陸玉嬌 楊月容 陳 宇 羅 柳 胡麗珊 米 佳

(南寧市第一人民醫(yī)院兒科，廣西南寧市 530021)

1989～2015年，中國(guó)哮喘監(jiān)測(cè)地區(qū)0～14歲兒童的哮喘患病率為2.6%，且患病率呈上升趨勢(shì)[1]。如果兒童時(shí)期哮喘久治不愈或治療效果不佳，患兒的生長(zhǎng)發(fā)育、學(xué)習(xí)、生活都會(huì)受到嚴(yán)重影響?？人宰儺愋韵?cough variant asthma，CVA)是以慢性咳嗽為主要臨床表現(xiàn)的一種哮喘表型[1]。CVA的發(fā)病原因復(fù)雜多樣，近年來(lái)，遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展促進(jìn)了哮喘遺傳學(xué)方面的研究。研究表明，腎上腺素能受體β2(adrenoceptor beta 2,ADRB2)、Ⅱ型Fcε受體(Fc epsilon receptor Ⅱ,FCER2)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-18、IL-13等基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)病有著密切關(guān)聯(lián)[2-5]。其中，ADRB2基因單核苷酸多態(tài)性的改變主要包括第16位的精氨酸突變?yōu)楦拾彼?Arg16Gly)、第27位的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼?Gln27Glu)、第34位的纈氨酸突變?yōu)榈鞍彼?Val34Met)等[6]。Mohamed-Hussein等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ADRB2基因Arg16Gly和Gln27Glu位點(diǎn)的多態(tài)性與哮喘嚴(yán)重程度和患兒治療反應(yīng)有關(guān)。Jovicic等[8]的研究也表明，ADRB2基因Arg16Gly位點(diǎn)的多態(tài)性可能是哮喘嚴(yán)重程度和患兒對(duì)沙丁胺醇藥物反應(yīng)的決定因素。因此，ADRB2基因發(fā)生缺陷，會(huì)對(duì)哮喘嚴(yán)重程度和患兒的藥物治療反應(yīng)產(chǎn)生一定的影響。此外，Ⅰ型Fcε受體β(Fc epsilon receptor Ⅰβ,FCER1B)是IgE的高親和力受體，參與IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)。該基因變異后可引起血清總IgE水平升高，使肥大細(xì)胞等釋放炎性介質(zhì)增多，從而導(dǎo)致哮喘的發(fā)生[9]。

由于遺傳和環(huán)境因素在不同種族人群中起著不同的作用，因此國(guó)內(nèi)外有關(guān)基因多態(tài)性與哮喘之間的關(guān)系的研究結(jié)論差異較大[10-11]。在國(guó)內(nèi)，針對(duì)漢族哮喘患者的相關(guān)研究較為普遍，而針對(duì)壯族等少數(shù)民族哮喘患者的研究較少。此外，有研究顯示，基因多態(tài)性對(duì)不同民族(漢族與壯族)人群疾病易感性的影響相差較大[12-13]。因此本研究選擇ADRB2基因Arg16Gly位點(diǎn)和FCER1B基因的Glu237Gly位點(diǎn)，探究壯族1～6歲CVA患兒上述基因位點(diǎn)多態(tài)性與治療效果和肺功能改善情況的相關(guān)性，為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥方案提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入2018年1月至2020年1月南寧市第一人民醫(yī)院收治的壯族CVA患兒為研究對(duì)象，隨訪患兒的藥物治療效果及治療3個(gè)月后的肺功能。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[14]中有關(guān)CVA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡1～6歲；(3)初次確診，未接受過(guò)相關(guān)治療；(4)患兒父母均為壯族(以身份證的信息為準(zhǔn))；(5)患兒家屬同意參加本次研究，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病，如重癥肺炎、支氣管肺發(fā)育不良、毛細(xì)支氣管炎、喉炎等；(2)患有嚴(yán)重的感染性疾病；(3)心源性哮喘；(4)不耐受激素治療；(5)未完成隨訪。最終納入88例CVA患兒，包括男童41例、女童47例；患兒年齡1～6歲，其中1～<2歲8例(9.09%)，2～<3歲21例(23.86%)，3～<4歲29例(32.96%)，4～<5歲19例(21.59%)，5～6歲11例(12.50%)。本研究已通過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 治療方案 所有患兒均接受布地奈德粉吸入劑(AstraZeneca公司，規(guī)格：0.1 mg×200吸；200 μg/次，2次/d)聯(lián)合孟魯司特鈉咀嚼片[默沙東(中國(guó))有限公司，規(guī)格：0.1 g/片；10 mg/次，1次/d]治療。相關(guān)研究表明CVA的治療時(shí)間應(yīng)≥8周[15]，因此本研究跟蹤隨訪患兒治療3個(gè)月后的治療效果及肺功能。

