張國(guó)志 李珊珊 鄭火青 胡福良

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058）

近年來(lái)，隨著抗生素的濫用，越來(lái)越多的細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，這對(duì)全世界公共衛(wèi)生是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。蜂蜜復(fù)雜的化學(xué)成分使得其具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[1]。多項(xiàng)研究表明蜂蜜可以作為一種替代或補(bǔ)充的抑菌方法[2-4]。

蜂蜜的化學(xué)成分受植物來(lái)源、地理來(lái)源、蜂種來(lái)源、氣候條件、加工方式等因素影響[5,6]。正因如此，蜂蜜可以作為一種強(qiáng)大的抗菌劑，甚至其抑菌和殺菌作用可以媲美抗生素[5,7,8]。研究表明過(guò)氧化氫是大多數(shù)蜂蜜的主要抑菌成分[9]，過(guò)氧化氫通過(guò)解離出具有高活性的羥基自由基抑制微生物的生長(zhǎng)。蜂蜜中過(guò)氧化氫是葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖過(guò)程產(chǎn)生的，此外多酚自氧化等也可產(chǎn)生過(guò)氧化氫[10]。除過(guò)氧化氫外，蜂蜜的滲透壓、pH、酚酸、黃酮、王漿主蛋白、抗菌肽、丙酮醛等也是蜂蜜發(fā)揮抑菌作用的因素[11]。Zhang等[12]研究國(guó)產(chǎn)9 種蜂蜜的抗氧化和抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茴香蜜、藿香蜜和石榴蜜抗菌和抗氧化活性均較好，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的潛力。Anand[13]等研究表明藿香蜜在40%濃度下具有良好的抑制白色念珠菌及皮膚真菌的作用。目前研究表明沙棗蜜[14]、神農(nóng)架蜂蜜[15]、石榴蜜[16]和蘋果蜜[17]均具有良好的抗氧化活性，但是缺少抑菌活性的評(píng)價(jià)。

我國(guó)幅員遼闊，蜜粉源植物豐富，蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物并經(jīng)充分釀造后形成了各具特色的蜂蜜。本研究收集國(guó)內(nèi)6 種不同植物來(lái)源的蜂蜜，通過(guò)測(cè)定蜂蜜樣品的抗氧化能力以及蜂蜜樣品對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌效果，以期發(fā)掘具有良好抑菌活性的蜂蜜，為特色蜂蜜的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共收集6 種不同植物來(lái)源的蜂蜜，具體信息見(jiàn)表1。所有蜂蜜樣品避光保存在-20℃冰箱直至分析。

表1 蜂蜜樣品的采集信息

S.aureusATCC 29213、E.coliATCC 25922（上海北諾生物科技有限公司），沒(méi)食子酸、福林酚（上海麥克林生化科技有限公司），無(wú)水碳酸鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、碘化鉀、乙酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DPPH（Sigma 公司），總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP 法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），過(guò)氧化氫定量分析試劑盒（水兼容性）、LB 肉湯培養(yǎng)基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，營(yíng)養(yǎng)瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

手持式折射儀（北京萬(wàn)成北增精密儀器有限公司，WZ-116ATC），pH 計(jì)［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，EL20］，島津分光光度計(jì)（日本島津有限公司，UV-2550），全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司，Model 550），氣浴恒溫振蕩器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，THZ-92A）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基本理化指標(biāo)

在室溫下，用手持式折射儀測(cè)定蜂蜜樣品的含水量。準(zhǔn)確稱取20.0g 蜂蜜樣品并用蒸餾水定容至100mL，在20℃用電導(dǎo)儀測(cè)定其電導(dǎo)率，結(jié)果用 μS/cm表示[18]。準(zhǔn)確稱取10.0g 蜂蜜樣品，溶解在75mL 蒸餾水中，在25℃用pH 計(jì)測(cè)定樣品的pH 值[19]。采用分光光度法測(cè)定蜂蜜中淀粉酶活性，將淀粉溶液和蜂蜜緩沖溶液在40℃水浴，淀粉酶活性表示為1g 蜂蜜在1h內(nèi)水解1%淀粉的毫升數(shù)，單位用mL/(g·h)表示[20]。蜂蜜中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考Zhang 的方法[21]，用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 總酚含量

