王 漢，黃友華，符林雄，王 樂 (?？谑腥嗣襻t(yī)院骨科中心，海南 ?？?570208)

頸脊髓損傷是世界難治性病癥，呈高發(fā)生率和高致殘率等特點[1-2]。骨質(zhì)疏松癥是頸脊髓損傷的常見并發(fā)癥和主要危險因素[3-4]。因此，急需探討頸脊髓損傷后骨質(zhì)疏松癥(cervical spinal cord injury caused osteoporosis,CSCI-OP)的發(fā)病機制并探索針對性治療方法以避免頸脊髓損傷后發(fā)展為骨質(zhì)疏松癥。微小RNA(microRNA,miRNA)普遍存在于生物體內(nèi)，在結(jié)構(gòu)、功能和進化上具有高度保守性，是調(diào)節(jié)其他功能基因表達的重要分子。miRNA還可以調(diào)控骨質(zhì)疏松癥中間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化[5]，但具體機制的研究尚處于初始階段。miR-27b-3p是一種重要的干細胞分化和細胞凋亡調(diào)節(jié)miRNA，研究已證實miR-27b-3p能通過特異性下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ促進MSCs的成骨分化[6]。然而，miR-27b-3p在CSCI-OP中的調(diào)控作用并不明確。本研究在體外和體內(nèi)研究miR-27b-3p對MSCs成骨分化的調(diào)節(jié)，并通過CSCI-OP大鼠模型驗證miR-27b-3p及其靶基因缺氧誘導(dǎo)因子1α抑制劑(hypoxia-inducible factor 1 α inhibitor,HIF1AN)對成骨分化的影響，并探討其機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

大鼠MSCs(CP-R131細胞)購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM、青霉素、鏈霉素購于美國GIBCO公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于美國Merck Millipore公司。重組大鼠骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP2)購于美國Sigma公司。miR-27b-3p抑制劑(miR-27b-3p inhibitor)及其陰性對照(NC inhibitor)、miR-27b-3p擬似物(miR-27b-3p mimic)及其陰性對照(NC mimic)均購于上海吉瑪公司。HIF1AN過表達質(zhì)粒(HIF1AN-OE)及其陰性對照(NC-OE)構(gòu)建于上海吉瑪公司。茜素紅染色試劑盒購于上海Beyotime公司。Lipofectamine 2000購于美國Thermo Fisher Scientific公司。RIPA裂解緩沖液購于上海Beyotime公司。TRIzol試劑購于美國Thermo Fisher Scientific公司。TransScript和cDNA合成試劑盒購于北京天根生物有限公司。Universal SYBR Green Fast qPCR Mix Kit購于美國ABclonal公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027)購于上海Beyotime公司。GAPDH(#97166)購于美國Cell Signaling Technology公司。HRP偶聯(lián)的親和山羊抗小鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)二抗(SA00001-1)購于美國Protein Tech Group公司。PVDF膜購于美國MedChemExpress公司。Runx2(8486S)的一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。HIF1AN(批號：20210307)、ALP(批號：202107007)、OPN(批號：20211028)的一抗購于北京生工生物公司。60只SD大鼠購于海南藥物研究所有限責任公司(許可證號：SCXK2020-0007)。

1.2 CSCI-OP患者的臨床標本

本研究納入CSCI-OP患者30例作為CSCI-OP組，同時納入健康體檢者50例作為對照組，收集研究對象的外周血標本。經(jīng)統(tǒng)計學分析2組性別、年齡、體質(zhì)量、身高等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。臨床標本的研究經(jīng)我院倫理委員會審批通過(2020-1595LC)，受試者均對本研究知情同意。CSCI-OP組患者納入標準：符合頸脊髓損傷后骨質(zhì)疏松癥的臨床診斷標準；伴不同程度的頸椎節(jié)段疼痛表現(xiàn)；經(jīng)X射線骨密度測定儀檢測頸椎骨密度T-Score≤-2.5 SD；堿性磷酸酶、鈣、磷值經(jīng)生化檢測在正常范圍內(nèi)。排除標準：有內(nèi)分泌疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎等；長期服用糖皮質(zhì)激素、孕激素、雄激素、雌激素、異黃酮、雙膦酸鹽以及降鈣素等影響骨代謝的藥物；患有嚴重神經(jīng)系統(tǒng)、心臟系統(tǒng)或消化系統(tǒng)疾?。谎獕?160/95 mmHg；存在糖尿病史；過敏體質(zhì)以及對雷奈酸鍶等藥物過敏;其他繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥；患有嚴重精神疾病。

1.3 MSCs培養(yǎng)

將MSCs置于含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、含有95%空氣和5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。將匯合率達到70%的對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 成骨分化誘導(dǎo)

