丁云錄，唐皓潔，呂喜月，李曉兵，劉迎輝

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

本實驗通過建立大鼠MIRI模型進行動物藥效學實驗研究，驗證宣痹通瘀膠囊是否通過減輕心肌細胞線粒體損傷，從而抑制心肌細胞凋亡，達到防治心肌缺血再灌注損傷的作用。通過此實驗研究為進一步明確藥物的作用靶點，為中醫(yī)藥理論體系下的“精準醫(yī)學”奠定基礎，同時也為中醫(yī)藥防治心肌缺血再灌注損傷奠定理論基礎，為新藥研究提供實驗數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級SD大鼠，體質量250～270 g，雌雄兼用，購于遼寧長生生物技術股份有限公司，SCXK-（吉）2020-0001。宣痹通瘀膠囊，內(nèi)容物為深褐色顆粒，由長春中醫(yī)藥大學實驗研究中心提供（批次：20190920）。LY294002，規(guī)格：每支5 mg，批號：20211207，江蘇凱基生物技術股份有限公司。通心絡膠囊，規(guī)格：每粒0.26 g，批號：A2111013，石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。異氟烷，規(guī)格：每瓶100 mL，產(chǎn)品批號：19122503，瑞沃德生命科技有限公 司。CK-MB試 劑 盒（10 mL×10支，210061）、LDH-L試劑盒（10 mL×10支，210051），中生北控生物科技股份有限公司；MDA試劑盒（每盒50 T，20210925）、SOD試劑盒（每盒50 T，20211019），南京建成生物工程研究所。cTnI檢測試劑盒，規(guī)格：每盒96 T，Lot：11/2021，Exp：04/2021，黃石研科生物科技有限公司。Powerlab/8s數(shù)據(jù)分析儀（澳大利亞埃德公司）。BIO680酶標儀，BIO-RAD（伯樂）公司產(chǎn)品。ⅤMR動物麻醉機：型號：Matrx ⅤIP3000系列，美國MIDMARK。BI-2000醫(yī)學圖象分析儀，成都泰盟科技有限公司。selectra junior全自動分析儀，荷蘭威圖公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機，德國賀利氏公司；IX71倒置熒光顯微鏡，日本OLYMPUS。

1.2 實驗方法[1-6]

1.2.1 分組給藥 大鼠適應環(huán)境結束后，隨機分為5個實驗組：假手術組、模型組、宣痹通瘀膠囊組（前期實驗已證明其最佳藥效劑量為3.2 g/kg）、宣痹通瘀+LY294002組（PI3K/AKT通路抑制劑，簡稱LY）以及通心絡膠囊陽性對照組。每組10只大鼠。用0.5%CMC-Na將宣痹通瘀膠囊、通心絡膠囊配制成混懸液。假手術組與模型組動物均給予等體積（10 mL/kg/次）0.5%CMC-Na懸液。宣痹通瘀膠囊+LY組除按照宣痹通瘀膠囊組給藥濃度和劑量灌胃給藥以外，每日1次，皮下注射PI3K/Akt抑制劑 LY294002，10 mg/kg/d。（1 mg LY294002：1.171 mL DMSO）。各組動物每日給藥1次，連續(xù)2周。

1.2.2 模型制備 末次給藥后，ⅤMR動物麻醉機麻醉大鼠，左側3～4肋間開胸，露出心臟，找到冠狀動脈左前下降支（位于肺動脈圓錐和左心房之間），用0號絲線距離其根部2～3 mm 處穿出立即結扎，結扎時用一細小乳膠管墊于結扎線與血管之間，將心臟送回至胸腔，擠出胸腔內(nèi)氣體與血液，迅速閉合胸腔，胸腔打開時間應該不超過30 s。假手術組僅穿線不結扎。結扎缺血30 min后，松解結扎線進行再灌注，再灌注2 h，收集相關試驗數(shù)據(jù)。

1.2.3 檢測指標 1）心臟功能測定：連接生物信號采集系統(tǒng) PowerLab、壓力換能器及聚乙烯導管，分離大鼠右頸總動脈，監(jiān)測大鼠LⅤSP、LⅤEDP、±dp/dtmax。2）心肌相關酶學及抗氧化指標：按試劑盒說明書要求測定血清CK-MB、LDH、SOD、cTnⅠ活性以及MDA含量。3）NBT染色法檢測心肌梗死面積：心肌梗死面積=未染色心肌面積和/心肌切片總面積和×100%。4）心肌細胞凋亡指數(shù)（TUNEL法）檢測：統(tǒng)計心肌細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，細胞凋亡率=陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 試驗數(shù)據(jù)采用組間t檢驗進行統(tǒng)計學處理。

