馮麗娜，溫 泉，王 杰，王 琦，張馨月，黎明全，王慶偉*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院腦病科，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長春 130117）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD），是一種起病隱匿的神經(jīng)退行性病變，現(xiàn)已成為全世界重要的公共衛(wèi)生問題，居世界死亡原因第五位[1]。中國、印度及拉丁美洲地區(qū)阿爾茨海默病的患病率正快速增長[2]，預(yù)計到2040年，中國、印度等國家增長速度約為自身3倍[3]。但該病的發(fā)病機制尚未完全透徹，多種假說鼎足而立，其中最廣為科學(xué)研究者研究的發(fā)病機制之一是淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)水解后可產(chǎn)生對神經(jīng)細胞有毒性的Aβ25-35肽段即“β淀粉樣蛋白學(xué)說”。課題組傳承國醫(yī)大師任繼學(xué)教授的“腦髓理論”，結(jié)合《靈樞·大惑論》內(nèi)容，同時綜合李杲、葉天士等先賢的醫(yī)學(xué)理論[4]，創(chuàng)新提出“髓虛毒損”是阿爾茨海默病的病機關(guān)鍵，認為腎精不足，腦髓失養(yǎng)，加之瘀血內(nèi)阻，脂膏壅塞，水津血互滲，聚為痰涎，與瘀血互阻，毒自內(nèi)生，毒邪損害，神機失用。故應(yīng)用“上下交損，當治其中”治療理念，確立解毒益智方。

解毒益智方由川芎、黃連、益智仁、龜板膠、地龍、山茱萸、酒大黃7味藥組成。課題組前期證實，運用解毒益智方治療非癡呆型血管性認知功能障礙（ⅤCIND）72例患者6個月后，MMSE、MOCA、ADL評分變化明顯優(yōu)于對照組（口服尼莫地平片）[5]。前期亦證實，解毒益智方中黃連多糖（Coptis chinensis polysaccharide，CCP）通過抑制MAPK/JNK信號通路，對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞神經(jīng)毒性起到保護作用[6]。且黃連多糖可明顯延長阿爾茨海默病模型線蟲（CL4176線蟲）壽命、抑制線蟲頭部Aβ肽聚集，從而對抗神經(jīng)毒性[7]。本實驗用Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞構(gòu)建阿爾茨海默病模型，通過觀測給予解毒益智方低、中、高劑量前后細胞活力及PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達情況，探討解毒益智方對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細胞神經(jīng)毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 PC12細胞與解毒益智方含藥血清制備 腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞），購買于中科院上海細胞庫。解毒益智方及含藥血清的制備：解毒益智方由黃連、益智仁、川芎、山茱萸、酒大黃、地龍、龜板膠按比例1:2:1:1:1:1:1組成，飲片由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院藥學(xué)部提供。將方中所有藥物浸泡30 min后，煎煮1 h并提取藥液，如此反復(fù)操作2次，合并藥液并濃縮至濃度為1.67 g/mL制成凍干粉備用。選取200～280 g Spargue Dawley（SD）大鼠30 只[遼寧長生生物技術(shù)有限公司 SCXK（遼）提供：2020-001]，根據(jù)體表面積折算后，最終按16.67 g/（kg·d），稱重后以1 mL/100 g進行連續(xù)灌胃7 d，進行腹主動脈采血制備含藥血清，經(jīng)離心及高壓滅菌后置于-20 ℃冰箱備用。

1.2 實驗試劑 Aβ25-35 淀粉樣β蛋白片段（Sigma：A4559-1MG）；胎牛血清FBS（Gibco：10099-141）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco：10569010）；磷酸鹽緩沖液PBS（Gibco：10010023）；MTT（上海碧云天：ST1537-5g）；胰酶細胞消化液EDTA（上海碧云天：C0205）；二甲基亞砜DMSO（北京索萊：67-68-5）；青霉素-鏈霉素（Gibco公司：15140163）。鼠抗PI3K、兔抗P-Akt、鼠抗p53、兔抗Gsk-3β蛋白、兔抗GAPDH、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗 鼠IgG（CST：13666S；40060S；2524S；12456T；5174S；8884S；51332S）。