在含有10%FBS的完全DMEM培養(yǎng)基中加入BMP2(300 ng/mL)培養(yǎng)MSCs，以誘導(dǎo)MSCs成骨分化，每3 d更換1次培養(yǎng)基。誘導(dǎo)成骨1 d、3 d、7 d后用茜素紅染色檢查基質(zhì)礦化或鈣沉積，通過倒置顯微鏡觀察細胞，并用Western blot檢測成骨分化標志物ALP、OPN、Runx2的表達。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染

從miRBase(http://www.mirbase.org/)獲得成熟的miR-27b-3p序列。當細胞匯合率達到70%時，加入BMP2(300 ng/mL)并聯(lián)合轉(zhuǎn)染10 nmol/L的miR-27b-3p mimic或10 nmol/L的miR-27b-3p inhibitor，并于37 ℃下孵育24 h。

1.6 茜素紅染色

MSCs細胞培養(yǎng)14 d后礦化形成不透明的鈣化結(jié)節(jié)。細胞樣品用PBS洗滌1～2次，95%乙醇固定10 min，再用PBS洗滌1～2次，用0.1%茜素紅溶液染色10 min。最后用PBS沖洗，倒置光學顯微鏡下觀察細胞中的鈣結(jié)節(jié)。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測

使用TargetScan數(shù)據(jù)庫版本7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測miR-27b-3p的靶基因。設(shè)計野生型(WT)和突變型(MUT)HIF1AN 3’-UTR熒光素酶報告載體,使用LipofectamineTM2000將miR-27b-3p mimic或NC mimic與構(gòu)建的WT或MUT熒光素酶報告載體共轉(zhuǎn)染到MSCs細胞中；24 h后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒評估熒光素酶活性。

1.8 定量PCR

誘導(dǎo)MSCs成骨1 d、3 d、7 d后，根據(jù)說明書，使用TRIzol試劑分離總RNA。然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。使用iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)進行定量PCR。miR-27b-3p的序列是5’-UAUGGCUUUCUUUUCCUGUGUG-3’。所用引物為：miR-27b-3p，正向5’-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3’，反向5’-AAAGGTTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3’；HIF1AN，正向5’-GTACTGGTGGCATCACATAGAG-3’，反向5’-CTGATGGGCTTTGAGAGGATATT-3’；GAPDH，正向5’-AGCTTCGGCACATATTTCATCTG-3’，反向5’-CGTTCACTCCCATGACAAACA-3’；U6，正向5’-TTGACTCCACAAAAGGGAAGAAG-3’，反向5’-TCCAGAGGTCTGTTGAATCCG-3’。GAPDH或U6用作內(nèi)部對照。HIF1AN的表達采用2-△△Ct法進行分析。

1.9 CSCI-OP大鼠模型

60只SPF級成年雄性SD大鼠，鼠齡7周，體質(zhì)量(225±11)g，在正常明/暗(12 h/12 h)循環(huán)的溫控室中飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自由進食和飲水。將60只SD大鼠隨機分為Control組、OP組、NC mimic+OP組、miR-27b-3p mimic+OP組、NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP組、HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組，每組10只。其中，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組大鼠使用戊巴比妥鈉(2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g體質(zhì)量，腹腔注射)全身麻醉，經(jīng)尾靜脈注射HIF1AN-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)后行C5～C7椎板切除，以銳刀橫切下暴露該頸段脊髓后止血縫合，每日輔助排尿排便2～3次，每隔3 d尾靜脈同時注射HIF1AN-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)。NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP組大鼠除尾靜脈注射NC-OE(200 nmol/100 g)和miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作與HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組一致。miR-27b-3p mimic+OP組大鼠除尾靜脈只注射miR-27b-3p mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作與HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組一致。NC mimic+OP組大鼠除尾靜脈只注射NC mimic(100 nmol/100 g)外，其余操作與HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組一致。OP組大鼠不進行藥物注射，全身麻醉后行C5～C7椎板切除，其余操作與NC mimic+OP組一致。Control組大鼠使用戊巴比妥鈉(2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g體質(zhì)量，腹腔注射)全身麻醉后僅切開C5～C7椎板對應(yīng)的皮膚，隨后止血縫合。每組大鼠于28 d后行micro-CT分析，隨后進行安樂死并收集股骨組織。所有動物實驗程序均經(jīng)我院倫理委員會批準(2020-031602DW)。

