鮑顯偉，李小龍，石亞楠，梁曉珊，李 昊，王雪妍，許立華

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021）

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的一種有包膜、無節(jié)段的正鏈RNA 病毒[1]。該屬成員有BVDV-1、BVDV-2、豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和邊界病病毒（border disease virus，BDV）等[2]。BVDV是導(dǎo)致牛病毒性腹瀉（BVD）和黏膜疾病（MD）的病因，可引發(fā)病牛繁殖障礙和一系列其他臨床表現(xiàn)，如先天性畸形或免疫抑制等[3]。BVDV 能在妊娠早期穿過胎盤而導(dǎo)致胎兒持續(xù)感染（PI）。持續(xù)感染的動(dòng)物通常比短暫或急性感染的動(dòng)物更容易傳播BVDV，因其一生中能散播大量病毒，因而被認(rèn)為是BVDV 的主要宿主[4]。迄今，針對(duì)BVD 尚無有效的治療方法。

牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinortracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinortracheitis virus，IBRV）引起的一種急性、接觸性傳染病，也稱為牛皰疹病毒1 型（bovin eherpes virus 1，BHV-1）。IBRV 屬于皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科下的水痘病毒屬，是有囊膜的雙鏈線性DNA 病毒[5]。IBR 的主要特征為上呼吸道病癥，包括鼻炎、結(jié)膜炎、外陰陰道炎、氣管炎，還會(huì)引起腸炎、流產(chǎn)、腦炎和新生犢牛神經(jīng)系統(tǒng)感染等[6]。IBRV 感染機(jī)體后會(huì)引發(fā)免疫抑制，誘導(dǎo)引發(fā)牛呼吸道綜合征（BRDC）[7]。

BVD-MD 和IBR 呈全球性分布，已成為牛的主要傳染病。此外，IBRV 和BVDV 是呼吸道疾病復(fù)合體的主要病原體，也是導(dǎo)致牛死亡的主要原因[8]。在我國(guó)，IBRV 和BVDV 常以單重和混合感染形式存在，因其感染率高，常在血清、鼻拭子和生殖道拭子等樣品中被檢出。因此建立一種能夠同時(shí)快速檢測(cè)IBRV 和BVDV 的雙重PCR 方法，對(duì)牛群IBR 和BVD 的診斷、流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒陽(yáng)性核酸

IBRV、BVDV、牛呼吸道合胞體病毒（bovine respiratory syncytialvirus，BRSV）、牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）、牛細(xì)小病毒（bovine parvovirus，BPV）、牛紐布病毒（bovine nebovirus，BNeV）和牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）陽(yáng)性核酸樣品，均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.2 主要試劑

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒等，購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；DL 1 000 DNA Marker、pMD18-T 載體，購(gòu)自TaKaRa 公司；HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自Vazyme公司。

1.3 主要儀器

C 1 000 TouchTMThermal Cycler PCR 儀，購(gòu)自BIO-RAD 公司；紫外切膠儀，購(gòu)自上海領(lǐng)成生物科技有限公司；EPOCH2 microplate reader 酶標(biāo)儀、凝膠成像儀，購(gòu)自BioTek 公司。

1.4 樣品來源

79 份疑似感染IBRV 和BVDV 的牛血清樣品，從寧夏部分規(guī)?；?chǎng)采集。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

在GenBank 中選取已發(fā)表的BVDV（登錄號(hào)：AB078952.1）和IBRV（登錄號(hào)：MK654723.1）特異性或保守性序列，分別以BVDV 5'-UTR 和IBRVgB（UL27）基因序列作為靶基因，利用NCBI Primer-BLAST 線上軟件設(shè)計(jì)引物。使用MEGA-X軟件對(duì)各引物進(jìn)行互補(bǔ)性分析及對(duì)各擴(kuò)增序列進(jìn)行同源性分析，通過NCBI BLAST 特異性比對(duì)分析，將符合要求的引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及相關(guān)信息見表1。

表1 雙重PCR 引物信息

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 IBRV 和BVDV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備分別利用IBRV DNA 和BVDV 總RNA 樣品，采用One Step RT-PCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增相應(yīng)目的序列。PCR 反應(yīng)體系：2×One Step Mix 25.0 μL、One Step Enzyme Mix 2.5 μL、IBRV-F/BVDV-F 2.0 μL、IBRV-R/BVDV-R 2.0 μL、BVDV RNA 或IBRV DNA 樣品2.0 μL，最后以RNase free ddH2O 補(bǔ)至50.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：50 ℃30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收檢測(cè)正確的目標(biāo)條帶并純化；將產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞（DH5α），接種至氨芐青霉素抗性的LB 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；挑取單菌落于氨芐青霉素抗性的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫?fù)u床190 r/min 培養(yǎng)過夜；進(jìn)行菌液PCR，對(duì)陽(yáng)性菌液提取質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒用酶標(biāo)儀測(cè)定濃度，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算拷貝數(shù)，并將各陽(yáng)性質(zhì)粒分別稀釋至107copies/μL（作為陽(yáng)性對(duì)照模板）。

