王義剛，黃 婷，汪俊州，唐榮幸，栗 粟，熊 勇*

(1.四川省攀枝花市中心醫(yī)院肝膽外科，四川 攀枝花 617000；2.四川省攀枝花市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，四川 攀枝花 617000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是癌癥相關(guān)死亡的常見原因，全球病死率不斷上升[1]。二甲雙胍是一種雙胍衍生物，是治療2型糖尿病最常用的一線降血糖藥物之一。流行病學(xué)研究表明，二甲雙胍治療可降低某些癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，如肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌[2-3]。但是其發(fā)揮抗癌作用的分子機(jī)制仍未清楚。微小RNA(miRNA)在腫瘤中的功能得到國(guó)內(nèi)外很多研究的認(rèn)可。二甲雙胍在抗癌效應(yīng)中涉及選擇性調(diào)節(jié)miRNA功能的發(fā)生[4]。miR-194-5p在HCC中失調(diào)，參與HCC的發(fā)展[5-6]，但是miR-194-5p是否與二甲雙胍的抗癌作用有關(guān)系，尚未可知。本研究擬以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察二甲雙胍、miR-194-5p對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控，揭示二甲雙胍與miR-194-5p/RBM6通路之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月—2019年5月期間在攀枝花市中心院肝膽外科實(shí)施HCC手術(shù)治療的患者100例，取患者癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，-80 ℃保存。隨機(jī)將患者分為2組，每組50例，設(shè)為對(duì)照組、試驗(yàn)組。對(duì)照組患者術(shù)后，口服安慰劑，試驗(yàn)組術(shù)后口服500 mg二甲雙胍緩釋片，連續(xù)給藥3個(gè)月。患者術(shù)后服用二甲雙胍前，停藥后均外周靜脈采血，取血清，-20 ℃保存。所有患者均簽署知情同意書。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①按美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(2017版)推薦標(biāo)準(zhǔn)診斷為HCC的病例；②無嚴(yán)重心腦血管疾病，無嚴(yán)重肝腎功能損害，無放化療禁忌證，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；③年齡≥18周歲；④能獨(dú)立完成本研究調(diào)查問卷者，試驗(yàn)前經(jīng)充分告知；⑤自愿配合醫(yī)務(wù)人員的指導(dǎo)和安排。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。不愿意參加臨床試驗(yàn)或不能簽署《知情同意書》；②有嚴(yán)重合并癥不能耐受手術(shù)等有創(chuàng)治療的病例； ③選擇肝移植、靶向藥物或合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例；④合并糖尿病的病例； ⑤配合性差，不愿意聽從醫(yī)務(wù)人員的指導(dǎo)和安排；初產(chǎn)婦伴有精神障礙 或溝通障礙者；本研究藥物過敏者；⑥術(shù)后病理證實(shí)為非肝細(xì)胞肝癌的患者。

1.3材料 正常肝細(xì)胞LO2、肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自中國(guó)上?？茖W(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher scientific公司；膜聯(lián)蛋白-V(Annexin V)-藻紅蛋白(Phycoerythrin,PE)/ 7-氨基放線菌素(7-AAD)熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT]細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′ -deoxyuridine,EdU)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、si-NC、si-RBM6及引物的設(shè)計(jì)合成均由上海吉瑪基因完成。

1.4方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) LO2、HepG2細(xì)胞使用改良洛克式培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素。將細(xì)胞置于37 ℃、5%二氧化碳(carbon dioxide,CO2)的飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換一次培養(yǎng)基。

1.4.2分組與處理 將antagomiRNA、antagomiR-194-5p 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并孵育24 h，用于降低HepG2細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)。pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用于升高HepG2細(xì)胞RBM6的表達(dá)。si-NC、si-RBM6分別聯(lián)合二甲雙胍、antagomiR-194-5p轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用于觀察降低RBM6對(duì)二甲雙胍、antagomiR-194-5p處理的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡的影響。將細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)細(xì)胞/孔，接種在新的培養(yǎng)皿中，并培養(yǎng)至70%～80%的融合度。使用Lipofectamine 3000將antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、二甲雙胍+si-NC、二甲雙胍+si-RBM6、antagomiR-194-5p+si-NC、antagomiR-194-5p+si-RBM6與HepG2共轉(zhuǎn)染8 h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)樣48 h。

