周艷飛 劉佳強(qiáng) 彭 俊 肖鵬程 張躍軍

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，株洲 412007）

梅毒是由蒼白密螺旋體（Treponema pallidum，Tp）感染引起的一種性傳播疾病。Tp感染生殖系統(tǒng)黏膜后可經(jīng)血液和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至全身，導(dǎo)致多器官慢性損傷［1］。Tp感染早期，機(jī)體主要以單核-巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞為主的固有免疫應(yīng)答發(fā)揮作用［2］。Tp缺乏明顯的毒力因子編碼基因，如革蘭氏陰性菌常見的內(nèi)毒素、Ⅲ型分泌系統(tǒng)、熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）等細(xì)胞毒力因子。課題組前期研究表明，外膜蛋白是Tp重要的毒力因子，是Tp感染后免疫病理損傷的重要物質(zhì)［3-4］。Tp0971是課題組前期證實(shí)的一種具有促炎活性的膜蛋白，體外研究表明，Tp0971經(jīng)TLR2識 別后可 激 活MAPKs和NF-κB誘 導(dǎo)巨噬 細(xì)胞分 泌TNF-α和IL-1β［5］。但Tp0971是否有其他促炎機(jī)制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)表觀遺傳學(xué)機(jī)制在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，其中乙?；揎検亲畛Ｒ姷谋碛^遺傳學(xué)機(jī)制，組蛋白乙?；罂梢鹑旧w結(jié)構(gòu)松弛，從而有利于各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合而誘導(dǎo)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；瘡V泛參與調(diào)控細(xì)胞因子和某些趨化因子表達(dá)，且課題組前期研究表明，Tp0971可激活NF-κB［6-7］，但在Tp外膜蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌過程中是否也具有類似作用尚不明確。因此本研究旨在研究膜蛋白Tp0971對誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-8及GM-CSF的影響，并探討組蛋白乙?；瘷C(jī)制的作用。

1 材料與方法

1.1 材料Tp0971為課題組前期表達(dá)純化并進(jìn)行去內(nèi)毒素處理［7］；MAPK抑制劑SP-600125、U0126和SB-203580購 自 德 國Calbiochem；IL-8和GM-CSF ELISA試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司；TrichostatinA（TSA）購自英國Biomol；HDAC1（H-51）和HDAC2（H-54）多克隆抗體購自Santa Cruz；抗乙?；疕3和H4購自美國Life；組蛋白活性試劑盒購自Abnova；TRIzol試劑購自Invitrogen；cDNA試劑盒購自Bio-Rad；SensiFAST SYBR No-Rox Mix試劑盒購自Bioline；HDAC Fluorometric Assay Kit購自Abnova；DNA提取試劑盒購自Qiagen公司；其他試劑購自Sigma-Adrich或上海生物工程有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與Tp0971處理 人單核細(xì)胞系THP-1采用含10%胎牛血清及抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基接種至6孔板培養(yǎng)，生長至70%密度時，參考文獻(xiàn)［5］加入PMA（160 nmol/L）孵育48 h誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康募尤氩煌瑵舛萒p0971刺激后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ELISA檢 測IL-8和GM-CSF分 泌Tp0971刺激結(jié)束后取培養(yǎng)上清，采用雙抗體夾心ELISA測定上清IL-8和GM-CSF濃度，按照試劑盒說明操作。所有樣品設(shè)3個復(fù)孔，所用IL-8和GM-CSF試劑盒檢測下限分別為7 pg/ml和4 pg/ml。

1.2.3 qRT-PCR檢測GM-CSF mRNA表達(dá) 預(yù)冷PBS漂洗細(xì)胞后，加入1 ml TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SensiFAST SYBR No-Rox Mix試劑盒進(jìn)行qPCR反應(yīng)。正向引物：5'-GGCGTCTCCTGAACCTGAGT-3'；反 向 引 物：5'-GGGGAT‐GACAAGCAGAAAGT-3'，內(nèi)參β‐actin正向引物：5'-GACAGGATGCAGAAGGA-3'；反向引物：5'-TGATC‐CACATCTGCTGGAA-3'，2?ΔΔCt計算相對表達(dá)［8］。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)Tp0971孵育結(jié)束后，無菌PBS洗滌2次，加入100 μl RIPA裂解液并用細(xì)胞刮將其轉(zhuǎn)移至離心管，快速漩渦振蕩30 s，冰上靜置30 min，加入等體積上樣緩沖液煮沸5 min，取20 μl蛋白用于SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%BSA室溫封閉2 h，加入相應(yīng)蛋白抗體4℃孵育過夜，PBST緩沖液洗滌后孵育二抗，化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.2.5 組蛋白分離與檢測 處理結(jié)束的巨噬細(xì)胞用預(yù)冷PBS漂洗2次（含100 mmol/L NaF、2 mmol/L Na3VO4和15 mmol/L Na4P2O7），加入800μl裂解緩沖液［含10 mmol/L HEPES（pH=7.9）、1.5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L KCl、1.5 mmol/L PMSF和0.5 mmol/L DTT］后將其刮入EP管，加入0.2 mol/L H2SO4，冰上靜置60 min。離心取上清，加入終濃度為20%的三氯乙酸4℃孵育45 min，離心取沉淀，1 ml丙酮洗滌2次，采用含100 mmol/L NaF、2 mmol/L Na3VO4以 及15 mmol/L Na4P2O7的PBS重懸，用于Western blot分析。

