林岳巖 張秀玲 韋 明 黃 敏 張瀝仁 朱莉莉 覃議賢 張錫流

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣西南寧市 530023)

2020年，肺癌的病死例數(shù)位居全球癌癥的首位，新發(fā)病例數(shù)位居第二[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)為肺癌的主要類型。傳統(tǒng)醫(yī)療手段治療NSCLC的效果并不顯著，其中ⅠB期患者的5年生存率僅為68%，而ⅣA期、ⅣB期患者的生存率不足10%[2]。雖然免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)NSCLC具有較好的療效，但是有研究表明，免疫治療僅能為20%～30%的患者提供長(zhǎng)久的療效[3]。因此，積極探尋新的治療方案迫在眉睫。鐵皮石斛是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中常用的名貴中草藥，有滋陰強(qiáng)腎、補(bǔ)中泄熱等功效?，F(xiàn)已有諸多臨床試驗(yàn)證實(shí)，鐵皮石斛具有降低白細(xì)胞介素2、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子水平[4]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[5-6]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]等作用，而鐵皮石斛治療腫瘤的主要有效成分為柚皮素、毛蘭素、石斛酚等[9]，但目前鐵皮石斛在肺癌領(lǐng)域中的研究較為少見(jiàn)。肺腺癌屬于NSCLC，故本實(shí)驗(yàn)以肺腺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，探究鮮鐵皮石斛制劑對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其可能作用機(jī)制，旨在為臨床治療NSCLC提供新的思路和方案。