1.4.3熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescence quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清、組織或細(xì)胞中miR-194-5p、RBM6的表達(dá) 用總RNA抽提試劑(total RNA extraction reagent，TRIzol)提取細(xì)胞總RNA。通過Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。在cDNA合成過程中使用新的靶向特異性頸環(huán)引物進(jìn)行qPCR，確定miR-194-5p的表達(dá)。miR-194-5p的參照標(biāo)準(zhǔn)為小核RNA(U6)。RBM6的檢測(cè)為：對(duì)提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增和qPCR，通過熔融曲線對(duì)PCR產(chǎn)物RBM6進(jìn)行定量。2-△△Ct計(jì)算結(jié)果。RBM6的參照標(biāo)準(zhǔn)為β-actin。所用引物的核苷酸序列如下：miR-194-5p(5-CTAGTACCTAGAGGAACCTTTGAAGACT-GTTACAGCTCAGCA-3′，5′-AGCTTGCTGAGC-TGTAACAGTCTTCAAAGGTTCCTCTAGGTA-3′，退火溫度61.2 ℃)；U6(正向5′-GTGGACCGC-ACAAGCTCGCT-3′，5′-TTGTTGAACGGCAC-TGTGTATAGCA-3′，退火溫度59.8 ℃)；RBM6(正向5′-TGGAGTATGTATCAAGCCTGGA-3′，5′-ATGAAC AGGAAGATCGGTGCC-3′，退火溫度61.0 ℃)；β-actin(正向5′GGTGTCTGTGAG-AGGACGAGGAG-3′，反向5′-TCTGGTGATGG-AGCCTCTTACTGG-3′，退火溫度60.0 ℃)。

1.4.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 胰酶消化培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，接種96孔培養(yǎng)板，每孔1 000個(gè)細(xì)胞。再向孔中添加終濃度為500 ng/L的MTT溶液，37 ℃下孵育4 h。再加入100 μL/孔的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，使晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上以490 nm波長(zhǎng)的光度讀取吸光值(A490)。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5EdU染色檢測(cè)細(xì)胞增殖 準(zhǔn)備1 000倍稀釋的EdU溶液，配置成50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，取100 μL與細(xì)胞用培養(yǎng)2 h，標(biāo)記細(xì)胞。將細(xì)胞接種在96孔板，并用4%多聚甲醛溶液固定，用0.5%Triton X-100孵育10 min。1×Apollo染色液100 μL/孔，避光孵育30 min。0.5%Triton X-100滲透10 min。磷酸緩沖鹽溶液 (phosphate buffered saline,PBS)沖洗，1×4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)進(jìn)行核染色，避光，室溫反應(yīng)30 min。PBS再次沖洗，用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄EdU陽(yáng)性染色。EdU陽(yáng)性率(%)=紅色熒光細(xì)胞數(shù)(EdU染色)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)(DAPI染色)×100%。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照Annexin V-PE/7-AAD熒光雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒制造商的說明書要求操作。收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2次，用500 μL的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞。取5 μL的Annexin V-PE和5 μL的 7-AAD加入細(xì)胞，室溫避光孵育細(xì)胞15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞凋亡。

1.4.7雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞熒光活性 將含有3′非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合位點(diǎn)的野生型RBM6和不含有假定結(jié)合位點(diǎn)的突變型RBM6插入到螢火蟲熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK-2。利用Lipofectamine 3000將構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因載體(野生型或突變型RBM6)與agomiRNA、agomiR-194-5p、antagomiRNA、antagomiR-194-5p共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒制造商的說明要求操作，使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.4.8蛋白免疫印跡(western blot,WB)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞RBM6蛋白表達(dá) 胰酶消化并收集細(xì)胞，RIPA裂解，再超聲裂解1 min。4 ℃下12 000 g離心10 min，獲得總蛋白。采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)法分析樣品蛋白濃度，沸水浴變性蛋白。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離每個(gè)樣品中的蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜(200 mA，2 h)。室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜2 h，在4 ℃下與一抗溶液(1 500倍稀釋的兔抗RBM6多抗)孵育過夜。用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)洗滌3次，PVDF膜在37 ℃下與二抗(2 000倍稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗)孵育2 h。蛋白質(zhì)條帶通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，利用Quantity One軟件對(duì)各條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并組織繪圖。計(jì)量資料比較用單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。使用K-M法繪制患者的DFS生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1二甲雙胍治療對(duì)肝癌患者血清miR-194-5p的調(diào)控及預(yù)后的影響 試驗(yàn)組患者2年內(nèi)的DFS為92%，對(duì)照組為64%，試驗(yàn)組患者的2年DFS顯著高于對(duì)照組(圖1)。試驗(yàn)組、對(duì)照患者的性別、腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。對(duì)照組、試驗(yàn)組患者血清miR-194-5p均顯著降低。治療后試驗(yàn)組患者血清miR-194-5p顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表1 2組性別、腫瘤大小比較

