王遂林 賴康 任明顯 黃枳腱 王順海 水碧波 唐承建 舒長斌 王斌 楊明顯 │文

1 四川省蜂業(yè)管理站，成都 610041；2 馬爾康市農(nóng)業(yè)畜牧局，624000；3 青川縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，628100；4 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，成都611130

一、引言

在蜜蜂種質(zhì)資源評(píng)價(jià)工作中，需要對(duì)蜜蜂的形態(tài)特征進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，主要測(cè)定工蜂的喙長、翅長寬等長度指標(biāo)，翅脈角等角度指標(biāo)，及蜂王體色、背板、上唇等色度指標(biāo)[1]。按照第三次全國畜禽遺傳資源普查蜜蜂形態(tài)特征測(cè)定要求[2]，需對(duì)各蜜蜂種質(zhì)資源“三型蜂”個(gè)體和工蜂的吻、背板、腹板、翅、足等解剖器官進(jìn)行高清拍照，利用測(cè)量軟件對(duì)長度、角度等指標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定，根據(jù)色型圖譜完成色度指標(biāo)比對(duì)。

當(dāng)前，三型蜂個(gè)體拍攝，一般采用“微距+修圖”方式獲得符合要求的照片，必須具備高超級(jí)技術(shù)的專業(yè)攝影師才能完成，該方法不僅對(duì)拍攝技術(shù)要求高，而且耗時(shí)費(fèi)力，且圖片自然度較差。而在國內(nèi)蜜蜂育種和保種工作中，均采用微小形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)對(duì)蜜蜂進(jìn)行形態(tài)特征拍照和測(cè)定[3,4]。該軟件系統(tǒng)有進(jìn)口和國產(chǎn)兩種，主要存在價(jià)格高昂、系統(tǒng)穩(wěn)定性不高、照片清晰度差、系統(tǒng)更新無保障等問題。

為了提高蜜蜂保種、育種、精準(zhǔn)鑒定等工作的效率，我們團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)將工業(yè)CCD 相機(jī)配合顯微鏡用于蜜蜂拍照，獲得清晰度更高的蜜蜂個(gè)體和器官照片，將在特定標(biāo)尺下拍攝的照片導(dǎo)入Digimizer 測(cè)量軟件，便可對(duì)蜜蜂形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)量。經(jīng)過實(shí)際應(yīng)用，不斷探索、優(yōu)化操作技巧，形成較為規(guī)范的操作流程和方法。該方法不僅保證蜜蜂形態(tài)特征拍照和測(cè)定的精準(zhǔn)度更高，而且操作簡(jiǎn)便、成本更低、效率更高。本文將對(duì)CCD 相機(jī)、Digimizer 測(cè)量軟件的使用及蜜蜂形態(tài)特征拍照和測(cè)定的方法進(jìn)行全面介紹。

二、硬件與軟件參數(shù)介紹

1.CCD相機(jī)與顯微鏡

CCD 相機(jī)2000 萬像素以上，0.25×-0.7×目鏡，0.7×-4.5×連續(xù)變焦物鏡，大底座調(diào)焦大支架，Type-c接口線，LED 可調(diào)光源，HDMI 數(shù)據(jù)線，U 盤或TF 卡、顯示器連接組裝（圖1～3）。

圖1 設(shè)備組合示意圖

圖2 簡(jiǎn)易顯微裝置

圖3 CCD相機(jī)

2.Digimizer軟件

Digimizer 軟件是一款專業(yè)的圖像測(cè)量工具，支持JPG、GIF、TIFF、BMP、PNG、WMF 和EMF 等多種格式圖片，支持對(duì)圖像的長度、角度、面積等進(jìn)行手工精確測(cè)量。該軟件測(cè)量原理：通過測(cè)定圖片像素點(diǎn)的數(shù)量長度，與標(biāo)尺像素點(diǎn)數(shù)進(jìn)行換算，得到物體的實(shí)際長度。因此，在同一倍數(shù)下拍攝的照片，不會(huì)因照片的放大或縮小影響測(cè)定結(jié)果。該軟件有中文版和英文版，主要功能基本相同。

