李文馨，許 華，黎睿君，董 宣，黃 倢

（1.大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071）

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，在養(yǎng)殖產(chǎn)量提高的同時(shí)，病害頻發(fā)和抗生素濫用等相關(guān)問題也逐漸暴露出來，制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展。細(xì)菌性疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中流行較為廣泛且危害嚴(yán)重的疾病。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常見致病菌之一，廣泛分布于水生環(huán)境中，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了損失，也是引發(fā)食源性疾病的重要致病菌，給人類健康帶來威脅。副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽致病菌，廣泛存在于海水及魚、蝦、貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中，并引起水生動(dòng)物感染發(fā)病，如可引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）[1]、凡納對(duì)蝦“玻璃苗”[2-4]等。

目前，無論在水產(chǎn)養(yǎng)殖中還是臨床醫(yī)學(xué)上，抗生素已成為防治副溶血弧菌相關(guān)疾病的主要手段之一，而抗生素的誤用和濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的問題日趨嚴(yán)重[5]。張寶存等[6]從患病凡納對(duì)蝦中分離到一株高毒力且對(duì)多種抗生素都耐藥的副溶血弧菌，后被證明是AHPND 的致病菌[7]。Jiang等[8]從海產(chǎn)品中分離出90 株副溶血弧菌，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)分離株對(duì)氨芐青霉素（86/90）和頭孢唑啉（75/90）表現(xiàn)出耐藥性，其中40 株對(duì)至少3 種抗生素具有耐藥性。據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心[9]報(bào)道，2016—2020 年我國臨床分離出的副溶血弧菌對(duì)頭孢唑啉和氨芐青霉素的耐藥率較高，分別為94%和37%。為遏制抗生素濫用問題，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實(shí)施了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017—2020 年）》，通過“禁抗、減抗、限抗”的努力，動(dòng)物用藥中抗生素的科學(xué)使用已獲得了初步成效，提前2 年完成了動(dòng)物用抗菌藥使用“零增長”目標(biāo)[10]。2022 年初，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部又頒布了《2022 年動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測計(jì)劃》，以進(jìn)一步遏制抗生素濫用問題[11]。

近年來，噬菌體（bacteriophage）作為一種治療細(xì)菌性疾病的新型抗生素替代品被廣泛關(guān)注。本文就噬菌體在副溶血弧菌感染防治方面的應(yīng)用和噬菌體生物工程研究現(xiàn)狀，以及副溶血弧菌噬菌體現(xiàn)存問題及對(duì)策進(jìn)行概述，旨在表明噬菌體制劑在治療細(xì)菌性疾病方面具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)在當(dāng)前形勢下尋找有效、綠色、健康發(fā)展的水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病新型治療方式具有重要意義。

1 噬菌體優(yōu)勢及其在副溶血弧菌感染防治方面的研究

1.1 噬菌體優(yōu)勢

噬菌體是一種能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱，可以特異性侵染宿主菌，引起宿主菌死亡[12]。噬菌體治療相對(duì)于抗生素治療具有其潛在的優(yōu)勢：首先，噬菌體只針對(duì)相應(yīng)的病原菌，具有高度的宿主特異性，主要通過受體結(jié)合蛋白（RBPs）與細(xì)菌表面受體特異性結(jié)合來完成吸附這一過程，隨后通過抑制宿主細(xì)胞細(xì)胞壁的合成或通過溶解酶破壞宿主細(xì)胞壁來靶向殺滅特定的菌株，這種特異性大大降低了其對(duì)環(huán)境和動(dòng)物體中其他菌群的威脅，且治療效果不受細(xì)菌耐藥性影響[12-14]。從噬菌體特性來看，它可以隨宿主菌的增殖而指數(shù)增殖，并在細(xì)菌感染的整個(gè)過程發(fā)揮作用，這是一個(gè)重要優(yōu)勢[14-16]。其次，噬菌體具有宿主菌依賴性，只在細(xì)菌感染部位發(fā)生作用，裂解目標(biāo)菌后會(huì)被降解或快速代謝掉[17]。最后，噬菌體來源非常豐富，易從宿主細(xì)菌棲息環(huán)境中發(fā)現(xiàn)并分離，常見于污水、土壤、廢液等容易滋生細(xì)菌的環(huán)境中[18]。從應(yīng)用方面來看，噬菌體制劑既可以潑灑，也可制成飼料，易于給藥。