表2 肝癌患者血清miR-194-5p相對(duì)表達(dá)

圖1 肝癌患者2年DFS分析

2.2二甲雙胍調(diào)控肝癌細(xì)胞中miR-194-5p的表達(dá)及細(xì)胞存活 二甲雙胍組HepG2細(xì)胞miR-194-5p表達(dá)顯著低于空白組，A490值、EdU陽(yáng)性率均顯著低于空白組，凋亡率顯著高于空白組(P<0.05)。見表3。

表3 二甲雙胍處理的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡情況

2.3miR-194-5p在肝癌組織、細(xì)胞中的表達(dá) 與癌旁組織或LO2細(xì)胞相比，癌組織、HepG2細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表4，5。

表4 miR-194-5p在肝癌組織中的表達(dá)

表5 miR-194-5p在細(xì)胞中的表達(dá)

2.4抑制miR-194-5p對(duì)肝癌細(xì)胞存活的影響 與antagomiRNA相比，antagomiR-194-5p HepG2細(xì)胞中miR-194-5p表達(dá)顯著降低，A490值、EdU陽(yáng)性率均顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表6。

表6 抑制miR-194-5p的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡情況

2.5miR-194-5p靶向RBM6 生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站Starbase預(yù)測(cè)到RBM6的3′UTR端與miR-194-5p有連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。轉(zhuǎn)染agomiR-194-5p的野生型RBM6(RBM6 3′UTR-WT)細(xì)胞的熒光活性顯著降低，轉(zhuǎn)染antagomiR-194-5p的RBM6 3′UTR-WT細(xì)胞的熒光活性顯著升高(圖2B)(P<0.05)。與agomiRNA相比，agomiR-194-5p細(xì)胞RBM6蛋白表達(dá)顯著降低，與antagomiRNA相比，antagomiR-194-5p細(xì)胞RBM6蛋白表達(dá)顯著升高(圖2C)(P<0.05)。肝癌組織中RBM6的表達(dá)顯著低于癌旁組織(圖2D)，癌組織中RBM6的表達(dá)與miR-194-5p之間呈顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖2E)。

圖2 miR-194-5p靶向調(diào)節(jié)RBM6

2.6過表達(dá)RBM6對(duì)肝癌細(xì)胞存活的影響 與pcDNA 3.1相比，pcDNA 3.1-RBM6細(xì)胞RBM6表達(dá)明顯升高，A490值、EdU陽(yáng)性率均顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見表7。

表7 過表達(dá)RBM6的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡情況

2.7敲減RBM6對(duì)二甲雙胍、抑制miR-194-5p的抗肝癌細(xì)胞存活作用的影響 與二甲雙胍+si-NC相比，二甲雙胍+si-RBM6細(xì)胞RBM6表達(dá)降低，A490值、EdU陽(yáng)性率均顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。與antagomiR-194-5p+si-NC相比，antagomiR-194-5p+si-RBM6細(xì)胞RBM6表達(dá)降低，A490值、EdU陽(yáng)性率均顯著升高，凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表8～9。

