段宏安，徐 曄，王鳳芝，周 毅，丁 超

（連云港海關(guān)，國家水生動物檢測重點實驗室，江蘇連云港 222042）

近年來，環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）技術(shù)在水生生態(tài)、生物多樣性和環(huán)境生物監(jiān)測中的應(yīng)用日益廣泛[1-7]。該技術(shù)可以在各種環(huán)境中檢測出目標(biāo)生物的遺傳痕跡[8-11]。結(jié)合不同的采樣和DNA 提取方法[12]，eDNA 技術(shù)可用于檢測和監(jiān)測入侵物種[13]。eDNA 方法在檢測和研究寄生蟲[14]和水生動物病原體[15]方面的應(yīng)用已有一些報道。eDNA 可以替代組織樣本用于檢測，從而可能在對高價值或稀有動物的監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。此外，eDNA 技術(shù)在野生種群疫病入侵或無癥狀感染動物的早期檢測中具有一定作用。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）水生動物委員會（Aquatic Animal Commission，AAC）逐漸意識到，eDNA 方法被應(yīng)用于檢測WOAH 名錄中某些疫病的病原體時，由于在設(shè)計使用eDNA 技術(shù)的監(jiān)測方案時無法獲得診斷性能的準(zhǔn)確評估，所以利用eDNA 方法獲得的數(shù)據(jù)不太可能適用于支持對WOAH 名錄中疫病的無疫聲明。使用eDNA 方法也不能確認(rèn)是否感染了WOAH 名錄中疫病病原，因為陽性結(jié)果并不能證明易感動物受到了感染。然而，陽性的eDNA結(jié)果可以提供可能被感染的證據(jù)。AAC 于2021 年2 月組織會議制定了討論性文件[16]供各成員評議。該文件總結(jié)了eDNA 技術(shù)在水生動物疫病診斷或監(jiān)測方面的優(yōu)勢和局限性，擬就適當(dāng)?shù)膽?yīng)用提供指導(dǎo)?？紤]到AAC 可能將eDNA 方法納入WOAH水生動物疫病診斷手冊相關(guān)疫病章節(jié)中的診斷方法，作為國際貿(mào)易中指定的診斷標(biāo)準(zhǔn)推薦給各成員使用，而我國目前在eDNA 方法應(yīng)用于水生動物疫病監(jiān)測方面的研究起步較晚。為此，本文結(jié)合AAC 討論性文件，對eDNA 技術(shù)在水生動物疫病監(jiān)測中的研究現(xiàn)狀、優(yōu)缺點、適用性和應(yīng)用前景進(jìn)行概述，以期為后續(xù)開展相關(guān)監(jiān)測和研究工作提供參考。

1 eDNA 定義

eDNA 概念問世于1987 年，它涉及一種從沉積物中提取微生物DNA 的方法[10]。然而這個術(shù)語真正出現(xiàn)是在2000 年初，由微生物學(xué)家提出，是指無需首先分離任何目標(biāo)生物體，而從環(huán)境樣本（如土壤、水、空氣等）中提取的DNA。它是由許多不同生物體的基因組DNA 和其可能降解成的小片段組成的復(fù)雜混合物。總的eDNA 包含源自活細(xì)胞或生物體的細(xì)胞內(nèi)DNA，以及細(xì)胞自然死亡后結(jié)構(gòu)破壞所產(chǎn)生的細(xì)胞外DNA。AAC 在其文件中將eDNA 定義為“從‘真正的’環(huán)境樣本（如水、土壤、沉積物、生物膜）中提取的核酸”。而直接來自宿主的材料，如糞便、脫落的細(xì)胞和黏液，不包括在此定義中。從環(huán)境樣本中提取的eDNA 可以用各種分子方法進(jìn)行檢測[17]。此外，eDNA 可以作為模板直接進(jìn)行測序或在PCR 擴(kuò)增目標(biāo)基因后進(jìn)行測序[14]。