1.2 副溶血弧菌噬菌體應(yīng)用

目前已有大量副溶血弧菌噬菌體被分離并報(bào)道。Guo 等[19]分離出一株新的ssDNA 噬菌體vB_VpaM_PG19，為致病性副溶血弧菌的潛在生物防治劑提供候選物。Tian 等[20]分離出一株副溶血弧菌特異性噬菌體vB_VpS_PG28，通過基因組注釋分析未發(fā)現(xiàn)任何與抗性或毒力因子相關(guān)的基因。Matamp 等[21]分離出一株副溶血弧菌噬菌體φVP-1，其可感染多重耐藥副溶血弧菌和溶藻弧菌菌株，而且具有進(jìn)行基因組工程改造的可能性。

1.2.1 利用噬菌體檢測 噬菌體對(duì)宿主的敏感性和特異性在檢測方面具有重要的應(yīng)用前景。使用噬菌體檢測副溶血弧菌需提前篩選出裂解譜不同、裂解力強(qiáng)且穩(wěn)定的噬菌體株，并基于還原型輔酶I（NADH）作為指示劑，結(jié)合噬菌體的特異性和NADH的普遍性來實(shí)現(xiàn)對(duì)副溶血弧菌的定量檢測。該方法靈敏度高且用時(shí)短，操作簡便適用于現(xiàn)代快速檢測。但由于噬菌體的特異性識(shí)別不能感染所有的副溶血弧菌，因此應(yīng)用受到極大限制，但可以通過噬菌體雞尾酒療法進(jìn)行優(yōu)化，從而有效克服這一缺點(diǎn)[22-23]。

1.2.2 利用噬菌體防治副溶血弧菌感染

1.2.2.1 軟體動(dòng)物防治 副溶血弧菌在我國沿海水域、海產(chǎn)品中的檢出率較高，可引起多種養(yǎng)殖貝類大量死亡，是養(yǎng)殖貝類的主要病原菌之一，某些致病性副溶血弧菌也能污染貝類產(chǎn)品從而對(duì)人類健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)[24-25]。而使用噬菌體來處理副溶血弧菌污染過的軟體動(dòng)物，可有效控制養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)及養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌數(shù)量[26]。Jun 等[27-28]發(fā)現(xiàn)一株寬裂解譜噬菌體pVp-1 對(duì)27 株具有多重耐藥性的副溶血弧菌中的20 株具有良好的溶菌作用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了生物防治試驗(yàn)，結(jié)果采用藥浴或表面給藥均可使牡蠣感染得到有效控制。有研究人員考察了噬菌體制劑不同時(shí)間內(nèi)對(duì)牡蠣的保護(hù)作用，分別于感染后48 h 和72 h 處理人工污染的牡蠣，結(jié)果顯示牡蠣表面的副溶血弧菌滅活率分別為90%和99%[29]。