2 結果

2.1 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心臟功能的影響 宣痹通瘀、宣痹通瘀+LY、通心絡組與模型組比較，均可明顯升高LⅤSP、+dp/dtmax（P＜0.05或P＜0.01）；宣痹通瘀+LY組可明顯降低LⅤEDP（P＜0.05），見表1。

表1 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心臟功能的影響（，n =10）

表1 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心臟功能的影響（，n =10）

注：與模型組比較，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.2 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心肌梗死面積的影響 宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg劑量組及宣痹通瘀膠囊

3.2 g/kg+LY10 mg/kg劑量組動物的心肌梗死面積分別與模型組比較，均明顯低于模型對照組（P＜0.01），見表2。

2.3 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心肌細胞凋亡率的影響 宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg劑量及宣痹通瘀膠囊

3.2 g/kg+LY10 mg/kg劑量藥物干預后，與模型組大鼠比較，心肌細胞凋亡率均有明顯降低（為P＜0.01和P＜0.05），見表2。

表2 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心肌細胞凋亡率及心肌梗死面積百分比的影響（，n =10）

表2 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠心肌細胞凋亡率及心肌梗死面積百分比的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.4 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清相關酶學指標的影響 與 MIRI模型組比較，宣痹通瘀膠囊3.2g/kg與宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg+LY10 mg/kg劑量組大鼠血清中LDH、CK-MB、cTnI 含量顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），見表3。

表3 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清相關酶學指標的影響（，n =10）

表3 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清相關酶學指標的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P＜0.05；△△P＜0.01

2.5 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響 宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg劑量組、宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg+LY10 mg/kg劑量組、陽性對照藥通心絡膠囊組動物血清中MDA含量明顯低于模型組（為P＜0.01或P＜0.05）；而SOD活性卻明顯高于模型組（分別為P＜0.01或P＜0.05）。并且宣痹通瘀膠囊3.2g/kg+LY10 mg/kg劑量組升高動物血清SOD活性優(yōu)于通心絡膠囊0.56 g/kg劑量組；降低MDA含量的作用明顯優(yōu)于宣痹通瘀膠囊3.2 g/kg劑量組，見表4。

表4 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響（，n =10）

表4 宣痹通瘀膠囊對MIRI大鼠血清SOD活性及MDA含量的影響（，n =10）

注：與模型對照組比較，# P＜0.05；△△P＜0.01；與宣痹通瘀+LY組比較，△P＜0.05

3 討論

心肌缺血/再灌注損傷（MIRI），是一個復雜的病理生理過程，重者可致心肌微血管受損及不可逆的細胞壞死和凋亡等[7-8]。MIRI發(fā)生后，心肌細胞缺血性壞死，細胞結構嚴重受損，線粒體通透性改變，氧自由基增加，內(nèi)皮細胞膜受到損傷，導致大量心肌酶學指標從心肌細胞中釋放入血，故其含量顯著增高，因此檢測心肌酶學指標對急性心血管事件的診斷具有重要意義。MIRI引起的乳酸、一氧化氮堆積等均會加速正常細胞的凋亡[9-11]；心肌細胞中重要的調(diào)節(jié)蛋白cTnI是心肌損傷壞死的標志物，心肌受損程度與其升高水平相關[12-15]；CK-MB主要留存于心肌中，心肌細胞受損后，其在血清中特異性及靈敏度較高，可作為再灌注損傷的血清標志物之一[16-18]；LDH廣泛存在于全身組織細胞的胞漿線粒體中，當心肌損傷時，其血清濃度也相應升高。因此 CK-MB、cTnT、LDH這三種指標均可作為心肌損傷指標；另外相關資料反映冠心病患者心肌缺血、缺氧程度的重要標志之一，為血清中MDA含量升高及SOD活性下降[19-21]。

在本試驗中，宣痹通瘀膠囊預防性給藥可以明顯改善心臟功能指標；降低心肌梗死面積；明顯降低心肌細胞凋亡率，有效抑制細胞凋亡；血清中CK-MB、LDH、cTnI 含量顯著降低；能夠明顯提高體內(nèi)SOD的活性；可以有效減少MDA的含量；綜上可見，宣痹通瘀膠囊對心肌缺血/再灌注損傷有明顯的保護作用。