1.3 治療效果的判斷 參考《臨床疾病診斷與療效判定標(biāo)準(zhǔn)》[16]評(píng)估治療效果。治愈：治療7 d內(nèi)，患兒的臨床癥狀及肺部體征消失，肺通氣功能基本正常，3個(gè)月內(nèi)未復(fù)發(fā)。好轉(zhuǎn)：治療7 d內(nèi)，患兒的癥狀減輕，肺部哮喘音明顯減少，肺功能好轉(zhuǎn)，經(jīng)過(guò)4周的治療后癥狀消失，3個(gè)月內(nèi)未見(jiàn)復(fù)發(fā)。無(wú)效：治療3個(gè)月后癥狀無(wú)明顯改善或癥狀加重。將治愈、好轉(zhuǎn)的患兒納入有效組，將治療無(wú)效的患兒納入無(wú)效組。

1.4 肺功能檢查方法 對(duì)于<3歲的患兒，在其安靜狀態(tài)下(必要時(shí)給予鎮(zhèn)靜)行潮氣呼吸肺功能檢測(cè)，通過(guò)潮氣呼吸流量-容積曲線來(lái)評(píng)估患兒的肺功能，記錄潮氣量、達(dá)峰時(shí)間比、達(dá)峰容積比、有效氣道阻力、呼吸頻率等參數(shù)；對(duì)于≥3歲的患兒，行常規(guī)肺通氣功能檢測(cè)，記錄用力肺活量、第1秒用力呼氣容積、第1秒用力呼氣容積占肺活量比值、呼氣峰流速、呼氣中段流速、最大通氣量等參數(shù)。參照相關(guān)文獻(xiàn)[17]提供的肺功能正常范圍，將治療3個(gè)月后上述所有肺功能指標(biāo)恢復(fù)至正常范圍的患兒納入肺功能正常組，其余患兒納入肺功能異常組。