1 材料與方法

1.1 試劑 鮮鐵皮石斛產(chǎn)自云南文山壯族苗族自治州，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備成濃度為0.4 g/mL的鮮鐵皮石斛制劑[通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，0.22 μm 聚醚砜濾過(guò)膜(Millipore公司)過(guò)濾]?；A(chǔ)培養(yǎng)基DMEM(Gibco公司，批號(hào)：C11995500BT)，PBS、雙抗溶液、胰酶、Hoechst 33258 染色液(Solarbio公司，批號(hào)：P1020、P1400、T1300、C0021)，ExCell南美胎牛血清[依科賽生物科技(太倉(cāng))有限公司，批號(hào)：FSP500],CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所，批號(hào)：CK04)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 CKX41SF型倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)，DMI3000B型倒置熒光顯微鏡(Leica公司)，DMi8型倒置熒光顯微鏡(Leica公司)，Multiskan Sky型觸屏版全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific公司)，D-37520型離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司)，MCO-18AIC 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (日本普和希株式會(huì)社)，HR1200-ⅡB2型生物安全柜(中國(guó)海爾公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。采用含90%DMEM、10%胎牛血清、1%雙抗配置的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置培養(yǎng)箱的條件為37 ℃、5% CO2、飽和濕度；待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時(shí)傳代，適當(dāng)控制傳代細(xì)胞數(shù)，3～4 d傳代一次，傳代前先用PBS清洗培養(yǎng)瓶3次，然后用1.2 mL胰酶消化細(xì)胞2～2.5 min，并輕拍細(xì)胞瓶側(cè)壁以震動(dòng)未脫落細(xì)胞，800～1 000 r/min離心3～5 min，使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 將培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)良好形態(tài)健康且融合度達(dá)70%～80%的細(xì)胞收集至15 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min后以完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以每孔2.5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200 μL 完全培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，吸出剩余培養(yǎng)基，分別加入濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的鮮鐵皮石斛(分別設(shè)為0.5 mg/mL組、1.0 mg/mL組、1.5 mg/mL組、2.0 mg/mL組)與完全培養(yǎng)基混合液(分別加入15 μL、10 μL、5 μL、0 μL超純水及180 μL培養(yǎng)基以控制藥物濃度，使任意指定濃度藥劑混合液中完全培養(yǎng)基濃度不變)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)箱中在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下分別培養(yǎng)24 h、48 h后，拿出96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板傾斜一定角度后吸出藥劑及完全培養(yǎng)基混合液以減少制劑對(duì)CCK-8試劑的影響，減小檢測(cè)所產(chǎn)生的誤差，加入10%的CCK-8與90%的DMEM各100 μL，將干預(yù)24 h的細(xì)胞與干預(yù)48 h的細(xì)胞分別避光孵育80 min、60 min后，置于酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率 = [(對(duì)照孔吸光度值 — 實(shí)驗(yàn)孔吸光度值) / (對(duì)照孔吸光度值 — 空白孔吸光度值)] × 100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。其中空白孔僅加入培養(yǎng)液，對(duì)照孔加入培養(yǎng)液與細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)孔的細(xì)胞為各濃度鮮鐵皮石斛干預(yù)組細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞分為空白組和鮮鐵皮石斛組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因高濃度組細(xì)胞死亡過(guò)多，無(wú)法繼續(xù)觀察劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)步驟僅采用IC50作為鮮鐵皮石斛組的干預(yù)濃度。收集培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)良好形態(tài)健康且融合度達(dá)70%～80%的A549細(xì)胞至15 mL離心管，以1 000 r/min離心5 min后采用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔約3×105個(gè)的密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待6～8 h后觀察細(xì)胞已完全貼壁，用 200 μL槍頭垂直于孔板沿中線劃痕，劃痕動(dòng)作適度，劃痕后沿孔壁緩慢加入PBS清洗3次以去除劃下的細(xì)胞。隨后在鮮鐵皮石斛組細(xì)胞中加入2 mL濃度為IC50的鮮鐵皮石斛制劑，空白組加入等體積完全培養(yǎng)液，干預(yù)后將細(xì)胞放置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)0 h、12 h、24 h 后，在DMi8型倒置熒光顯微鏡下，每孔選取3個(gè)視野(20倍鏡)拍照，用Image J軟件測(cè)量劃痕面積，根據(jù)所得面積，通過(guò)計(jì)算愈合率以評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力(愈合率越大，細(xì)胞遷移能力越低)，愈合率=1-(某時(shí)間點(diǎn)劃痕面積/0h劃痕面積)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好形態(tài)健康且融合度達(dá)70%～80%的A549細(xì)胞收集于15 mL離心管中，以1 000 r/min離心5 min后采用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔3.0×106個(gè)接種于 6 孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。 將細(xì)胞分為低濃度組、中濃度組、高濃度組和空白組，其中低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞按0.5倍IC50、1.0倍IC50、2.0倍IC50加入鮮鐵皮石斛制劑2 mL，空白組不做干預(yù)。干預(yù)24 h后棄培養(yǎng)基，使用PBS將Hoechst 33258熒光染色液進(jìn)行100倍稀釋后將其加入細(xì)胞中，1 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育25 min后，取出細(xì)胞，用PBS清洗2次后，置于DMI3000B型倒置熒光顯微鏡(Leica公司)下觀察，拍照并記錄。Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，Hoechst 33258能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其發(fā)出藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33258 比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度比正常細(xì)胞高，因此凋亡細(xì)胞數(shù)越多，釋放的藍(lán)紫色熒光信號(hào)越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較釆用SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)比較釆用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度鮮鐵皮石斛對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響 干預(yù)24 h后，1.5 mg/mL組、2.0 mg/mL組A549細(xì)胞的增殖抑制率高于0.5 mg/mL組(P<0.05)，但1.0 mg/mL組與0.5 mg/mL組A549 細(xì)胞的增殖抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1.0 mg/mL組、1.5 mg/mL組、2.0 mg/mL組A549細(xì)胞的增殖抑制率依次升高(均P<0.05)。干預(yù)48 h后，0.5 mg/mL組、1.0 mg/mL組、1.5 mg/mL組、2.0 mg/mL組A549細(xì)胞的增殖抑制率依次升高(均P<0.05)。除0.5 mg/mL組外，其余濃度組干預(yù)48 h后A549細(xì)胞的增殖抑制率均高于干預(yù)24 h后(均P< 0.05)。見(jiàn)表1。因考慮到該實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)環(huán)境下，干預(yù)48 h的細(xì)胞其培養(yǎng)液損耗、細(xì)胞健康情況下降等不定因素影響增多，故取鮮鐵皮石斛干預(yù)24 h的IC50為本實(shí)驗(yàn)的IC50，經(jīng)計(jì)算，鮮鐵皮石斛干預(yù)24 h的IC50約為2.0 mg/mL。

表1 不同濃度鮮鐵皮石斛作用后A549細(xì)胞的增殖抑制率(x±s,%)

2.2 鮮鐵皮石斛對(duì)A549細(xì)胞遷移力的影響 干預(yù)12 h、24 h后鮮鐵皮石斛組細(xì)胞的愈合率均高于空白組(均P<0.05)，即細(xì)胞遷移率降低。見(jiàn)表2、圖1。