2 應(yīng)用研究現(xiàn)狀

水生動物疫病呈現(xiàn)多發(fā)新發(fā)態(tài)勢[18]。有些疫病在無癥狀時難以檢出病原，某些物種因貨值高或本身數(shù)量少，取樣數(shù)量達(dá)不到健康監(jiān)測要求也難以檢出病原。目前WOAH 動物疫病名錄中水生動物疫病有29 種，我國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄中的水生動物疫病有43 種，并且這2 個名錄還在不斷調(diào)整更新。新發(fā)疫病，如鮭甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）、鯉浮腫病毒（carp edema virus，CEV），羅非魚湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）、十足目虹彩病毒1 型（decapod iridescent virus 1，DIV1）等病毒感染危害嚴(yán)重。病毒性疫病是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。病毒通過水傳播是水產(chǎn)養(yǎng)殖場之間病毒傳播的重要途徑之一。Oidtmann 等[19]對9 種重要病毒在水生環(huán)境中的存活能力進(jìn)行了研究，這些病原體包括6 種魚病毒和3 種蝦病毒。研究發(fā)現(xiàn)水生動物病毒（aquatic animal viruses，AAVs）有一些共同的趨勢：（1）存活率隨著溫度的升高而下降（當(dāng)在溫度0 ℃以上時）；（2）水中的生物負(fù)荷越高，可檢測到的病毒越少；（3）水中的病毒載量是一個時間函數(shù)。大多數(shù)AAVs 可以在水生環(huán)境中保持活力數(shù)天或數(shù)周，這取決于生理化學(xué)因素和水中微生物群?？傊?，AAVs 可以在水體環(huán)境中存活的特性，為利用eDNA技術(shù)檢測和監(jiān)測這些病原體提供了前提條件。

除了直接采集水生動物樣本進(jìn)行疫病監(jiān)測和研究外，國外在應(yīng)用eDNA 方法進(jìn)行水生動物疫病監(jiān)測方面進(jìn)行了嘗試。已有一些國外文獻(xiàn)報道應(yīng)用eDNA 技術(shù)檢測WOAH 疫病名錄中兩棲動物、甲殼動物、魚類和軟體動物病原體。AAC 文件[16]中列出了33 篇關(guān)于使用eDNA 技術(shù)檢測13種WOAH 水生動物疫病名錄中病原體的文獻(xiàn)，大多涉及野生水生動物種群中所列病原體的檢測，特別是變形絲囊霉菌（Aphanomyces astaci）、箭毒蛙壺菌（Batrachochytrium dendrobatidis）、蠑螈壺菌（B.salamandrivorans）、蛙病毒（Ranavirus）以及鮭三代蟲（G.salaris）；另外還有13 篇針對其他特定病原體（如馬可尼閉合孢子蟲（Microcytos mackini）、病原體群，或?qū)DNA 方法應(yīng)用于更廣泛的研究領(lǐng)域（如病毒的水傳播）。

2.1 eDNA 樣本的收集和處理

土壤、沉積物、生物膜和少量水中eDNA 樣本的收集和處理相當(dāng)簡單，可直接送到有資質(zhì)的生物公司或?qū)嶒炇疫M(jìn)行核酸提取、PCR 檢測及測序。對大體積的海淡水樣品，要使用eDNA 方法進(jìn)行疫病檢測，首先要考慮對水樣中eDNA 的富集。除兩棲類外，魚蝦貝類生存環(huán)境為水，國際國內(nèi)貿(mào)易大多還是以水為介質(zhì)運(yùn)輸?shù)?。水樣的采集和其中DNA 富集是eDNA 檢測和研究要考慮的重點。目前有多種技術(shù)對靜水和流水進(jìn)行水樣采集，eDNA樣品的處理可以基于兩種不同的方案，即沉淀和過濾[20]。沉淀法適用少量水樣，通常不超過15 mL[8，21]。在小型和/或湖泊水體中，目標(biāo)生物種群密度高，沉淀法可以獲得較高的檢測成功率。過濾程序大多應(yīng)用于大型和/或大量水體[22-23]。