1.2.6 組蛋白活性分析 采用HDAC Fluorometric Assay Kit測定組蛋白去乙?；富钚?。試劑盒分別提供了熒光團(tuán)或顯色團(tuán)標(biāo)記的底物，經(jīng)樣本內(nèi)HDAC酶去乙酰化后被激活，隨后與賴氨酸顯色劑作用產(chǎn)生熒光，熒光酶標(biāo)儀測定其強(qiáng)度。按試劑盒說明操作，結(jié)果以相對光單位（relative light unit，RLU）表示。

1.2.7 染色質(zhì)共沉淀分析 細(xì)胞處理結(jié)束后棄培養(yǎng)基，1%甲醛固定1 min，預(yù)冷PBS（含0.125 mol/L甘氨酸）漂洗2次。加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞［含10 mmol/L Tris（pH=7.5）、150 mmol/L NaCl、1%Non‐idet P-40、1%脫氧膽酸、0.1%SDS、1 mmol/L EDTA和1%Aprotinin］超聲處理，離心取上清，加入蛋白A/G瓊脂糖珠孵育60 min獲取免疫復(fù)合物，RIPA緩沖液和高鹽緩沖液［2 mol/L NaCl、10 mmol/L Tris（pH=7.5）、1%Nonidet P-40、0.5%脫氧膽酸、1 mmol/L EDTA］洗滌，加入洗脫緩沖液37℃、1 200 r/min振蕩洗滌15 min，RNA酶37℃孵育30 min，依次用蛋白酶K于37℃和65℃消化6 h，提取DNA，采用PCR擴(kuò)增IL-8啟動子DNA。正向引物：5'-AAGAAAACTTTCGTCATACTCCG-3'；反向引物：5'-TGGCTTTTTATATCATCACCCTAC-3'。PCR反應(yīng) 條件：95℃預(yù)變性15 min，35個循環(huán)：94℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，72℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后拍照、顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。組間比較采用方差分析后行Tukey's Post Hoc檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tp0971誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)48 h分化為巨噬細(xì)胞（約5×105個），加入Tp0971刺激，ELISA結(jié)果顯示，10μg/ml Tp0971處理巨噬細(xì)胞24 h后可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞大量分泌GM-CSF，且GM-CSF分泌呈一定時間依賴性（圖1A），10 μg/ml Tp0971處理6 h即可誘導(dǎo)其分泌，并持續(xù)至24 h（圖1B）。qPCR結(jié)果也顯示，0.1~10 μg/ml Tp0971也能上調(diào)其mRNA表達(dá)（圖1C）。

圖1 Tp0971以劑量和時間依賴方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌GM-CSFFig.1 Tp0971 induced a time-and dose-dependent GMCSF expression and transcription in macrophages

2.2 Tp0971經(jīng)ERK1/2和p38誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-8和GM-CSF為研究MAPKs是否參與IL-8和GM-CSF分泌，巨噬細(xì)胞先與20μmol/L MAPKs抑制劑預(yù)處理30 min，隨后用Tp0971孵育24 h，結(jié)果顯示，ERK1/2抑制劑U0126和p38抑制劑SB-203580均能顯著抑制IL-8和GM-CSF分泌，而SP-600125對兩者分泌無明顯影響（圖2）。

圖2 ERK和p38抑制劑抑制Tp0971誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-8和GM-CSFFig.2 ERK and p38 inhibitors decrease Tp0971-induced macrophages secretion of IL-8 and GM-CSF

2.3 NF-κB參與Tp0971誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-8和GM-CSF而IL-8和GM-CSF基因啟動子上游存在NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，為證實(shí)NF-κB與IL-8和GM-CSF分泌的關(guān)系，采用20 μmol/L NF-κB抑制劑IKKNBD預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min，結(jié)果顯示，抑制NF-κB后IL-8和GM-CSF分泌水平顯著降低（圖3）。

圖3 NF-κB抑制劑抑制Tp0971誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-8和GM-CSF分泌Fig.3 NF-κB inhibitor decrease Tp0971-induced macro?phages secretion of IL-8 and GM-CSF