表2 兩組A549細(xì)胞的劃痕愈合率比較(x±s,%)

圖1 鮮鐵皮石斛作用后 A549 細(xì)胞的遷移情況(倒置顯微鏡，×20)

2.3 不同濃度鮮鐵皮石斛對(duì)A549細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 空白組的肺腺癌A549細(xì)胞熒光略顯微弱，細(xì)胞核分布均勻，大體呈淡藍(lán)色染色，偶見(jiàn)亮藍(lán)色染色的凋亡細(xì)胞；與空白組比較，低、中、高組細(xì)胞在熒光顯微鏡下出現(xiàn)強(qiáng)熒光反應(yīng)，部分細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞出現(xiàn)較為明顯的凋亡形態(tài)學(xué)特征，且細(xì)胞核呈亮藍(lán)色染色的細(xì)胞數(shù)量隨濃度增加呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。見(jiàn)圖 2。

圖2 不同濃度鮮鐵皮石斛作用后A549細(xì)胞的凋亡情況(熒光倒置顯微鏡，×200)

3 討 論

在細(xì)胞癌變過(guò)程中，維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、增殖、凋亡等的諸多基因及蛋白的表達(dá)出現(xiàn)失衡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性增殖等情況，這一過(guò)程涉及多種致癌基因的激活、抑癌基因的失活和基因突變。如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中治療癌癥的重點(diǎn)之一。肺癌作為患病率及致死率均較高的癌癥，其致病因素尚未完全明確。目前認(rèn)為肺癌常見(jiàn)的致病原因是相對(duì)長(zhǎng)期、較高頻率的吸煙，長(zhǎng)期接觸致癌物、空氣污染、人體免疫狀況、遺傳因素和代謝活動(dòng)也與肺癌有關(guān)。目前，傳統(tǒng)放化療治療肺癌的療效欠佳，而免疫治療及靶向治療存在耐藥的情況[2-3],故尋求新的治療方案顯得尤為重要。

中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多層次的治療作用。鐵皮石斛作為名貴中藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰“其味甘，平。主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞，羸瘦，強(qiáng)陰，久服厚腸胃，輕身延年”，《玉楸藥解》亦言其能降沖泄?jié)瘛压菑?qiáng)筋。在現(xiàn)代中醫(yī)理論中，腫瘤的形成與血瘀氣滯、機(jī)體邪不勝正等有關(guān)。而鐵皮石斛能填氣血之海，補(bǔ)中焦之勞傷，五臟之虛羸，其能提高免疫力，對(duì)抗腫瘤之病邪。鐵皮石斛的主要有效成分為柚皮素、毛蘭素、石斛酚，現(xiàn)代研究表明這些活性成分可通過(guò)多途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。其中，柚皮素具有抗氧化和抗炎活性[10]，如在乳腺癌細(xì)胞中，柚皮素能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期，使癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；其還可抑制人肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯腫瘤進(jìn)展[12]。毛蘭素同樣具有類似的治療潛能，其能夠調(diào)節(jié)多種癌癥相關(guān)途徑，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、侵襲、遷移、血管生成和體內(nèi)外自噬[13]。毛蘭素可誘導(dǎo)T47D人乳腺癌細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡，其促凋亡作用依賴于降低B細(xì)胞淋巴瘤-2的表達(dá)和激活Caspase信號(hào)通路[14]。石斛酚亦可以調(diào)節(jié)多種癌基因相關(guān)蛋白的功能，如正向調(diào)控TP53蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。本研究應(yīng)用未經(jīng)過(guò)提取的純天然鮮鐵皮石斛制劑干預(yù)肺腺癌A549細(xì)胞。結(jié)果顯示，鮮鐵皮石斛可抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，且具有一定的濃度和時(shí)間依賴性，同時(shí)其可抑制A549細(xì)胞的遷移，提示純天然的鮮鐵皮石斛在體外具有抗肺腺癌的作用。進(jìn)一步行免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鮮鐵皮石斛呈濃度依賴性地促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。由此推測(cè)，鮮鐵皮石斛可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡從而抑制肺腺癌A549細(xì)胞的增殖與遷移。

綜上所述，鮮鐵皮石斛能夠抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖及遷移能力，這一作用可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中采用完整的鮮鐵皮石斛制劑而非相應(yīng)提取成分進(jìn)行干預(yù)，亦是為了從根源探究中草藥在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“食其氣，用其味”的理論根據(jù)。