1.2.2.2 甲殼類動(dòng)物防治 副溶血弧菌可引起對(duì)蝦多種疾病。目前已成功分離出諸多不同的副溶血弧菌噬菌體，并將其應(yīng)用于生物防治。Dubey 等[30]分離出一株絲狀副溶血弧菌特異性噬菌體V5，并測試噬菌體V5 控制對(duì)蝦副溶血弧菌感染的效力，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用噬菌體1 h 內(nèi)細(xì)菌數(shù)量減少了78.1%。Lomelí-Ortega 等[31]測試由vB_Vc_SrVc2 和vB_Vc_SrVc9 組成的噬菌體混合物對(duì)凡納對(duì)蝦仔蝦的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩種噬菌體在體內(nèi)和體外條件下均具有抑制致病性弧菌生長的能力，噬菌體雞尾酒療法能夠選擇性有效減少弧菌數(shù)量（溶藻弧菌和副溶血弧菌）；同時(shí)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)噬菌體處理的對(duì)蝦，其肝胰腺損傷減弱。Jun 等[32]使用噬菌體pVp-1 對(duì)22 個(gè)從不同區(qū)域分離出的致AHPND 副溶血弧菌菌株（VpAHPND，5 株亞洲型和17 株墨西哥型）進(jìn)行了感染試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該噬菌體能夠感染其中20 株菌株，并對(duì)3 株已知的高致病性菌株（13-028/A3 來自越南，13-511/A1 和13-306D/4 來自墨西哥）表現(xiàn)出顯著的溶菌活性，表明噬菌體pVp-1在防控AHPND方面具有巨大潛力。2018 年為了評(píng)估噬菌體對(duì)AHPND 的有效性，Jun等[33]利用凡納對(duì)蝦進(jìn)行了一系列生物測定，并對(duì)其死亡率及組織學(xué)變化進(jìn)行了監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)使用口服方式多次投喂pVp-1 噬菌體進(jìn)行預(yù)防和治療可以使對(duì)蝦在致命菌株攻擊中存活，且組織損傷明顯減弱。2022 年，González-Gómez 等[34]從墨西哥錫那羅亞州的河口水中分離出兩株噬菌體（vB_VpaP_AL-1和vB_VpaS_AL-2），發(fā)現(xiàn)其可以感染墨西哥分離的VpAHPND，通過基因組測序沒有發(fā)現(xiàn)與毒力、溶原性或抗生素抗性相關(guān)基因。因此，噬菌體作為特異性病原體的防治手段，在防治甲殼類動(dòng)物副溶血弧菌感染方面具有巨大潛力。Li 等[35]還分離到對(duì)坎貝氏弧菌（V.campbellii）具有強(qiáng)烈裂解能力的弧菌噬菌體vB_VcaS_HC。由于坎貝氏弧菌可與副溶血弧菌發(fā)生質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而獲得致AHPND 的毒力，因此使用坎貝氏弧菌噬菌體來殺滅坎貝氏弧菌，可以降解由于致病性副溶血弧菌與其他弧菌發(fā)生結(jié)合轉(zhuǎn)移對(duì)甲殼動(dòng)物造成的傷害[36-37]。

1.2.2.3 魚類防治 副溶血弧菌同樣可引起魚類發(fā)病，在對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失的同時(shí)，也同樣導(dǎo)致食品安全風(fēng)險(xiǎn)。Lal 等[38]分離出一株可以抑制副溶血弧菌的噬菌體VpKK5，可以裂解對(duì)魚類致病的副溶血弧菌菌株。研究發(fā)現(xiàn)：噬菌體即使在生魚片等復(fù)雜的食物基質(zhì)中也能感染和破壞病原體，顯著降低生魚片中的副溶血弧菌含量；噬菌體濃度越高，殺菌效果越明顯，結(jié)合低溫處理，對(duì)樣品中副溶血弧菌的控制效果更好。因此，噬菌體具有防治副溶血弧菌感染和作為生物殺菌劑的應(yīng)用潛力[39-40]。

1.3 噬菌體生物工程改造

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，通過對(duì)現(xiàn)有噬菌體進(jìn)行人工修飾，擴(kuò)大噬菌體宿主范圍，彌補(bǔ)噬菌體治療中的一些缺陷，從而解決當(dāng)前噬菌體在防治副溶血弧菌感染中的一些問題。