1.3 細胞培養(yǎng)與凍存 將凍存管置于37 ℃水浴鍋融化PC12細胞后，1:2加DMEM培養(yǎng)基，將液體吸出置于5 mL離心管，以1 000 r/min離心5 min后棄上清，加培養(yǎng)基（90% DMEM加10%FBS加1%雙抗）重懸，轉(zhuǎn)置于25 cm2培養(yǎng)瓶后，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h更換培養(yǎng)基。取對數(shù)期細胞進行1:2傳代。對數(shù)期細胞消化離心后，按1:2凍存，凍存液為DMSO:FBS按照1:9進行配制，液氮保存。

1.4 實驗分組與Aβ25-35制備 實驗分為空白組、模型組、解毒益智方低劑量組、中劑量組、高劑量組。Aβ25-35配制：1 mg Aβ25-35粉末溶于0.943 mL超純水，獲得濃度為100 μmol/L，分裝于1.5EP管中置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育7 d，老化后取出，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MTT法對大鼠含藥血清濃度及Aβ25-35最佳誘導(dǎo)濃度確定 將對數(shù)期PC12細胞胰酶消化、離心、棄上清后，加入2 mL培養(yǎng)基吹勻。吸取10 μL注入細胞計數(shù)板進行計數(shù)，按每孔1×104進行均勻鋪板。次日在細胞密度約為60%時，棄原培養(yǎng)基加入新培養(yǎng)基（10%不同濃度大鼠含藥血清加90%DMEM加2%雙抗），培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT孵育4 h，吸除每孔液體后加入150 μL DMSO，37 ℃搖床震蕩10 min，置于酶標儀中，設(shè)置波長490 nm，根據(jù)測定吸光度值（OD值）進行細胞增殖率測定。Aβ25-35損傷濃度確定及損傷時間操作同上。

1.6 PC12細胞形態(tài)學(xué)觀察 鋪板操作同上，將PC12細胞按密度1×104接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后待細胞密度約為60%時進行給藥及造模處理。分為空白組（空白血清）、模型組（空白血清加Aβ25-35）、解毒益智方低劑量組（低劑量含藥血清加Aβ25-35）、解毒益智方中劑量組（中劑量含藥血清加Aβ25-35）及解毒益智方高劑量組（高劑量含藥血清加Aβ25-35）。先后孵育48 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.7 解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達的影響 將不同組細胞收集、裂解以提取蛋白，12 000 r/min離心5 min后收集上清。BCA試劑盒進行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸變性。10%SDS-PAGE電泳分離，PⅤDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌后按說明書稀釋加入一抗PI3K（1:1 000）、p-Akt（1:500）、GSK3β（1:1 000）、p53（1:1 000）、GAPDH（1:5 000），4 ℃孵育搖床過夜。TBST洗滌后加入二抗，2 h室溫孵育后滴入ECL工作液曝光拍照。用Image J軟件定量分析目的條帶蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOⅤA）。

2 結(jié)果

2.1 大鼠含藥血清濃度的確立、不同濃度解毒益智方含藥血清毒性的確定及Aβ25-35損傷濃度確定 通過MTT法檢測不同濃度（10%、20%、30%、40%、50%）大鼠血清對PC12細胞活力值影響。不同濃度大鼠血清與PC12細胞共培養(yǎng)24 h后，如圖 1a所示，當大鼠血清含量為10%時與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示可選擇10%大鼠含藥血清作為藥物載體，且對細胞增值無影響。當測定不同濃度（10、20、25、30、40 μmol/L）Aβ25-35對PC12細胞損傷情況時，如圖 1b結(jié)果所示：與空白組相比，Aβ25-35預(yù)處理24 h后，隨著濃度增加細胞活力值下降，當濃度達到40 μmol/L時，細胞存活率降至50%以下，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，40 μmol/L Aβ25-35作為誘導(dǎo)PC12細胞毒性最佳濃度。當用解毒益智方各濃度含藥血清預(yù)處理PC12細胞，結(jié)果表明，解毒益智方各劑量組對PC12細胞均無明顯毒性作用，且高劑量組可促進細胞活力，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見圖 1c。