1.5 標(biāo)本采集與基因多態(tài)性檢測(cè) (1)標(biāo)本的采集：用含有乙二胺四乙酸抗凝劑的真空采血管抽取患兒治療前空腹靜脈血2 mL，4 ℃保存待檢。(2)提取外周血基因組DNA：取靜脈血2 mL，按照1 ∶5的比例加入雙蒸水裂解8 min，放入離心機(jī)中，1 700 r/min離心5 min，去掉上清液。重復(fù)裂解1次，留取白細(xì)胞沉淀。加入0.5 mL的DNA細(xì)胞裂解液(含150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L乙二胺四乙酸、0.5%十二烷基磺酸鈉)來(lái)懸浮白細(xì)胞沉淀。于懸浮后的溶液中加入20 μL蛋白酶K，將其置于65 ℃水浴鍋中30 min，其間緩慢旋轉(zhuǎn)5次；從水浴鍋中取出懸浮后的溶液后，在室溫下加入0.5 mL的苯酚/氯仿/異戊醇混合抽提液(上海金畔生物科技有限公司，批號(hào)：311-90151)，劇烈震蕩混勻10 min，放入離心機(jī)中以8 000 r/min離心10 min，將得到的水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中。將1 mL的無(wú)水乙醇添加到水相中，混勻，放入離心機(jī)中以8 000 r/min離心3 min。用70%的乙醇將離心后得到的沉淀洗滌兩次，干燥，用50 μL去離子水懸浮，得到DNA樣品。(3)DNA濃度測(cè)定：使用Thermo Fisher Scientific公司Genesys 10 s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量260 nm和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)，計(jì)算A260 nm/A280 nm，若A260 nm/A280 nm>1.8，則認(rèn)為DNA樣品純度較高，可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。(4)引物設(shè)計(jì)與合成：本研究主要設(shè)計(jì)兩個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增分析，分別為ADRB2基因的Arg16Gly位點(diǎn)rs1042713和FCER1B基因的Glu237Gly位點(diǎn)rs569108。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索rs1042713和rs569108的序列，根據(jù)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。(5)PCR擴(kuò)增：用ADRB2 rs1042713和FCER1B rs569108的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按下列體系配制PCR反應(yīng)體系，包括0.6 μL的DNA模板、3 μL的10×Pfu緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司)、0.6 μL的dNTP 混合物[10 mmol/L，天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：CD117]、0.6 μL的正向引物(10 μmol/L)、0.6 μL的反向引物(10 μmol/L)、0.3 μL的Pfu DNA聚合酶[2.5 U/μL，天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：EP101]、24.3 μL的雙蒸水，總體積為30 μL。PCR反應(yīng)步驟為預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；總延伸72 ℃ 7 min。(6)基因型檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果分析ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)和FCER1B基因rs569108位點(diǎn)的基因型。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Haploview 4.1軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 88例CAV患兒的ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)和FCER1B基因rs569108位點(diǎn)的基因型及等位基因分布頻率 ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)有AA、AG和GG 3種基因型，以AG基因型最為常見(jiàn)，等位基因A的頻率為52.84%，等位基因G的頻率為47.16%。FCER1B基因rs569108位點(diǎn)有AA、AG和GG 3種基因型，以AA、AG基因型更為常見(jiàn)，等位基因A的頻率為69.89%，等位基因G 的頻率為30.11%。見(jiàn)表2。

表2 88例CAV患兒的ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)和FCER1B基因rs569108位點(diǎn)的基因型及等位基因分布情況[n(%)]

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)、FCER1B基因rs569108位點(diǎn)的基因型實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。見(jiàn)表3。

表3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

2.3 有效組與無(wú)效組患兒ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)、FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布情況的比較 藥物治療3個(gè)月后，治療有效的患兒共67例(76.14%)，治療無(wú)效的患兒共21例(23.86%)。兩組患兒的ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中攜帶GG基因型患兒治療無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA/AG基因型患兒的4.833倍(P<0.05)。兩組患兒的FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 有效組與無(wú)效組患兒ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)、FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布情況的比較[n(%)]

2.4 肺功能正常組與肺功能異常組患兒ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)、FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布情況的比較 藥物治療3個(gè)月后，肺功能正常的患兒共52例(59.09%)，肺功能異常的患兒共36例(40.91%)。兩組患兒的ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中攜帶GG基因型患兒治療后肺功能仍異常的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA/AG基因型患兒的7.636倍(P<0.05)。兩組患兒的FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 肺功能正常組與肺功能異常組患兒ADRB2基因rs1042713、FCER1B基因rs569108位點(diǎn)基因型分布情況的比較[n(%)]

3 討 論

哮喘在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率較高，在不同國(guó)家中患有哮喘的人口比例為1%～18%，其發(fā)病受到環(huán)境因素的影響，還具有明顯的遺傳傾向，是一種復(fù)雜的多基因遺傳病[18-19]。因此，哮喘的易感基因成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。CVA作為哮喘的特殊類(lèi)型，是兒童慢性咳嗽的首要病因[20]。若兒童時(shí)期哮喘久治不愈或治療效果不佳，患兒的生長(zhǎng)發(fā)育可受到嚴(yán)重影響，因此分析CVA患兒的易感基因，對(duì)于制訂治療方案具有重要意義。