采用福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法[22]測(cè)定蜂蜜總酚含量。取0.5mL 蜂蜜溶液（0.2g/mL）與2.5mL 福林酚試劑（0.2mol/L）混勻靜置5 min，然后加入2mL 的Na2CO3溶液（0.1g/mL）并定容至10mL，避光靜置反應(yīng)2h 后，在波長(zhǎng)725nm 處測(cè)定吸光度值。以蒸餾水為空白對(duì)照，以沒(méi)食子酸含量（0.04～0.24mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為每100g 蜂蜜中沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量（mg GAE/100g）。

1.3.3 抗氧化能力測(cè)定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

參考Turkmen[23]的方法，并做適當(dāng)修改。將100μL 蜂蜜樣品溶液（0.2g/mL）與100μL DPPH 乙醇溶液（0.08mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用）混合均勻，室溫下避光反應(yīng) 30min，于 517nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以維生素C 濃度（5～50μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為mg Vc/100g。

1.3.3.2 ABTS+·自由基清除能力測(cè)定

將7.5mL 7mmol/L ABTS 溶液和132μL 140mmol/L 過(guò)硫酸鉀溶液室溫避光反應(yīng)16h，制得ABTS 母液。在使用前，把ABTS 母液用蒸餾水稀釋成ABTS 工作液（要求ABTS 工作液吸光度減去相應(yīng)的蒸餾水空白對(duì)照后，A734 為0.7±0.05）。取5μL 蜂蜜樣品溶液（0.2g/mL）加入200μL ABTS 工作液，空白對(duì)照加入5μL 蒸餾水。室溫避光孵育6min 后測(cè)定734nm 處的吸光度值。以Trolox 溶液（0.1～1.3mM）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為每kg蜂蜜中Trolox 當(dāng)量（mmol Trolox/kg）。

1.3.3.3 鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）的測(cè)定

采用總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP 法）檢測(cè)蜂蜜抗氧化能力。5μL 0.2g/mL 蜂蜜溶液中加入180μL FRAP 工作液，37℃孵育5min 后，在593nm測(cè)定吸光度。以Trolox 溶液（0.05～1.3mM）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表示為每kg蜂蜜中Trolox 當(dāng)量（mmol Trolox/kg）。

1.3.4 抑菌能力測(cè)定

1.3.4.1 瓊脂擴(kuò)散法

參考Zhang[12]的方法并適當(dāng)修改。用滅菌的蒸餾水稀釋蜂蜜樣品至50%（w/v）。將25mL 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基鋪于75mm 的培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，使用LB 肉湯培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×106CFU/mL，每培養(yǎng)板涂布100μL 稀釋后的菌液。使用打孔器于培養(yǎng)基上均勻打四個(gè)孔（直徑為8mm），然后在孔中加入150μL 待測(cè)蜂蜜稀釋液或陰性對(duì)照（無(wú)菌水）、陽(yáng)性對(duì)照（10%苯酚溶液），并將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中正置37℃培養(yǎng)18h，最后使用游標(biāo)卡尺以十字交叉法測(cè)量抑菌圈的直徑（mm）。

1.3.4.2 肉湯稀釋法

采用肉湯稀釋法測(cè)定蜂蜜樣品的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[12,24]。

用LB 肉湯培養(yǎng)基配置不同濃度的蜂蜜樣品（50%、25%、20%、12.5%、10%、6.25%、5%、3.125%、2.5%、1.25%），并將菌液稀釋至1×106CFU/mL。被測(cè)蜂蜜溶液和菌液按9∶1 的比例混合，100μL 混合液體加入96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板（空白組以培養(yǎng)基代替蜂蜜溶液），并在600nm 處測(cè)定吸光度，記為T0。然后將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)24h，取出測(cè)其600nm 處的數(shù)值記為T18。細(xì)菌的抑制率公式為:抑制率/%=1-(實(shí)驗(yàn)組T24-實(shí)驗(yàn)組T0)/ (空白組T24-空白組T0) ×100%。