表8 敲減RBM6聯(lián)合二甲雙胍的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡情況

表9 敲減RBM6聯(lián)合抑制miR-194-5p的HepG2細(xì)胞增殖、凋亡情況

3 討 論

最近，多項(xiàng)研究表明，二甲雙胍對(duì)抑制癌癥(包括肝細(xì)胞癌)的生長(zhǎng)[7-8]，預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)有益[9]，但是其潛在的作用機(jī)制尚未清楚。Zhao等[10]發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍抑制了白細(xì)胞介素22(interleukin-22,IL-22誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的發(fā)生率和腫瘤的生長(zhǎng)；體外研究顯示，二甲雙胍可抑制IL-22誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，IL-22的過表達(dá)使肝癌更具侵襲性，而二甲雙胍在體外和體內(nèi)對(duì)其作用有很大影響，二甲雙胍產(chǎn)生這種抗癌作用的機(jī)制與蛋白激酶Hippo信號(hào)通路有關(guān)。Shen等[11]研究也報(bào)道，二甲雙胍可抑制體內(nèi)肝細(xì)胞癌腫瘤的生長(zhǎng)，抑制體外癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡和焦亡，其潛在的作用機(jī)制為上調(diào)叉形頭轉(zhuǎn)錄因子的O亞型3(forkhead box O-3,FOXO3)進(jìn)而激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)轉(zhuǎn)錄。此研究通過對(duì)100例術(shù)后的肝癌患者研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后給予二甲雙胍后，患者的無病生存期(disease-free survival,DFS) 顯著升高，血清miR-194-5p水平明顯降低，并且體外用二甲雙胍處理肝癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞miR-194-5p也下調(diào)，并且癌細(xì)胞的增殖能力受到抑制，凋亡能力得到顯著增強(qiáng)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了二甲雙胍能夠延長(zhǎng)肝癌患者術(shù)后的2年無瘤生存期，有助于抵抗腫瘤的生存。由于二甲雙胍抑制miR-194-5p表達(dá)，此研究進(jìn)一步檢測(cè)了腫瘤組織中miR-194-5p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p在癌組織、癌細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào)，暗示了二甲雙胍可能是通過抑制miR-194-5p發(fā)揮的抗肝癌功能。

據(jù)報(bào)道，miR-194-5p通過調(diào)控RNA結(jié)合蛋白(polyrimidine tract binding protein 1,PTBP1)、FOXA1、長(zhǎng)鏈非編碼RNA 微小染色體維持基因3AP-反向序列(long strand non coding RNA minichromosome mantenance 3AP-inverted sequence,MCM3AP-AS1)參與HCC的發(fā)展[12-14]。Niu等[15]研究報(bào)道，miR-194在HCC中高表達(dá)并且與HCC的惡化密切相關(guān)，具有促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，阻滯細(xì)胞周期的作用；體內(nèi)裸鼠異種移植腫瘤顯示，miR-194促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，揭示了miR-194在HCC預(yù)后中的治療價(jià)值。Fan等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-194-5p在HCC中表達(dá)上調(diào)，可誘導(dǎo)肝癌的免疫抑制，增強(qiáng)程序性死亡受體的表達(dá)及功能。本研究結(jié)果顯示，miR-194-5p在肝癌組織、細(xì)胞中高表達(dá)，抑制miR-194-5p明顯的降低了癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)出抗癌功能。深入研究顯示，miR-194-5p靶向負(fù)調(diào)控RBM6，二者在癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

RBM6在多種癌癥中失調(diào)，發(fā)揮腫瘤抑制作用[17-18]，但是其在HCC中的功能研究十分罕見。Ye等[19]在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，RBM6在肝癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，與腫瘤大小、腫瘤分期系統(tǒng)(tumor node metastasis classification,TNM)分期和組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，高表達(dá)組的生存率高于低表達(dá)組；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)RBM6顯著降低了細(xì)胞活力和侵襲能力，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡能力，揭示了RBM6的腫瘤抑制基因功能。本研究結(jié)果顯示，RBM6在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)RBM6抑制了HepG2細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡，這與Ye的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，再次證實(shí)了RBM6在肝癌中的抑癌作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，敲減RBM6削減了二甲雙胍、抑制miR-194-5p對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。

綜上所述，二甲雙胍抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，延長(zhǎng)患者的無瘤生存期，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與抑制miR-194-5p進(jìn)而上調(diào)RBM6有關(guān)，為二甲雙胍在肝細(xì)胞癌治療中的應(yīng)用提供支持。