既往研究表明，ADRB2基因多態(tài)性與哮喘具有顯著的相關(guān)性，其中ADRB2基因常見(jiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)為Arg16Gly、Gln27Glu和Thr164Ile，本研究分析的 ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)即為第一種。近年來(lái)，該基因位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘之間的相關(guān)性是研究熱點(diǎn)之一，但由于種族和年齡等的差異，研究結(jié)果存在一定差異。例如，Akparova等[21]在哈薩克人群中發(fā)現(xiàn)，ADRB2基因的Arg16Gly和Gln27Glu位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與哮喘具有顯著相關(guān)性。而一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，ADRB2基因Arg16Gly位點(diǎn)的多態(tài)性與中國(guó)漢族兒童哮喘的易感性無(wú)相關(guān)性，但Gln27Glu位點(diǎn)等位基因G突變可能是中國(guó)漢族兒童發(fā)生哮喘的保護(hù)因素[22]。Katsarou等[23]發(fā)現(xiàn)，歐洲東南部人群與西北部人群Arg16Gly位點(diǎn)的等位基因的分布截然不同。這些研究結(jié)果說(shuō)明ADRB2基因多態(tài)性在不同種族間存在一定差異，但ADRB2基因的基因型在中國(guó)壯族CVA患兒中的分布情況，以及ADRB2基因多態(tài)性與壯族CVA患兒治療效果及治療后肺功能改善情況的相關(guān)性卻無(wú)明確證據(jù)支持。

本研究共納入88例壯族CVA患兒，ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)有AA、AG和GG 3種基因型，不同治療效果患兒之間ADRB2基因的基因型分布存在差異(P<0.05)，且攜帶GG基因型患兒治療無(wú)效的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA/AG基因型患兒的4.833倍(P<0.05)；此外，在治療后不同肺功能檢測(cè)結(jié)果患兒之間該基因位點(diǎn)的分布也存在差異，其中攜帶GG基因型患兒治療后肺功能仍異常的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶AA/AG基因型患兒的7.636倍(P<0.05)。這表明ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)多態(tài)性可能與壯族CVA患兒的吸入性糖皮質(zhì)激素治療效果及治療后肺功能改善情況密切相關(guān)。因此，對(duì)于攜帶ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)GG基因型的壯族CVA患兒，可將治療方案調(diào)整為吸入性糖皮質(zhì)激素聯(lián)合β2受體激動(dòng)劑，以提高其治療效果。

FCER1B編碼 IgE 高親和力受體β鏈，在哮喘的發(fā)病中起重要作用[24]。FCER1B基因Glu237Gly(谷氨酸237>甘氨酸237)位于11q13區(qū)域，本研究分析的rs569108位點(diǎn)即Glu237Gly。既往研究表明，Glu237Gly位點(diǎn)多態(tài)性與氣道高反應(yīng)性顯著相關(guān)[25]。因此本研究探討了該基因位點(diǎn)多態(tài)性與壯族CVA患兒治療效果及治療后肺功能改善情況的關(guān)系，結(jié)果顯示，F(xiàn)CER1B基因rs569108位點(diǎn)有AA、AG和GG 3種基因型，其基因型在不同治療效果患兒之間的分布并無(wú)差異(P>0.05)，在不同肺功能檢測(cè)結(jié)果患兒之間的分布也無(wú)差異(P>0.05)。這提示FCER1B基因多態(tài)性可能與壯族CVA患兒的治療效果及治療后肺功能改善情況無(wú)顯著相關(guān)。

綜上所述，壯族CVA患兒的吸入性糖皮質(zhì)激素治療效果及治療后肺功能改善情況可能與ADRB2基因rs1042713位點(diǎn)多態(tài)性密切相關(guān)，而與FCER1B基因rs569108位點(diǎn)多態(tài)性可能無(wú)關(guān)。本研究所得結(jié)論或可為壯族CVA患兒實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥方案提供藥物基因組學(xué)的參考依據(jù)。