取MIC 試驗(yàn)中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的20μL 懸液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，37℃孵育24h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MBC。

1.3.5 過(guò)氧化氫含量測(cè)定

參考zhang[12]的方法，配置50%（w/v）的蜂蜜溶液用過(guò)氧化氫定量分析試劑盒（水兼容性）測(cè)定蜂蜜中過(guò)氧化氫的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有蜂蜜樣品均測(cè)定3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。采用Tukey 檢驗(yàn)法分析各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性（p ＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本理化指標(biāo)分析

表2 顯示6 種蜂蜜的基本理化指標(biāo)。含水量是蜂蜜質(zhì)量中的一個(gè)重要參數(shù)，與蜂蜜的發(fā)酵、成熟度和結(jié)晶有關(guān)[25,26]。本研究中蜂蜜的含水量為15.93%～19.50%，均符合歐盟[27]和食品法典委員會(huì)[28]的規(guī)定（＜20%）。蜂蜜的pH 值影響其口感、穩(wěn)定性和保質(zhì)期[29]。本研究中蜂蜜的pH 值為3.66～4.62。從表2 可以看出，神農(nóng)架蜂蜜具有最高的pH 值（4.62±0.01）。蜂蜜的電導(dǎo)率與灰分和酸度相關(guān)[29]。除神農(nóng)架蜂蜜外，本研究中其他蜂蜜的電導(dǎo)率均符合標(biāo)準(zhǔn)[27,28]規(guī)定的蜂蜜的電導(dǎo)率不超過(guò)0.8mS/cm。試驗(yàn)測(cè)得6 種蜂蜜的總蛋白含量為4.06～6.65mg/g，其中蒲公英蜜的總蛋白含量顯著高于其他5 種蜂蜜（p＜0.05）。蜂蜜的總蛋白含量主要與蜂蜜的釀造時(shí)間和釀造程度有關(guān)[30]。淀粉酶常被用來(lái)表征蜂蜜的新鮮度及加工程度[31]。本研究中6 種蜂蜜的淀粉酶值為13.55～37.07mL/(g·h)，均達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[27,28]規(guī)定的不低于8mL/(g·h)。沙棗蜜的淀粉酶活性顯著高于其他5 種蜂蜜（p＜0.05）。

表2 蜂蜜樣品的基本理化指標(biāo)

2.2 總酚含量及抗氧化能力分析

研究表明蜂蜜的總酚含量與其抗氧化能力明顯相關(guān)[32]。6 種蜂蜜的總酚含量和抗氧化能力見(jiàn)表3。本研究中所有蜂蜜樣品的總酚含量為128.64～360.40mg GAE/kg，其中神農(nóng)架蜂蜜的總酚含量（360.40±6.36mgGAE/kg）顯著高于其他5 種蜂蜜。不同種類的蜂蜜的總酚含量具有明顯差異，這主要與蜜蜂采集的蜜源植物有關(guān)[15]。DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力和FRAP 總抗氧化活性是3 種常用來(lái)評(píng)估蜂蜜體外抗氧化能力的方法，且這3 種方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好[32,33]。DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)表明神農(nóng)架蜂蜜具有最高的抗氧化活性（13.14mg Vc/100g），其次是蘋果蜜（10.45mg Vc/100g）。6 種蜂蜜對(duì)ABTS+·自由基的清除能力最高的是神農(nóng)架蜂蜜，蘋果蜜的抗氧化能力顯著高于狼牙刺蜜和石榴蜜。FRAP 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果顯示神農(nóng)架蜂蜜的抗氧化能力最高（0.92±0.07mmol Trolox/kg），其次是蘋果蜜（0.78±0.04mmol Trolox/kg）和蒲公英蜜（0.33±0.01mmol Trolox/kg）。3 種抗氧化能力評(píng)價(jià)方法得出的結(jié)果基本一致，即神農(nóng)架蜂蜜的抗氧化活性最好，蘋果蜜次之。

