肖 敏 任雨琳 吳春鳳 由長輝 粟燕輝 徐洪來

(柳州市人民醫(yī)院1 皮膚科，2 科研科，3 肝膽外科，廣西柳州市 545006)

銀屑病是一種常見的炎癥性皮膚病，2019年全世界約有1.25億人患有銀屑病[1]。據(jù)統(tǒng)計，2021年中國的銀屑病患病率為0.1%～3%[2]。銀屑病主要表現(xiàn)為慢性鱗屑性丘疹斑塊，并與多種合并癥相關(guān)，如心臟代謝疾病、腦卒中、慢性腎臟疾病、炎癥性關(guān)節(jié)炎、抑郁和淋巴瘤等[3]。銀屑病病程長、反復(fù)發(fā)作，可降低患者的生活質(zhì)量，造成社會和個人的沉重負擔(dān)。最近一項研究表明，中重度銀屑病患者的壽命比健康人群短6年[4]。目前無論是生物制劑還是免疫抑制劑均不能有效抑制銀屑病的復(fù)發(fā)，同時存在損害肝腎功能和引發(fā)機體感染的風(fēng)險[5-6]。中醫(yī)對于銀屑病的治療具有獨到的見解，并取得了較好的效果。銀屑病屬于中醫(yī)理論的“血分”范疇， 中醫(yī)將銀屑病分為血瘀證、血熱證和血燥證3個基本證型，最終形成“從血論治”的治療理念[7-8]。雞血藤為豆科植物密花豆的干燥藤莖，味苦甘，性溫，歸肝腎經(jīng)，具有逐瘀活血、益氣養(yǎng)血等功效[9]。很多中醫(yī)臨床醫(yī)師采用以雞血藤作為君藥或臣藥的復(fù)方治療銀屑病，如養(yǎng)血解毒湯、活血散瘀湯等[10]。還有學(xué)者將雞血藤配合西藥用于治療銀屑病，療效顯著[11]。因此，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，基于“藥物-化合物-作用靶點-疾病”的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，分析雞血藤治療銀屑病的關(guān)鍵作用靶點、分子生物學(xué)過程和信號通路等，以探討其治療銀屑病的相關(guān)作用機制。

1 資料與方法

1.1 雞血藤活性成分的篩選和靶點預(yù)測 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP；http://old.tcmsp-e.com/tcmspw.php)，篩選出雞血藤的活性成分，篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug likeness，DL)≥0.18。通過TCMSP預(yù)測雞血藤活性成分的作用靶點，使用UniProt(http://www.uniprot.org/)和STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對所有靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化校正。

1.2 銀屑病相關(guān)靶點的篩選 利用GeneCards?(https://www.genecards.org/)、OMIM?(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫，以“psoriasis”為關(guān)鍵詞搜索與銀屑病相關(guān)靶點，對銀屑病相關(guān)靶點進行篩選、匯總、去重后，將其與上述1.1所得的雞血藤活性成分作用靶點利用VENNY 2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)進行取交集，得到共同靶點，即認為是雞血藤活性成分干預(yù)銀屑病的主要潛在靶點。

1.3 藥物-活性成分-靶點-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.2中獲得的主要潛在靶點及其對應(yīng)的雞血藤活性成分導(dǎo)入CytoScape 3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。進行拓撲學(xué)分析,設(shè)置節(jié)點的形狀、大小以及顏色透明度，得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.2中獲得的主要潛在靶點上傳至在線分析工具STRING平臺，將Organisms設(shè)定為“Homo saspiens”，最小交互分?jǐn)?shù)取0.7高度交互值，隱藏圖中游離的蛋白質(zhì)，輸出string_interactions．tsv 文件，導(dǎo)入CytoScape 3.7.0軟件進行可視化分析處理，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI) 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因生物學(xué)功能和通路富集分析 利用MetaScape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)，針對1.2中獲得的主要潛在靶點進行基因本體論(Gene Ontology，GO)生物學(xué)功能分析，包括生物學(xué)過程、細胞成分和分子功能，根據(jù)P≤0.01篩選出前8名GO生物學(xué)功能，并進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，根據(jù)P≤0.01篩選出前20名KEGG通路。利用R語言軟件構(gòu)建KEGG通路分析的氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 雞血藤的活性成分及其作用靶點 最終獲得24個雞血藤活性成分，對應(yīng)137個靶點，見表1?；贕eneCards?和OMIM?數(shù)據(jù)庫，通過篩選、去重得到銀屑病靶點共4 104個。將雞血藤活性成分作用靶點與銀屑病相關(guān)靶點取交集，獲得共同靶點86個(見圖1)，包括白細胞介素(interleukin,IL)-6、Caspase-3、Caspase-8、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)1、MMP9、細胞周期蛋白依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，CDK1)、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)、鈉依賴性血清素轉(zhuǎn)運體(sodium-dependent serotonin transporter，SLC6A4)、熱休克蛋白90α家族A類成員1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等。