三、操作流程與方法

1.蜜蜂個(gè)體拍照方法

（1）拍照前準(zhǔn)備

抓取與處理蜜蜂：用王籠分別抓取蜂王、工蜂、雄蜂，并單獨(dú)關(guān)放，工蜂、雄蜂可抓多只。常溫低于20℃時(shí)，可將蜜蜂放置在陰涼處靜置8～10 分鐘；常溫高于20℃時(shí)，需將蜜蜂放冰箱或用冰袋冷凍3～5 分鐘，冷凍過程中注意避免水汽打濕蜜蜂身體。當(dāng)蜜蜂趨于平靜、行動(dòng)遲緩后用于拍照。

調(diào)試顯微拍照設(shè)備：用死蜂或蜜蜂大小相當(dāng)?shù)奈锛鳛閰⒄?，通過顯示屏觀察調(diào)節(jié)好放大倍數(shù)和焦距等參數(shù)，使蜜蜂個(gè)體全部呈現(xiàn)在顯示器屏幕內(nèi)。

麻醉蜜蜂：若蜜蜂冷凍處理效果不好，可再使用純度90%的CO2以10～15 個(gè)/秒的氣泡速度通過洗氣瓶對(duì)蜜蜂進(jìn)行麻醉，一般麻醉時(shí)間控制在5 秒左右，麻醉時(shí)間過長容易將蜜蜂熏死，如蜜蜂蘇醒后仍比較活躍，可進(jìn)行重復(fù)麻醉。

（2）拍攝照片

此過程兩人配合操作，即一人將麻醉并能保持穩(wěn)定的蜜蜂放置到顯微鏡下，微調(diào)顯微鏡至屏幕顯示畫面清晰，待蜜蜂半蘇醒后，用鑷子或小毛刷輕觸調(diào)整蜜蜂的足、翅、腹部等以便蜜蜂達(dá)到良好拍照姿態(tài)，另一人通過屏幕觀察并控制CCD 進(jìn)行抓拍，即可獲得蜜蜂高清照片（圖4）。

圖4 三型蜂顯微拍照俯視圖

2.蜜蜂形態(tài)特征拍照與測(cè)定方法

（1）測(cè)定器官制片

按照Ruttner 于1988 年提出的蜜蜂形態(tài)指標(biāo)[5]進(jìn)行解剖制片（圖5），此過程可采用流水作業(yè)的方式，不同人負(fù)責(zé)解剖不同器官，效率更高。

圖5 蜜蜂器官解剖制片

（2）采集圖像

將制片和顯微標(biāo)尺放在顯微鏡下調(diào)節(jié)視野大小及清晰度，當(dāng)兩者在同一鏡頭下都足夠清晰時(shí)，拍下標(biāo)尺高清照（圖6），然后將對(duì)應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行逐一拍照采集。根據(jù)不同器官拍照時(shí)需放大倍數(shù)的不同，將各器官分為三類設(shè)定標(biāo)尺進(jìn)行拍照，第一類為吻、右前翅、后足、第二三四背板；第二類為第四六腹板；第三類為第五背板覆毛等；另外測(cè)定色度指標(biāo)的器官，拍照時(shí)不需設(shè)定標(biāo)尺，但必須將圖片清晰度調(diào)至最佳。

圖6 采集的標(biāo)尺和器官高清照片

（3）測(cè)量方法

軟件使用方法：電腦下載安裝Digimizer 軟件（中文或英文版均可），打開運(yùn)行軟件，通過文件選項(xiàng)打開圖像→調(diào)節(jié)圖像比例→選擇測(cè)量工具（長度、角度等）并測(cè)量→獲取指標(biāo)數(shù)據(jù)（圖7）。

圖7 軟件使用說明

數(shù)據(jù)處理方法：

長度指標(biāo)：用Digimizer 軟件對(duì)同一鏡下拍攝的標(biāo)尺和器官照片逐一打開，調(diào)整圖片至合適比例，用長度工具進(jìn)行測(cè)量，獲得對(duì)應(yīng)像素點(diǎn)數(shù)值，再通過Excel 轉(zhuǎn)換即可得到測(cè)量指標(biāo)對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)。