在eDNA 研究領(lǐng)域，有不同類型的過濾器可供選擇，包括玻璃纖維過濾器[23-25]、尼龍過濾器[26]、硝酸纖維素過濾器[22]、聚碳酸酯過濾器[27]或SterivexTM-GP 過濾器[25，28]。濾器類型的選擇主要取決于所關(guān)注的eDNA 顆粒大小，過濾能力通常在15 mL 到10 L 之間，還要取決于過濾介質(zhì)的特性，如孔徑大小和親水性，因每種類型的過濾器在樣品處理過程中的處理方式是不同的。此外，水濁度是一個主要問題，會導(dǎo)致過濾介質(zhì)的快速堵塞，孔徑越小，這個問題就越嚴(yán)重。處理大體積的水樣有利于檢測稀有和新近入侵的物種，這些物種在自然界中的密度很低。為了濃縮大體積水樣中的微生物，有不同的過濾方法可供選擇，包括深度過濾（depth filtration，DF）和死端超濾（dead-end ultrafiltration，DEUF）[24]。

DF 方法是基于水在多孔和高壓兼容的多層深度過濾器上的過濾，在過濾介質(zhì)的表面和內(nèi)部保留許多不同大小的顆粒。對于eDNA 研究，使用玻璃纖維過濾器可以滿足最佳條件，孔徑為0.7～2.7 μm，以便從水樣中回收各種大小的顆粒。DEUF 方法使用超濾器，通常用于處理高達(dá)100 L的大水體，以濃縮和回收細(xì)菌和其他微生物[29-31]。Wittwer 等[32]應(yīng)用DF 和DEUF，在德國的3 個河流系統(tǒng)中用qPCR 檢測水體中的變形絲囊霉菌（A.astaci）孢子。兩種eDNA 過濾方法都能成功地從3 個水系中回收和檢測A.astaci 孢子，水濁度影響了兩種eDNA 方法對A.astaci孢子的檢測，其中DEUF 方法的顆粒重量增加，而DF 樣品的水容量減少。盡管用DEUF 方法過濾高容量水樣對A.astaci的檢測率略高，而且似乎對A.astaci的檢測更敏感；但其應(yīng)用非常費(fèi)力且成本較高。而DF方法快速、成本低、易操作，可獲得非常可靠的定量結(jié)果，建議使用DF 方法來進(jìn)行大規(guī)模篩查流水中的A.astaci。

帶正/負(fù)電荷的濾膜也可用于海水樣品中SAV[33-35]、傳染性鮭貧血病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）[36-37]eDNA 的濃縮。為了濃縮水樣中的SAV，分別對3 個水箱中的1 L 水樣通過正電或負(fù)電的膜過濾器過濾，過濾器插入1 個47 mm 的在線過濾器支架（merck millipore）。該支架安裝在便攜式環(huán)境采樣泵上，然后用不同的緩沖溶液洗脫過濾器中的吸附物質(zhì)，用試劑盒提取DNA，用PCR 或定量PCR 進(jìn)行檢測。另有報道[38]將采集的500 mL 水樣通過裝有ym30 再生纖維素膜的Amicon 超濾裝置（Millipore Ltd）濃縮到大約2 mL，將2 mL 分成3 個等份，用于病毒分離、常規(guī)RT-PCR 和qPCR 的測試。同理，用帶陽離子（Al3+）的過濾器及超濾方法[39-40]過濾濃縮500 mL 的水樣中的DNA，用于檢測錦鯉皰疹病毒（koi herpesvirus，KHV）。

上述方法過濾后，取出濾膜，用洗脫或試劑盒方法提取RNA 或DNA，用普通PCR 或定量PCR 檢測病原。

2.2 eDNA 方法的驗證、確認(rèn)與診斷準(zhǔn)確性

eDNA 方法已被廣泛用于檢測稀有物種的存在和相對豐度，特別是入侵或瀕危水生物種，eDNA技術(shù)的快速發(fā)展已經(jīng)涉及生物安全、環(huán)境保護(hù)等政策及管理措施的制定和實施，根據(jù)eDNA 監(jiān)測結(jié)果做出動物疫病管理決策的可能性越來越大。因此，eDNA 監(jiān)測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)必須是準(zhǔn)確可靠、可驗證并以高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。Klymus 等[41]利用多個合作實驗室的數(shù)據(jù)集離散閾值法和曲線擬合建模法來確定eDNA qPCR 的檢測限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），目的是對確定、解釋和報告eDNA 檢測方法LOD 和LOQ進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，進(jìn)行更有意義的實驗室間驗證，對不同eDNA qPCR 檢測方法的質(zhì)量和性能進(jìn)行更合適的評估。還有一些報道涉及eDNA 方法的設(shè)計和報告注意事項[42-43]，其中許多研究闡明了檢測大型生物體而非病原體的注意事項。