表1 雞血藤活性成分的篩選結(jié)果

圖1 雞血藤活性成分作用靶點與銀屑病相關(guān)靶點的共同靶點韋恩圖

2.2 藥物-活性成分-靶點-疾病可視化網(wǎng)絡(luò) 將86個主要潛在靶點及對應(yīng)的20個雞血藤活性成分輸入CytoScape 3.7.0軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-靶點-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示，雞血藤化學(xué)成分-銀屑病疾病靶點網(wǎng)絡(luò)共有108個節(jié)點350條邊。從度值大小上來看(度值>20)，雞血藤化合物成分排名前4位的為MOL000006(木犀草素)、MOL000392(芒柄花黃素)、MOL000497(甘草查爾酮A)、MOL000358(β-谷甾醇)，提示這些化合物成分在雞血藤治療銀屑病中發(fā)揮著重要作用。見圖2。

圖2 藥物-活性成分-靶點-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將86個主要潛在治療靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，通過CytoScape 3.7.0軟件進行可視化,得到治療靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值的大小進行排列，見圖3。此網(wǎng)絡(luò)共有75個節(jié)點(86個靶點中除去了11個游離靶點)，通過 642 條邊進行相互作用。其中，雞血藤干預(yù)銀屑病的主要潛在靶點中，度值排前5的靶點依次為RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(RAC-alpha serine/threonine protein kinase 1,AKT1)、信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子3 (signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、腫瘤抗原p53(tumor antigen p53,TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、Caspase-3。利用CytoScape軟件分析插件Node Degree Distribution，將PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學(xué)分析，靶點度值前30的靶點(度值≥17)。見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果

2.4 雞血藤干預(yù)銀屑病主要潛在靶點的生物學(xué)功能和通路分析 GO功能富集分析結(jié)果提示，雞血藤干預(yù)銀屑病的主要潛在靶點參與和/或調(diào)控了1 442個生物學(xué)過程(包括凋亡信號通路、缺氧反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等)、67個細胞成分(包括溶酶體、線粒體膜、核染色體等)、115個分子功能(包括細胞因子活性、蛋白酶結(jié)合、TNF受體結(jié)合等)。根據(jù)P≤0.01篩選出前8個GO生物學(xué)功能，見表3。KEGG 通路分析共獲得184條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、乙型肝炎信號通路、IL-17信號通路、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、丙型肝炎信號通路、p53信號通路、凋亡信號通路、Th17細胞分化信號通路、TNF信號通路等，見圖4、圖5、圖6。

表3 雞血藤對銀屑病作用靶點的GO分析

續(xù)表3

圖4 KEGG通路分析氣泡圖(前20條通路)

圖5 PI3K-AKT信號通路

圖6 IL-17信號通路

3 討 論

中醫(yī)藥在人體養(yǎng)生、疾病預(yù)防和治療方面發(fā)揮著重要的作用。雖然中藥應(yīng)用廣泛，但由于其“多成分、多靶點”的特點，通過實驗方法在分子水平上闡明其對疾病的作用機制，仍然存在著很大的技術(shù)難度，阻礙了中藥現(xiàn)代化的研究發(fā)展[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是藥理學(xué)的一個分支，由生物信息學(xué)、高通量組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)組成，可以從多組分、多靶點、多渠道研究中藥的作用機制。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)被廣泛用于中藥單體和方劑的研究，用于探索中藥單體和方劑對疾病的藥理作用和分子機制[13]。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，揭示雞血藤治療銀屑病的藥理作用。藥物-活性成分-靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖顯示，木犀草素、芒柄花黃素、甘草查爾酮A、β-谷甾醇為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點，提示這些活性成分在雞血藤治療銀屑病中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，銀屑病的發(fā)病機制與γ干擾素水平的增加顯著相關(guān)，γ干擾素能促進了熱休克蛋白90在人永生化角質(zhì)形成細胞中的轉(zhuǎn)錄表達和外泌體分泌，而木犀草素可以較低γ干擾素的水平，從而抑制熱休克蛋白90的表達和外泌體分泌，緩解銀屑病的癥狀[14]。還有研究表明，用含甘草查爾酮A的軟膏涂抹銀屑病患者的皮膚，可以減少銀屑病的紅斑丘疹鱗屑[15]。然而目前關(guān)于芒柄花黃素、β-谷甾醇在銀屑病中的研究較少，或可作為未來的研究方向。