1.3.1 改變噬菌體宿主范圍 Hoshiga 等[41]使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)T2 噬菌體基因組進(jìn)行編輯，將T2 噬菌體的長尾纖維和短尾纖維的末端替換為PP01 噬菌體的對(duì)應(yīng)基因，發(fā)現(xiàn)成功改造后的噬菌體對(duì)大腸桿菌O157:H7 顯示出與PP01 相當(dāng)?shù)奈侥芰?，人工擴(kuò)大了大腸桿菌O157:H7 特異性噬菌體范圍。李艷秀等[42]將兩株T4 噬菌體的宿主決定區(qū)基因片段進(jìn)行了同源重組，使獲得的嵌合噬菌體具備相對(duì)較寬的宿主譜，且可以穩(wěn)定遺傳，從而為快速構(gòu)建針對(duì)特定病原菌的噬菌體奠定了基礎(chǔ)。

1.3.2 改變噬菌體對(duì)特定宿主菌的裂解能力 內(nèi)溶素（endolysin）是來自噬菌體的肽聚糖水解酶。利用基因工程克隆和重組內(nèi)溶素可有助于解決使用噬菌體控制副溶血弧菌的不足。Xia 等[43]分離了一株副溶血弧菌特異性噬菌體F23s1，隨后將其內(nèi)溶素基因克隆并在大腸桿菌中成功表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)溶素LysF23s1 對(duì)耐藥的副溶血弧菌（23/23）和沙門氏菌（12/13）具有裂解活性，并顯示出比完整噬菌體（13/37）更寬的裂解譜。Ning 等[44]基于來自副溶血弧菌噬菌體的內(nèi)溶素Lysqdvp001 設(shè)計(jì)了3 種陽離子肽修飾內(nèi)溶素（Lysqdvp001-5aa、Lysqdvp001-10aa 和Lysqdvp001-15aa），發(fā)現(xiàn)這些重組內(nèi)溶素顯示出與Lysqdvp001 相當(dāng)?shù)碾木厶撬饣钚?，能夠從外部裂解?xì)菌；在使用最低殺菌濃度時(shí)，Lysqdvp001-15aa 根除了約50%的副溶血弧菌生物膜，并抑制了90%以上的細(xì)菌生物膜形成。

2 副溶血弧菌噬菌體現(xiàn)存問題及對(duì)策

噬菌體特異性普遍較強(qiáng)，宿主范圍一般較窄。而海洋動(dòng)物的生存環(huán)境復(fù)雜，細(xì)菌病的暴發(fā)往往不是單種細(xì)菌引起的，因此單一的噬菌體很難起到很好的防治效果。利用噬菌體來控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌雖然是有利的，但有報(bào)道[45]認(rèn)為，在單一噬菌體治療弧菌病的情況下，弧菌能產(chǎn)生一定的抗性進(jìn)而降低防治效果，而使用噬菌體混合物（V1G、V1P1 和V1P2）明顯延緩了細(xì)菌抗性的演化，使噬菌體可以持續(xù)侵染細(xì)菌，這說明在防治疾病過程中，多個(gè)噬菌體的聯(lián)合使用是控制弧菌病的重要策略。Mateus 等[46]評(píng)估了多株副溶血弧菌噬菌體混合物（VP-1、VP-2 和VP-3）在水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制弧菌的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用VP-1、VP-2噬菌體相比，混合使用2 株或3 株噬菌體防治效果和效率均有不同程度的提高，且延遲了細(xì)菌抗性發(fā)展。因此可以考慮循環(huán)使用不同的裂解性噬菌體來避免細(xì)菌抗性的產(chǎn)生，并且使用噬菌體雞尾酒療法，將不同裂解譜的噬菌體結(jié)合起來，對(duì)受感染的動(dòng)物進(jìn)行治療，從而獲得更為全面的治療效果[47]。噬菌體雞尾酒療法還可與其他療法聯(lián)合使用，例如“噬菌體-抗生素聯(lián)合療法”和“噬菌體-益生菌聯(lián)合療法”。2021 年Engeman 等[48]使用5 株銅綠假單胞菌噬菌體與4 種抗生素聯(lián)合治療，發(fā)現(xiàn)在噬菌體存在的情況下，對(duì)這些抗生素敏感的銅綠假單胞菌菌株數(shù)分別有不同程度的增加。2014 年，Surekhamol 等[49]評(píng)估了噬菌體對(duì)蝦生產(chǎn)系統(tǒng)中有益微生物群的侵染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中使用的硝化細(xì)菌和蠟狀芽孢桿菌、節(jié)桿菌等益生菌對(duì)添加的病原菌噬菌體均不敏感，表明在對(duì)蝦生產(chǎn)系統(tǒng)中噬菌體與益生菌療法相結(jié)合有一定的可行性。