角度指標(biāo)：針對(duì)翅膀翅脈角的測(cè)量，使用Digimizer軟件翅照片打開，放大至合適倍數(shù)，直接用角度工具測(cè)量即可得到對(duì)應(yīng)角度，Excel 導(dǎo)出即可（圖8）。

圖8 翅脈角測(cè)量結(jié)果

測(cè)量結(jié)果精準(zhǔn)性對(duì)比研究：分別用該方法和蜜蜂微小形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)測(cè)量200 個(gè)吻長指標(biāo)和O26 角度指標(biāo)，結(jié)果使用SPSS（19.0）軟件進(jìn)行對(duì)比分析差異不顯著（P＞0.05）（圖9），說明使用該方法測(cè)定數(shù)據(jù)精準(zhǔn)可靠。

圖9 該方法測(cè)得長度和角度指標(biāo)對(duì)比

3.封蓋子脾拍照與數(shù)量測(cè)定方法

（1）封蓋子脾拍照：將蜂群子脾提起，抖落工蜂后，在脾面放置參照物，并使用手機(jī)或數(shù)碼相機(jī)與脾面保持水平進(jìn)行高清拍照，獲得待測(cè)照片，并按群號(hào)分別存檔待測(cè)，每11 天拍照一次。

（2）參照物對(duì)應(yīng)巢房孔數(shù)：將參照物放置多張不同巢脾子脾區(qū)域數(shù)對(duì)應(yīng)巢房孔數(shù)，然后對(duì)收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，即可作為參照物對(duì)應(yīng)巢房孔數(shù)。

（3）使用Digimizer 軟件“區(qū)域面積”工具對(duì)巢脾封蓋子和參照物進(jìn)行面積測(cè)定，獲得區(qū)域面積數(shù)據(jù)（圖10）。用“封蓋子脾面積/參照物面積×參照物對(duì)應(yīng)巢房孔”，即可得到封蓋子數(shù)量。

圖10 利用面積法測(cè)定封蓋子數(shù)

（4）測(cè)量時(shí)要注意，如脾面出現(xiàn)部分未封蓋或空巢房，需在測(cè)量封蓋子區(qū)域面積時(shí)人為判斷插空取舍。

四、該方法的優(yōu)點(diǎn)

1.成本低

CCD 相機(jī)與配套的測(cè)量軟件的價(jià)格不到現(xiàn)有蜜蜂微小形態(tài)測(cè)定系統(tǒng)的5%，節(jié)約費(fèi)用95%以上。

2.穩(wěn)定性高

CCD 相機(jī)、Digimizer 軟件已經(jīng)長期、廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，在圖像采集過程中CCD 運(yùn)行穩(wěn)定，指標(biāo)測(cè)量時(shí)軟件操作便捷，不會(huì)出現(xiàn)卡頓、死機(jī)等現(xiàn)象。

3.圖片清晰度高

CCD 相機(jī)像素高，在顯微鏡輔助下可以使蜜蜂的絨毛放大倍數(shù)更大，使蠟鏡等邊界模糊的器官更加高清，降低了測(cè)定起始點(diǎn)選點(diǎn)難度，提高了測(cè)定精度。

4.封蓋子計(jì)數(shù)更高效

該方法估算標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)一致，雖仍需要人為估計(jì)子脾邊界，但與純粹人為計(jì)數(shù)方式相比，該方法不用邊數(shù)邊記，視覺疲勞程度低，數(shù)據(jù)可自動(dòng)保存和導(dǎo)出，更加準(zhǔn)確、高效。

5.測(cè)定效率更高

Digimizer 軟件的安裝非常方便，可對(duì)CCD 相機(jī)、普通相機(jī)、手機(jī)拍攝的不同格式照片進(jìn)行導(dǎo)入測(cè)量。在任意電腦上安裝Digimizer 軟件后，多人同時(shí)進(jìn)行測(cè)量，極大提高了工作效率。

6.數(shù)據(jù)存檔更便捷

該方法可將測(cè)定數(shù)據(jù)同時(shí)以圖片數(shù)據(jù)和Excel 數(shù)據(jù)同時(shí)導(dǎo)出保存，便于后期查詢、使用。