本研究的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，度值排前5位的靶點依次為AKT1、STAT3、p53、JUN、Caspase-3，上述5個靶點與其他靶點發(fā)生的相互作用最多，提示這5個靶點是雞血藤治療銀屑病的有效靶點。研究表明，銀屑病病變中的角質(zhì)形成細胞的AKT1表達水平顯著升高，而AKT1表達水平升高又可以促進銀屑病角質(zhì)形成細胞增殖，抑制AKT1表達水平可能對銀屑病的治療具有積極作用[16]。STAT3是銀屑病和銀屑病樣炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，STAT3不僅可以直接激活I(lǐng)L-17A和IL-17F基因啟動子，還可以促進Th17細胞分化和增殖，在銀屑病患者的皮膚中可以發(fā)現(xiàn)高水平活化的STAT3，因此，STAT3的激活在銀屑病的發(fā)病和發(fā)展中起核心作用[17]。銀屑病患者皮損中p53呈高表達水平，p53的表達與角質(zhì)形成細胞的增殖之間具有正關(guān)系，p53可促進角質(zhì)形成細胞過度增殖[18]。JUN在銀屑病患者皮損的整個表皮層中均呈高表達水平，其可促進角質(zhì)形成細胞的增殖和分化[19]。銀屑病皮損中Caspase-3表達水平低于正常皮膚，減少了角質(zhì)形成細胞的凋亡，導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞的增殖，甲氨蝶呤和英夫利昔單抗均能促使銀屑病患者皮損中Caspase-3的表達，從而促進角質(zhì)形成細胞凋亡[20-21]。

本研究通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，雞血藤治療銀屑病的主要潛在靶點主要涉及膜筏、膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、質(zhì)膜筏、囊腔等細胞成分，以及激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能，這些靶點可通過激素反應(yīng)、氮化合物反應(yīng)、紫外線反應(yīng)、有機氮化合物反應(yīng)、凋亡信號通路等生物學(xué)過程來影響銀屑病的發(fā)生和發(fā)展。本研究的KEGG通路分析結(jié)果顯示，雞血藤治療銀屑病的主要潛在靶點涉及的信號通路主要包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、P13K/AKT信號通路、人巨細胞病毒感染信號通路、乙型肝炎信號通路、IL-17信號通路、丙型肝炎信號通路、胰腺癌信號通路、小細胞肺癌信號通路等。這些通路是多個靶點共同調(diào)控的，例如熱休克蛋白90、cyclin-1、CDK、ERK、BCL2、p53、PI3K、p21等靶點富集在PI3K/AKT信號通路上。研究表明，銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，其中皮膚浸潤的Th(Th1、Th17和Th22)通過釋放促炎細胞因子IL-17A、IL-22、TNF-α和γ干擾素來促進角質(zhì)形成細胞的過度增殖和分化[22]；角質(zhì)形成細胞本身釋放的細胞因子IL-36也能促進自身的增殖和分化[23]。這些細胞因子可激活PI3K/AKT/MTOR信號通路，從而進一步促進角質(zhì)形成細胞的增殖并抑制角質(zhì)形成細胞凋亡[24]。PI3K被認為是治療銀屑病的有效靶點，抑制PI3K能降低銀屑病小鼠模型的表皮厚度、浸潤免疫細胞的數(shù)量及銀屑病相關(guān)細胞因子水平。此外，阻斷PI3K/AKT/MTOR信號通路還能抑制銀屑病患者的T淋巴細胞的增殖和活化過程[25]。IL-4、IL-6、MMP1、TNF-α、ERK、CCX2、AP1等靶點富集在IL-17信號通路上。IL-23/IL-17軸在與銀屑病相關(guān)的皮膚和關(guān)節(jié)表現(xiàn)中起著關(guān)鍵作用[26]。IL-17是由Th17亞群產(chǎn)生的細胞因子，Th-17能夠激活各種靶細胞(如破骨細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞)的效應(yīng)分子，最終激活“效應(yīng)細胞”，如角質(zhì)形成細胞、B淋巴細胞、破骨細胞前體和巨噬細胞。IL-17可以促進角質(zhì)形成細胞的增殖，以及促進肥大細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞的聚集和活化，同時減少黏附分子的表達，從而破壞皮膚屏障，導(dǎo)致銀屑病患者皮損形成和關(guān)節(jié)破壞[27]。目前，靶向IL-23/IL-17軸的生物制劑(如司庫奇尤單抗)已被用于治療銀屑病患者，并取得很好的效果[28]。

綜上所述，雞血藤治療銀屑病是多種活性成分的共同作用結(jié)果，雞血藤能通過多靶點、多信號通路對銀屑病產(chǎn)生效應(yīng)。但是，本研究未考慮雞血藤劑量、煎藥方式和炮制方法等對銀屑病的影響，也未進一步分析雞血藤對銀屑病的交集靶點及信號通路的影響，因此本研究有一定局限性，有待今后深入研究。