已有研究利用水生動物源性樣品判定疫病檢測方法的診斷準(zhǔn)確性，相關(guān)文獻(xiàn)提出了設(shè)計和報告標(biāo)準(zhǔn)。Laurin 等[44]針對2017 年WOAH《水生動物疫病診斷手冊》（簡稱WOAH 手冊）中列出的26 種水生動物疫病，對已發(fā)表的診斷試驗準(zhǔn)確性研究中的設(shè)計信息進(jìn)行了評估，列出了在設(shè)計階段需要考慮的重要指標(biāo)，包括研究目的、目標(biāo)疫病狀態(tài)、適當(dāng)樣本的選擇和標(biāo)本、實驗室分析方法、統(tǒng)計方法和數(shù)據(jù)解釋，給出了設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)建議，包括風(fēng)險點和在每個關(guān)鍵步驟中減少偏差的措施。許多設(shè)計和報告的考慮因素也適用于eDNA 方法，建議將這些標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于eDNA 診斷準(zhǔn)確性研究。

檢驗方法確認(rèn)是確定方法適用性的過程。WOAH 手冊第1.1.2 章介紹了傳染病診斷試驗的確認(rèn)原則、方法和途徑。確認(rèn)的途徑包括4 個階段：第1 階段是診斷試驗的分析特征，包括備選方法與標(biāo)準(zhǔn)測試方法的比較，診斷試驗的分析特異性和敏感性，重復(fù)性和初步重現(xiàn)性；第2 階段是試驗的診斷特征，選用參照動物或?qū)嶒瀯游飿颖緦υ\斷特異性、敏感性和閾值進(jìn)行確定，實現(xiàn)臨時認(rèn)可；第3階段是重現(xiàn)性，選擇合作實驗室，確定評估體系，對方法的重現(xiàn)，至此可命名為經(jīng)確認(rèn)為符合原始預(yù)期用途的試驗方法；第4 階段是實施，經(jīng)WOAH國際認(rèn)可，用選定的參考標(biāo)準(zhǔn)，解釋試驗結(jié)果，應(yīng)用到其他實驗室。為降低誤差得到更高的置信度，必須擴(kuò)大取樣數(shù)量。對動物群體來說，這點容易實現(xiàn)。如果將eDNA 方法作為水生動物疫病的診斷方法，對其診斷性能的評估比較困難，對取樣方案的設(shè)計包括取樣地點、數(shù)量、取樣的代表性等，都是必須認(rèn)真考慮的因素。

3 在水生動物疫病監(jiān)測方面的適用性

3.1 對判定臨床健康和臨床感染動物可疑病例及確診病例的適用性

WOAH《水生動物疫病診斷手冊》各特定疫病章節(jié)給出了診斷方法，對臨床健康（或健康狀況不明）和臨床感染動物可疑病例和確診病例進(jìn)行定義。如果與受感染的種群有流行病學(xué)聯(lián)系，例如在地理上接近已知感染種群，或從已知感染種群中移出水生動物水生動物產(chǎn)品或設(shè)備等，臨床健康的種群可能屬于懷疑對象，因此要進(jìn)行采樣。另外，需對臨床健康種群進(jìn)行采樣監(jiān)測，以證明無疫。eDNA 檢測方法的結(jié)果是否適合作為《水生動物疫病診斷手冊》特定疫病章節(jié)中病例定義的判定標(biāo)準(zhǔn)，分情況簡述如下，并待進(jìn)一步研究。