值得注意的是，噬菌體的安全風(fēng)險(xiǎn)仍需進(jìn)一步評(píng)估。目前已發(fā)現(xiàn)某些噬菌體在致病菌毒力或抗生素抗性演化中發(fā)揮重要作用[50]，如霍亂弧菌、鏈球菌等都存在噬菌體介導(dǎo)的毒力基因轉(zhuǎn)移[51-52]。副溶血弧菌O3:K6 血清型含有質(zhì)粒pO3K6，其被證明是來自絲狀噬菌體f237基因組，其編碼的ORF8 可能與副溶血弧菌所致的食源性腹瀉大流行相關(guān)[53]。由于副溶血弧菌在海水養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在，早期對(duì)副溶血弧菌致AHPND 的機(jī)制研究上，曾懷疑副溶血弧菌獲得的致病性是由溶源性噬菌體帶來的[54]。但經(jīng)過對(duì)多株VpAHPND的溶源性噬菌體分析，未觀察到溶源性噬菌體與副溶血弧菌的致病性存在某種關(guān)聯(lián)，否定了這一猜測[55]。最近的研究[7，37，56-58]證明，VpAHPND的毒力質(zhì)粒是通過接合轉(zhuǎn)移或者自然轉(zhuǎn)化在弧菌間傳遞。這些研究可消除人們對(duì)應(yīng)用噬菌體可能會(huì)增強(qiáng)AHPND 相關(guān)副溶血弧菌致病性的擔(dān)憂。

3 展望

世界衛(wèi)生組織（WHO）在2015年通過了《Global Action Plan on Antimicrobial Resistance》（https://www.who.int/publications/i/item/9789241509763），世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）全球大會(huì)也在同年5 月通過了《Resolution No.26: Combating Antimicrobial Resistance and Promoting the Prudent Use of Antimicrobial Agents in Animals》，并在《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》對(duì)水生動(dòng)物中抗生素使用問題做了嚴(yán)格規(guī)定，以限制抗生素濫用?！吨腥A人民共和國生物安全法》也將微生物耐藥作為一個(gè)重要的生物安全問題考慮。噬菌體是破解抗生素濫用所導(dǎo)致的微生物耐藥難題的新型生物制劑，其宿主特異性和對(duì)特定病原菌的高效裂解能力賦予了這一技術(shù)領(lǐng)域廣闊的應(yīng)用前景。但是，在噬菌體走向?qū)嶋H應(yīng)用市場的過程中，除了在科學(xué)技術(shù)方面需要取得突破以外，還需要滿足批量化生產(chǎn)的條件和獸藥生物制劑相關(guān)法律的規(guī)定。按照《獸藥管理?xiàng)l例》等法規(guī)的相關(guān)規(guī)定，須進(jìn)行臨床前研究審核和臨床試驗(yàn)。近年來，我國在動(dòng)物藥劑行業(yè)已有企業(yè)投入了噬菌體產(chǎn)品的商業(yè)開發(fā)[59]。目前，噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究還處在初級(jí)階段，深入研究噬菌體的結(jié)構(gòu)與功能，揭示噬菌體與宿主之間相互作用關(guān)系，是推動(dòng)噬菌體應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的重要基礎(chǔ)。優(yōu)化噬菌體的雞尾酒療法、噬菌體基因編輯等，將成為噬菌體治療研究領(lǐng)域的重要方向。相信隨著國內(nèi)外噬菌體領(lǐng)域研究的不斷深入，噬菌體將逐步成為水產(chǎn)養(yǎng)殖綠色發(fā)展和生物安保的重要工具。