1.6.2 單重PCR 反應(yīng)條件建立與優(yōu)化 以各陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板，初步建立單重PCR 檢測(cè)方法，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照（DEPC 水）。PCR 反應(yīng)體系：2×One Step Mix 12.50 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、BVDV-F 或IBRV-F 0.50 μL、BVDV-R或IBRV-R 0.50 μL、IBRV 或BVDV 陽(yáng)性質(zhì)粒模板1.00 μL，最后以RNase free ddH2O 補(bǔ)足至25.00 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。對(duì)退火溫度（49.0、49.7、51.1、53.2、55.8、57.8、59.1、60.0 ℃）、引物終濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L）等條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最適退火溫度和引物終濃度。

1.6.3 雙重PCR 反應(yīng)條件建立與優(yōu)化 在優(yōu)化后的單重PCR 反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，初步建立雙重PCR 檢測(cè)方法。將2 種陽(yáng)性重組質(zhì)粒等體積混合后作為反應(yīng)模板。反應(yīng)體系：2×One Step Mix 12.50 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、兩 種質(zhì)粒混合液模板2.00 μL、IBRV-F 和BVDV-F 各1.00 μL、IBRV-R 和BVDV-R 各1.00 μL，最后以RNase free ddH2O 補(bǔ)足至25.00 μL。反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。同時(shí)對(duì)退火溫度、引物濃度、模板含量和循環(huán)次數(shù)等影響因素進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳條帶亮度及大小、引物Tm 值等因素，確定最終反應(yīng)條件和程序。

1.6.4 特異性試驗(yàn) 以等體積混勻的2 種重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，DEPC 水作為陰性對(duì)照，使用建立的雙重PCR 方法，對(duì)BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis核酸樣品檢測(cè)，確定方法的特異性。雙重PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。

1.6.5 敏感性試驗(yàn) 將2 種陽(yáng)性重組質(zhì)粒等體積混勻后進(jìn)行梯度稀釋（7 個(gè)梯度：107～101copies/μL），使用建立的雙重PCR 開展檢測(cè)，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。

1.6.6 重復(fù)性試驗(yàn) 以等體積混勻的2 種重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，DEPC 水作為陰性對(duì)照。使用建立的雙重PCR 對(duì)每種模板每隔1 周檢測(cè)1 次，共進(jìn)行3 次重復(fù)性試驗(yàn)。產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并記錄結(jié)果。

1.6.7 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)采集的79 份臨床血清樣品提取核酸，利用所建立的雙重PCR 方法開展檢測(cè)，并與單重PCR 檢測(cè)結(jié)果比對(duì)。對(duì)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的血清樣品，按照我國(guó)出入境檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《牛傳染性鼻氣管炎聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程》（SN/T 1918—2007）和《牛病毒性腹瀉/黏膜病檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 1129—2015）中的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 IBRV、BVDV 陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

IBRV、BVDV 克隆質(zhì)粒分別通過PCR 擴(kuò)增和電泳，獲得500 和198 bp 的目標(biāo)條帶（圖1）。對(duì)已構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果與目的基因序列比對(duì)一致，表明IBRV 和BVDV 基因片段重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pMD 18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV。通過測(cè)定，兩種質(zhì)粒濃度分別為531.25 和486.86 ng/μL，換算成標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為8.88×1011和2.45×1012copies/μL。

圖1 IBRV、BVDV 陽(yáng)性質(zhì)粒PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 單重PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

對(duì)建立的IBRV 和BVDV 單重PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定BVDV 單重PCR 反應(yīng)最佳退火溫度為53.2 ℃（圖2），最佳引物濃度為0.4 μmol/L（圖3）；IBRV 單重PCR 最佳退火溫度為53.2 ℃（圖4），最佳引物濃度為0.4 μmol/L（圖5）。

圖2 BVDV 單重PCR 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

圖3 BVDV 單重PCR 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

圖4 IBRV 單重PCR 退火溫度優(yōu)化結(jié)果

圖5 IBRV 單重PCR 引物濃度優(yōu)化結(jié)果

2.3 雙重PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

利用優(yōu)化后的單重PCR 體系建立雙重PCR，并對(duì)該反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。最終確定雙重PCR反應(yīng)體系：2×One Step Mix 12.50 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、IBRV-F 和BVDV-F 各1.00 μL、IBRV-R 和BVDV-R 各1.00 μL、pMD 18-T-IBRV和pMD18-T-BVDV 各1.00 μL，最后以RNase free ddH2O 補(bǔ)足至25.00 μL。雙重PCR 反應(yīng)程序：50 ℃30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53.2 ℃ 30 s，72 ℃25 s，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