3.1.1 判定臨床健康動物群體中可疑病例和確診病例 從《水生動物疫病診斷手冊》推薦的eDNA方法中獲得的陽性結(jié)果可作為疑似病例的一項判定標(biāo)準(zhǔn)，但不適合作為確認(rèn)臨床健康動物病例的證據(jù)。利用動物來源樣本的方法更適合作為確認(rèn)臨床健康動物病例的標(biāo)準(zhǔn)。確認(rèn)臨床健康動物病例的證據(jù)必須符合《水生動物疫病診斷手冊》相關(guān)疫病章節(jié)臨床健康動物中確診病例的要求，eDNA 方法不適合作為判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.1.2 判定臨床患病動物疑似病例和確診病例一般不建議在臨床患病動物群體中抽取環(huán)境樣品調(diào)查病因，因為臨床患病動物的樣品更有可能檢出病原體，更適合于疫病調(diào)查。然而，在某些情況下，eDNA 方法可能會檢測出病原體，并可能發(fā)現(xiàn)以前沒有觀察到的疫病臨床癥狀。在這些情況下，從《水生動物疫病診斷手冊》中推薦的eDNA 方法獲得的陽性結(jié)果被認(rèn)為提供了充分的證據(jù)，可作為疑似病例的判定標(biāo)準(zhǔn)。任何陽性的eDNA 測試都需要進(jìn)一步調(diào)查，包括采集和測試動物組織，按照《水生動物疫病診斷手冊》中有關(guān)疫病的具體章節(jié)操作，證實臨床患病動物病例的證據(jù)必須符合《水生動物疫病診斷手冊》相關(guān)疫病章節(jié)臨床患病確診病例的要求，eDNA證據(jù)不能作為確診病例的一項判定標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 在水生動物疫病監(jiān)測中的優(yōu)勢

AAC 文件[16]認(rèn)為，eDNA 檢測是一種很有前途的工具，可以作為對水生動物進(jìn)行直接采樣監(jiān)測的補(bǔ)充。與直接采樣檢測相比，eDNA 方法有一些優(yōu)越性：不需要對水生動物進(jìn)行破壞性采樣，這可能對稀有或珍貴的水生動物，或難以收集的野生動物至關(guān)重要[45]；eDNA 方法不需要處理動物，避免了與獲得損傷性組織樣本有關(guān)的應(yīng)激[46]；與采集和處理單個動物樣品相比，樣品收集和樣品處理時間及成本可能會大大降低；由于環(huán)境樣品可能包含來自整個或大部分目標(biāo)捕撈群體的eDNA，即使eDNA 方法的診斷靈敏度較低，也可能只需要更少的樣品來檢測病原體（與單個動物樣品相比）；同一環(huán)境樣本可以分析是否存在易感宿主和多種病原體。

3.3 在水生動物疫病監(jiān)測中的局限性

基于eDNA 的病原體檢測應(yīng)用存在一定的局限性，AAC 文件總結(jié)了以下幾點：（1）由于環(huán)境稀釋和核酸的降解，環(huán)境樣品中的目標(biāo)DNA 可能非常少，這可能對該方法的靈敏度產(chǎn)生負(fù)面影響；（2）環(huán)境樣品中的目標(biāo)DNA 濃度會因一系列因素而變化，如宿主密度、感染的流行率和強(qiáng)度、采樣方法（如采樣量、過濾器孔徑、儲存條件）和環(huán)境條件（如有機(jī)物數(shù)量），因此eDNA 方法的敏感性在不同地區(qū)、不同時間和目標(biāo)種群之間的差異可能比直接取樣測試動物組織的差異更大；（3）還沒有正式的框架來評估使用eDNA 方法測試的診斷性能，這意味著使用eDNA 方法證明無疫病是不合適的；（4）與動物來源的樣本相比，在環(huán)境樣本中檢測到目標(biāo)病原體DNA 陽性，可能是污染源造成的，同樣它也可能不表明宿主動物感染了目標(biāo)病原體。