2.4 Tp0971誘導(dǎo)H3和H4組蛋白乙酰化Western blot結(jié)果顯示，Tp0971處理巨噬細(xì)胞2 h可顯著上調(diào)乙酰化H3和H4表達(dá)（圖4A）。采用染色質(zhì)共沉淀檢測H3和H4與IL-8啟動子的結(jié)合情況，結(jié)果顯示，Tp0971可顯著促進(jìn)乙?；疕3和H4結(jié)合至IL-8啟動子（圖4B）。采用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA預(yù)處理細(xì)胞后，ELISA結(jié)果顯示，IL-8分泌顯著增加（圖4C）。

圖4 Tp0971增強(qiáng)乙?；疕3和H4表達(dá)并結(jié)合至IL-8啟動子區(qū)誘導(dǎo)其表達(dá)Fig.4 Tp0971 enhances histone H3 and H4 acetylation at IL-8 promoter to induce its expression

2.5 Tp0971抑制組蛋白去乙?；副磉_(dá)與活性Western blot結(jié)果顯示，Tp0971處 理后，HDAC1和HDAC2表達(dá)明顯降低（圖5A）。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Tp0971可明顯降低細(xì)胞核內(nèi)HDAC酶活性（圖5B）。

圖5 Tp0971下調(diào)HDAC1和HDAC2表達(dá)及HDAC酶活性Fig.5 Tp0971 reduces HDAC1 and HDAC2 expressions and HDAC activity

3 討論

Tp感染后的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致組織損傷的重要因素［2］。本研究對Tp誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌IL-8和GM-CSF的機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)果表明Tp誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌依賴于絲裂原活化蛋白激酶p38和ERK1/2激活，可能是巨噬細(xì)胞活化的重要機(jī)制，在早期固有免疫應(yīng)答中起重要作用。但本研究也證實(shí)JNK可能并不參與IL-8和GM-CSF釋放，可能與病原體及細(xì)胞不同有關(guān)。如KRüLL等［9］最近報道了肺炎衣原體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF是通過激活ERK1/2和p38介導(dǎo)的，與JNK激酶無關(guān)。此外，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞分泌IL-8和GM-CSF也不依賴于JNK激活［10］。表明Tp誘導(dǎo)的IL-8轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能是不同MAPK通路間復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)所致。

NF-κB是參與病原微生物感染后免疫應(yīng)答的重要核轉(zhuǎn)錄因子。Tp0971可激活NF-κB，本研究證實(shí)采用NF-κB抑制劑處理后，IL-8和GM-CSF分泌顯著減少，表明兩者分泌受NF-κB調(diào)控。最近研究表明，炎癥基因轉(zhuǎn)錄在一定程度上受核小體DNA局部解旋程度調(diào)控，而核小體DNA受組蛋白修飾（如乙?；┱{(diào)控［11］。多數(shù)物種組蛋白H3和H4乙酰化水平提高會導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)更加松散，允許轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶Ⅱ進(jìn)入［12］。越來越多的證據(jù)表明，IL-8表達(dá)受核心組蛋白乙?；揎椪{(diào)控［13］。但對這些機(jī)制在細(xì)菌感染中的作用知之甚少。SCHMECK等［14］首次證明感染單核細(xì)胞增生性李斯特菌后，人內(nèi)皮細(xì)胞IL-8啟動子區(qū)組蛋白發(fā)生改變。本研究也證實(shí)Tp0971在巨噬細(xì)胞的IL-8啟動子處誘導(dǎo)了H3和組蛋白H4乙?；Ｍ瑫r證明Tp0971處理可募集H3和H4結(jié)合至IL-8啟動子，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。

組蛋白低乙酰化和去乙?；謩e導(dǎo)致DNA纏繞收緊和基因轉(zhuǎn)錄降低。組蛋白去乙?；福℉DAC）可抑制組蛋白H3或H4乙?；?，而組蛋白H3或H4對IL-8的轉(zhuǎn)錄非常重要［15］。HDAC抑制劑TSA也證實(shí)IL-8分泌依賴于乙?；SA通過阻止組蛋白去乙?；黠@增加Tp0971誘導(dǎo)的細(xì)胞IL-8產(chǎn)生。本研究還發(fā)現(xiàn)Tp0971可降低巨噬細(xì)胞HDAC1和HDAC2整體表達(dá)和活性，表明Tp0971通過影響巨噬細(xì)胞組蛋白去乙?；鸵阴；胶獯龠M(jìn)細(xì)胞因子分泌。

總之，本研究證實(shí)Tp0971是Tp重要的毒力因子。Tp0971與巨噬細(xì)胞相互作用可激活p38和ERK激酶及NF-κB通路，導(dǎo)致HDAC表達(dá)和活性降低，巨噬細(xì)胞核組蛋白乙?；叭ヒ阴；胶飧淖?，最終促發(fā)炎癥反應(yīng)。