圖1 大鼠含藥血清及Aβ25-35最佳誘導(dǎo)濃度的確立；解毒益智方各劑量組對PC12細胞活力影響

2.2 解毒益智方對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞形態(tài)學(xué)影響 空白組PC12細胞密度較大、貼壁生長且為正常神經(jīng)上皮細胞狀態(tài)，中部飽滿、觸角伸長梭形；模型組細胞密度較小，成片未貼壁且透亮、無明顯觸角，形態(tài)類似圓形。解毒益智方低、中、高劑量組預(yù)處理后，細胞懸浮死亡現(xiàn)象較模型組好轉(zhuǎn)，尤以高劑量效果明顯。高劑量組細胞密度大且呈梭型狀態(tài)，有觸角。表明解毒益智方高劑量組預(yù)處理PC12細胞對A β25-35誘導(dǎo)的損傷具有很好的保護作用。

2.3 解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、P53蛋白表達的影響 如圖 2所示，Western Blot實驗結(jié)果可知：與正常對照組相比，模型組PI3K、p-Akt蛋白表達顯著下降，GSK3β、p53蛋白表達顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。應(yīng)用解毒益智方低、中、高劑量后，與模型組相比PI3K、p-Akt蛋白表達顯著上升，GSK3β、p53蛋白表達 顯著下降，尤以高劑量組效果明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明解毒益智方可能通過調(diào)控PI3K/AK T/Gsk3β/p53信號通路，對Aβ25-35 誘導(dǎo)PC12細胞神經(jīng)毒性起保護作用。

圖2 各劑量組解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達的影響

3 討論

隨著人口老齡化，癡呆已成為老年人常年病，其中阿爾茨海默病型癡呆占比達60%～80%，現(xiàn)已成為老年人失能和死亡的主要原因[8-9]。中國是世界上癡呆患者最多的國家，流行病學(xué)調(diào)查指出中國60歲以上人口中癡呆患者約1 507萬，其中阿爾茨海默病約983萬人[10]。阿爾茨海默病是最常見的癡呆類型，因其起病隱匿、早期診斷困難，可導(dǎo)致患者認知障礙、精神行為問題和社會及生活功能喪失，給公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了沉重的經(jīng)濟和社會負擔(dān)[11]。我國的癡呆診療文獻比世界上首個阿爾茨海默病病例報道早283年[12]，關(guān)于阿爾茨海默病的記錄散見于中醫(yī)所述的“善忘”“癡呆”“呆癡”“呆病”“郁證”“癲狂”等一類文獻當中[13-14]。對于“癡呆”一詞作為疾病最早的記載出現(xiàn)在先秦時期《左傳》中“周子有兄而無慧，不能辨菽麥，故不可立”“不慧，蓋世人所謂白癡”[14]。漢代《華佗神醫(yī)秘傳》最早出現(xiàn)“癡呆”一詞，是指腦髓消減、神機失用的一種神志異常疾病，有呆傻愚笨、智能低下、善忘等臨床表現(xiàn)。阿爾茨海默病其病因以內(nèi)因為主，漸使腦髓空虛或腎精虧耗，痰瘀互阻，腦髓失養(yǎng)而發(fā)病。腎虛貫穿阿爾茨海默病的整個病程，為本，痰凝血瘀是發(fā)病的直接原因，為標，二者互為因果，致阿爾茨海默病病情發(fā)生和發(fā)展。解 毒益智方是在補腎益髓，活血化痰解毒法的前提下組方，由益智仁、黃連、川芎、龜板膠、地龍、山茱萸、酒大黃7味藥組成，其中益智仁為君藥，補腎之陰陽，溫腎益精；山茱萸補益肝腎，助陽益精；龜板膠補腎滋陰，三藥配伍，補腎益髓，使腦髓得養(yǎng)，共為臣藥。黃連與酒大黃共清上焦火熱；川芎活血行氣，上行頭面，中開郁結(jié)，與地龍配伍二藥共奏活血通絡(luò)之功。諸藥配伍，補腎填精益髓，瘀血 濁毒得清，腦髓得養(yǎng)，益智醒神[5]。