2.4 特異性試驗(yàn)

利用建立的雙重PCR 對(duì)IBRV/BVDV、IBRV、BVDV、BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示，該方法對(duì)IBRV/BVDV、IBRV、BVDV 依次擴(kuò)增出500/198、500 和198 bp 的特異性目標(biāo)條帶，而對(duì)BRSV、BCoV、BPV、BNeV 和M.bovis則未擴(kuò)增出任何片段，表明該雙重PCR 方法特異性良好。

圖6 雙重PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 敏感性試驗(yàn)

利用DEPC 水將質(zhì)粒pMD18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV 連續(xù)10 倍梯度稀釋至101copies/μL，再用該方法對(duì)梯度稀釋的pMD18-T-IBRV 和pMD18-TBVDV 質(zhì)粒（107～101copies/μL）進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖7）顯示，對(duì)pMD18-T-IBRV 和pMD18-T-BVDV的最低檢測(cè)限分別為104和103copies/μL，表明建立的雙重PCR 方法敏感性較高。

圖7 雙重PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

如圖（圖8）顯示，3 次重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果一致，均能擴(kuò)增出相應(yīng)目標(biāo)片段，表明建立的雙重PCR方法具有較好的重復(fù)性。

圖8 雙重PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 臨床樣品檢測(cè)

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)雙重PCR 的檢測(cè)效果，對(duì)來自寧夏部分地區(qū)79 份疑似感染IBRV 和BVDV 的牛血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表2）顯示，IBRV和BVDV 陽(yáng)性檢出率分別為12.66%（10/79）、17.72%（14/79），兩種病原混合感染陽(yáng)性檢出率為8.86%（7/79）。該結(jié)果與IBRV 和BVDV 單重PCR 檢測(cè)結(jié)果符合率為90.00%和93.33%，兩種病原混合感染的陽(yáng)性符合率為100%。此外，我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對(duì)陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果與雙重PCR 一致，表明建立的雙重PCR 能較準(zhǔn)確地檢出IBRV 和BVDV，具有一定臨床應(yīng)用意義。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

IBR 和BVD 是牛的兩種主要傳染病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。IBRV 和BVDV 常以單重和混合感染的形式存在。BVDV 是RNA 病毒，提取核酸后需反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行檢測(cè)，因操作過程中會(huì)增加一定核酸污染風(fēng)險(xiǎn)，因此本研究選擇使用DNA/RNA 共提試劑盒提取樣品核酸，并利用One step RT-PCR 試劑盒使得反轉(zhuǎn)錄和PCR 反應(yīng)在一管內(nèi)完成。該試劑對(duì)DNA 病毒IBRV 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)無影響，操作過程中不需額外開管移液，大大提高了檢測(cè)通量，并降低了污染風(fēng)險(xiǎn)。

本研究利用IBRV 和BVDV 保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR 反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，分別建立了IBRV 和BVDV 單重PCR。在此基礎(chǔ)上，成功建立了IBRV 和BVDV 雙重PCR 檢測(cè)方法。該方法對(duì)IBRV、BVDV 和IBRV/BVDV 均能擴(kuò)增出特異性條帶，對(duì)BRSV、BCoV、BPV、BNeV和M.bovis病原核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明該方法特異性良好。IBRV 和BVDV 的靈敏檢測(cè)限分別達(dá)到了104和103copies/μL，具有較高的敏感性，同時(shí)具有良好的重復(fù)性。從寧夏部分地區(qū)牛養(yǎng)殖場(chǎng)共采集79 份臨床疑似IBR 和BVD 癥狀的奶牛血清樣本，采用建立的雙重PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，IBRV 和BVDV 陽(yáng)性率為12.66%和17.72%，兩種病原混合感染陽(yáng)性檢出率是8.86%。此外，利用我國(guó)對(duì)IBRV 和BVDV 出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對(duì)陽(yáng)性樣品檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與雙重PCR 一致。上述結(jié)果表明寧夏部分地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)存在IBRV 和BVDV 感染，其中BVDV感染率較高，IBRV 次之，同時(shí)也存在IBRV 和BVDV 混合感染，這應(yīng)引起養(yǎng)殖戶重視，加強(qiáng)對(duì)牛群疫病的防控和監(jiān)測(cè)。

綜上，本研究建立的雙重PCR 方法可用于臨床IBRV 和BVDV 快速檢測(cè)，為我國(guó)對(duì)牛群IBR和BVD 診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種快速簡(jiǎn)便的分子生物學(xué)方法，同時(shí)也為其防控提供了檢測(cè)技術(shù)支持。