4 應(yīng)用前景

按照WOAH 《水生動物衛(wèi)生法典》的要求，聲明無某特定疫病的國家或地區(qū)必須有疫病早期監(jiān)測系統(tǒng)，養(yǎng)殖（場）戶報告發(fā)病和死亡是早期監(jiān)測系統(tǒng)的重要組成部分。養(yǎng)殖種群只有在流行病學(xué)上與野生種群有聯(lián)系時（如共享水源）才能作為后者的哨兵動物，否則就需要對野生種群進(jìn)行主動監(jiān)測，因為野生動物發(fā)病或死亡不易被發(fā)現(xiàn)并報告，特別是由于死亡或瀕臨死亡的野生動物可能會被迅速清除或捕食。野生種群的動物采樣可能會很困難，特別是當(dāng)種群偏遠(yuǎn)、分散或數(shù)量較少使得破壞性采樣不可取時，而基于eDNA 的病原體檢測方法克服了野生水生動物采樣遇到的許多問題。

在某些條件下或在某些宿主物種中，一些病原體感染，不會一成不變地引起可觀測到的臨床癥狀。在這種情況下，依靠養(yǎng)殖（場）戶（或其他人）觀察發(fā)病或死亡的早期監(jiān)測系統(tǒng)是無效的，需要主動監(jiān)測。經(jīng)常對養(yǎng)殖動物進(jìn)行采樣，并達(dá)到檢測低流行率的水平，成本較高。eDNA 方法提供了一種可行的替代方法，用于主動監(jiān)測那些很難引起可觀測臨床癥狀的病原體。它還有一個優(yōu)勢，即樣本將包含來自很大比例捕撈群體的目標(biāo)分析物。因此，與動物樣本相比，需要的環(huán)境樣本相對較少，只要能提取足夠的DNA 即可。

養(yǎng)殖場可以在生產(chǎn)周期結(jié)束或疫病控制計劃完成后，例行地進(jìn)行休漁。在休漁期進(jìn)行eDNA檢測可以對何時重新放養(yǎng)提供支持。因此，eDNA提供了一個比放養(yǎng)哨兵動物更經(jīng)濟(jì)和實用的選擇，以保證清除了病原體。

eDNA 的主要局限性是缺乏驗證和診斷性能數(shù)據(jù)，這意味著陰性結(jié)果不能用來證明無疫病，陽性結(jié)果總是需要用動物樣本來確認(rèn)。然而，在以上所述3 種情況下，環(huán)境采樣比動物采樣更有優(yōu)勢，提示eDNA 方法可以被有效整合到監(jiān)測計劃中。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展、養(yǎng)殖技術(shù)進(jìn)步和人民生活水平提高，我國進(jìn)口食用、種用和觀賞用水生動物種類和數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢，如食用類帝王蟹、龍蝦、象牙蚌，海淡水觀賞魚，進(jìn)出境種魚種蝦等，這些價格高、數(shù)量少，按照健康監(jiān)測要求進(jìn)行致死性取樣比較困難或不現(xiàn)實的物種，會因采樣數(shù)量達(dá)不到比例導(dǎo)致疫病難以被檢出。采用eDNA 方法對進(jìn)境食用水生動物、種用和觀賞水生動物的運(yùn)輸用水、運(yùn)輸工具或包裝內(nèi)水生動物主要病原進(jìn)行分子生物學(xué)檢測，不需要對水生動物進(jìn)行破壞性采樣，不需要處理動物，避免應(yīng)激，可能更適用于稀有或珍貴的水生動物，或難以收集的野生動物。與采集和處理單個動物樣品相比：eDNA 樣品收集和樣品處理時間及成本可能會大大降低，同一環(huán)境樣本可被分析是否存在多種病原體，以達(dá)到檢測水生動物疫病的目的；既能了解判斷進(jìn)境水生動物疫病狀況，防范進(jìn)境動物輸入疫病的風(fēng)險，又能不抽取減損任何動物個體，特別是少量、珍貴、特種、高貨值水生動物；既把守了國門生物安全，又便利了水生動物引進(jìn)，滿足大眾生活需要，達(dá)到雙贏；還可嘗試用于出境食用、種用和觀賞用水生動物養(yǎng)殖場、隔離暫養(yǎng)場等水生動物疫病監(jiān)測，特別是珍貴、特種高貨值水生動物及大型水面（如江、湖、河、海水養(yǎng)殖）水生動物疫病的監(jiān)測。