yáng)性檢出率較單獨(dú)檢查高，而腫瘤不同特征陽(yáng)性檢出率比較顯示，Raf-1蛋白激酶在不同腫瘤特征檢出率中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示Raf-1蛋白激酶只參與腫瘤發(fā)生過(guò)程，但對(duì)其發(fā)展過(guò)程無(wú)明顯影響；而VEGF在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度、Dukes分期中陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即腫瘤進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)VEGF陽(yáng)性檢出率增加的情況[13-14]。兩種指標(biāo)聯(lián)合診斷后，可綜合腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程進(jìn)行其陽(yáng)性檢出率評(píng)估，可互相彌補(bǔ)不足，進(jìn)而可提升聯(lián)合診斷陽(yáng)性檢出率。胡伊豆等[15]在對(duì)大腸癌患者研究中，以免疫組化法檢測(cè)其VEGF陽(yáng)性情況，發(fā)現(xiàn)72例大腸癌患者中，VEGF陽(yáng)性檢出率為61.11%，較本次41.67%稍高，考慮原因可能與樣本選擇存在差異性有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲深度達(dá)到漿膜外、腫瘤>5 cm時(shí)，VEGF陽(yáng)性檢出率顯著提升（66.67% vs 47.62%，70.59% vs 38.10%，70.97% vs 53.66%），提示VEGF陽(yáng)性檢出率與腫瘤發(fā)展有關(guān)，與本次研究觀點(diǎn)一致。但該研究未給出Raf-1蛋白激酶檢出率情況，且未對(duì)多種免疫組化指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合診斷研究，僅研究不同指標(biāo)在腫瘤組織中陽(yáng)性檢出率，因此本次研究結(jié)果更具優(yōu)勢(shì)，可為大腸癌診斷、預(yù)后評(píng)估提供更準(zhǔn)確參考依據(jù)。

綜上所述，大腸腺癌患者VEGF陽(yáng)性檢出率提升，提示存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度增加、Dukes分期增加，可用于診斷及預(yù)后評(píng)估，且兩種指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用可提升陽(yáng)性檢出率。