表3 蜂蜜樣品的總酚含量以及抗氧化活性

2.3 抑菌活性及過(guò)氧化氫含量分析

我們采用瓊脂擴(kuò)散法和肉湯稀釋法來(lái)評(píng)價(jià)蜂蜜對(duì)S.aureus和E.coli的抑菌能力并且測(cè)定了蜂蜜中過(guò)氧化氫的含量。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（表4）表明所有蜂蜜樣品均未對(duì)E.coli產(chǎn)生抑菌圈，而對(duì)S.aureus都產(chǎn)生了超過(guò)11mm 的抑菌圈。Zhang 等[12]研究結(jié)果同樣表明9 種單花蜜均未對(duì)E.coli產(chǎn)生抑菌圈，對(duì)S.aureus則均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，造成這種差異的原因可能是由于兩種細(xì)菌細(xì)胞壁的組成不同。不同植物源蜂蜜對(duì)S.aureus的抑菌能力不同，蘋果蜜（16.87±0.80 mm）和神農(nóng)架蜂蜜（16.31±0.74mm）產(chǎn)生的抑菌圈顯著高于其他4 種蜂蜜（p＜0.05），沙棗蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜抑菌圈無(wú)顯著差異，產(chǎn)生最小抑菌圈的則是蒲公英蜜（11.08±0.21mm）。6 種蜂蜜的H2O2含量為159.10～482.28μmol/g，沙棗蜜（482.28±25.56μmol/g）的過(guò)氧化氫含量顯著高于其他蜂蜜（p＜0.05），其次是神農(nóng)架蜂蜜（388.16±8.73μmol/g），而蒲公英蜜、蘋果蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜差異不顯著。我們研究中沙棗蜜的H2O2含量最高，但是其抑菌能力卻并不是最好的，類似的蘋果蜜的抑菌活性最高，但是其H2O2含量卻并不高。Bucekova 等[34]研究同樣表明在某些情況下，蜂蜜樣品表現(xiàn)出高抗菌活性，同時(shí)生成低水平的H2O2，反之亦然。雖然H2O2是蜂蜜的主要抑菌成分，但是總的抑菌效果還受滲透壓、酸度、pH、多酚、黃酮、抗菌肽、王漿主蛋白等因素的影響[11]。由于蜂蜜的成分復(fù)雜，各成分的抑菌效果及其相互的作用機(jī)制目前還不清楚[35]。

表4 蜂蜜樣品的抑菌活性和過(guò)氧化氫含量

肉湯稀釋法（表5）結(jié)果表明蘋果蜜對(duì)S.aureus的MIC（MIC50：0～1.25% w/v，MIC90：3.125%～5% w/v）和MBC（3.125%～5% w/v）最低，而石榴蜜相比其他蜂蜜對(duì)于E.coli的MIC（MIC50：2.5%～3.125% w/v，MIC90：12.5%～20% w/v）最低。MIC 和MBC 結(jié)果表明蜂蜜對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果比革蘭氏陰性菌更好，這與Goslinski 研究的結(jié)論一致[36]。

表5 蜂蜜樣品對(duì)S.aureus和E.coli的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 結(jié)論

本研究收集國(guó)產(chǎn)6 種特色蜂蜜，并對(duì)其基本理化指標(biāo)、抗氧化和抑菌活性進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果表明，不同植物來(lái)源的蜂蜜的抗氧化和抑菌活性有明顯差異，蜂蜜的抗氧化活性與總酚含量有關(guān)，其中神農(nóng)架蜂蜜的總酚含量和抗氧化活性最高，蘋果蜜對(duì)S.aureus的MIC（MIC50：0～1.25% w/v，MIC90：3.125%～5%w/v）和MBC（3.125%～5% w/v）最低，而石榴蜜對(duì)E.coli的MIC（MIC50：2.5%～3.125% w/v，MIC90：12.5%～20% w/v）最低。對(duì)不同植物來(lái)源蜂蜜的品質(zhì)和活性評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)特色蜂蜜奠定良好基礎(chǔ)。