阿爾茨海默病常見的病理表現(xiàn)有：神經(jīng)元外淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）聚集形成“老年斑”、神經(jīng)元內(nèi)Tau蛋白磷酸化異常聚集形成“神經(jīng)原纖維纏結(jié)”、神經(jīng)炎癥、腦神經(jīng)元/突觸丟失、腦萎縮、葡萄糖代謝障礙等[15]。目前，阿爾茨海默病的治療方法主要基于“Aβ級聯(lián)假說、Tau蛋白過度磷酸化”，仍無法有效阻止或延緩阿爾茨海默病的疾病進程，因此找到阿爾茨海默病有效的治療靶點迫在眉睫，國內(nèi)外學(xué)者仍在努力探尋治療方法[17]。

阿爾茨海默病發(fā)病與糖代謝異常的關(guān)系一直被人們所關(guān)注，已經(jīng)揭示中樞胰島素信號受損與淀粉樣蛋白代謝之間存在必然的關(guān)聯(lián)。阿爾茨海默病患者早期即出現(xiàn)葡萄糖代謝及胰島素信號異常[17]。正常情況下，胰島素信號通路可以通過抑制APP的裂解酶BACE1（淀粉樣蛋白前體β-分解酶1）的產(chǎn)生，抑制Aβ產(chǎn)生和Tau蛋白磷酸化[18]。近來研究表明，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路主要參與了Aβ的形成，PI3K-Akt信號通路是調(diào)節(jié)受損神經(jīng)細胞修復(fù)、促進神經(jīng)細胞存活的重要信號通路[19]。PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110結(jié)合位點構(gòu)成，當p85發(fā)生磷酸化時，p110抑制被解除，激活PI3K[20]。Akt是PI3k下游靶點，在PI3K/Akt/GSK3β信號通路中起到樞紐作用。Akt磷酸化后，神經(jīng)保護作用被激活[21-22]。削弱P13 K/Akt信號途徑能使下游信號分子Akt，刺激糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化[23]，上調(diào)γ分泌酶活性而促進Aβ40、Aβ42的合成。PI3K/Akt激活受限，影響下游激酶的級聯(lián)激活途徑導(dǎo)致GSK-3β等表達紊亂，大腦代謝失衡，且GSK3β是Akt重要底物，活性受Akt負調(diào)控，并與Tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān)[24-25]。PI3K/Akt的活化降低使其對GSK-3β的抑制減弱，GSK-3β是細胞凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，可導(dǎo)致早老素異常增加伴隨Aβ的堆積，還可引起糖原、脂肪酸和蛋白質(zhì)的合成障礙，使神經(jīng)遞質(zhì)合成減弱，降低突觸可塑性，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失[26-27]。另TP53基因誘導(dǎo)表達p53蛋白，通過促進細胞增殖和凋亡，加劇神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的發(fā)展[28]。已有研究顯示，Aβ的神經(jīng)毒性與PI3K/Akt/GSK3β信號通路密切相關(guān)[29-30]，因此找到可調(diào)控PI3K/Akt/GSK3β信號通路的藥物對抗Aβ神經(jīng)毒性，可能成為防治阿爾茨海默病的一個新途徑。本實驗研究表明，Aβ25-35可顯著降低PC12細胞中PI3K、Akt蛋白表達，提高GSK3β、p53蛋白表達水平，而應(yīng)用解毒益智方能夠上調(diào)PI3K、Akt蛋白表達水平，降低GSK3β、p53蛋白表達水平（P＜0.05）。說明解毒益智方對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細胞神經(jīng)毒性具有保護作用，可能是通過活化PI3K，磷酸化下游蛋白Akt，從而降低GSK3β蛋白與p53蛋白表達，發(fā)揮神經(jīng)毒性保護作用。