1.10 Western blot分析

收集各組MSCs或研磨后的大鼠股骨組織勻漿，在冰上于RIPA裂解緩沖液中裂解。BCA試劑盒測定蛋白的濃度。使用SDS-PAGE分離50 μg蛋白，隨后轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉，并與抗ALP(1∶600)、抗HIF1AN(1∶800)、抗OPN(1∶500)、抗Runx2(1∶400)的一抗在4 ℃下孵育過夜。用含0.1%Tween20的PBS洗膜3次，每次10 min，并與HRP標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗(1∶2 000)在室溫下孵育2 h。隨后用增強的化學發(fā)光試劑顯色，并使用ImageJ軟件進行分析。

1.11 micro-CT分析

使用Inveon微正電子發(fā)射斷層掃描(PET)/CT儀器(德國西門子)進行骨掃描。用微型CT從股骨頭到股骨髁掃描股骨和股骨頭結(jié)構(gòu)。使用Inveon分析工作站軟件分析并獲得骨體積分數(shù)(BV/TV)。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CSCI-OP患者中miR-27b-3p的表達下調(diào)

與對照組比較，CSCI-OP組外周血中miR-27b-3p的表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

*：與對照組比較，P<0.05

2.2 miR-27b-3p參與MSCs的成骨分化

采用定量PCR檢測成骨相關(guān)基因的mRNA表達，結(jié)果顯示，隨著成骨誘導(dǎo)時間的延長，ALP、Runx2和OPN的mRNA表達逐漸升高(P<0.05)，miR-27b-3p表達逐漸上調(diào)(P<0.05)，見圖2a。成骨誘導(dǎo)7 d后，與NC mimic組相比，轉(zhuǎn)染miR-27b-3p mimic的MSCs中miR-27b-3p表達及ALP、Runx2和OPN mRNA水平顯著增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-27b-3p inhibitor則得到相反的結(jié)果(P<0.05)，見圖2b、c。Western blot進一步證實了miR-27b-3p對ALP、Runx2和OPN蛋白表達的調(diào)控作用(P<0.05)，見圖2d。MSCs過表達miR-27b-3p后，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加(P<0.05)，說明礦化能力增強；MSCs抑制miR-27b-3p后，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量減少(P<0.05)，說明礦化能力下降，見圖2e。

a：定量PCR檢測BMP2誘導(dǎo)MSCs后ALP、Runx2、OPN mRNA水平和miR-27a-3p表達；b、c：定量PCR檢測BMP2處理MSCs的條件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor對miR-27a-3p和ALP、Runx2、OPN mRNA水平的影響；d：Western blot檢測BMP2處理MSCs的條件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor對ALP、Runx2、OPN蛋白表達的影響；e：茜素紅染色檢測BMP2處理MSCs的條件下miR-27b-3p mimic和miR-27b-3p inhibitor對鈣化結(jié)節(jié)的影響 *：與1 d相比，P<0.05；△：與NC inhibitor組相比，P<0.05；#：與NC mimic組相比，P<0.05圖2 miR-27b-3p對BMP2誘導(dǎo)MSCs成骨分化的影響

2.3 HIF1AN是miR-27b-3p在MSCs中的靶基因

構(gòu)建野生型HIF1AN(WT-HIF1AN-3’UTR)和突變型HIF1AN(MUT-HIF1AN-3’UTR)，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，HIF1AN與miR-27b-3p具有多個結(jié)合位點(圖3a)。miR-27b-3p mimic和WT-HIF1AN-3’UTR共轉(zhuǎn)染后MSCs的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-27b-3p mimic和MUT-HIF1AN-3’UTR共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見圖3b。隨后發(fā)現(xiàn)，HIF1AN的mRNA和蛋白水平均受到miR-27b-3p的負調(diào)控(P<0.05)，見圖3c、d。

a：HIF1AN和miR-27b-3p序列的結(jié)合圖；b:雙熒光素酶報告基因檢測HIF1AN和miR-27b-3p直接結(jié)合；c：定量PCR檢測HIF1AN mRNA的表達；d：Western blot檢測HIF1AN蛋白的表達 *：與MUT-HIF1AN-3’UTR相比，P<0.05；△：與NC inhibitor組相比，P<0.05；#：與NC mimic組相比，P<0.05圖3 MSCs中HIF1AN是miR-27b-3p的靶基因

2.4 miR-27b-3p通過HIF1AN調(diào)控MSCs的成骨分化

為進一步探究miR-27b-3p和HIF1AN在調(diào)節(jié)MSCs成骨過程中的作用，本研究使用HIF1AN-OE進行挽救實驗。結(jié)果顯示，與NC-OE+miR-27b-3p mimic組比較，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic組中HIF1AN的蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，但miR-27b-3p的表達變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4a～c。與NC-OE+miR-27b-3p mimic組比較，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic組中ALP、Runx2和OPN蛋白水平降低(均P<0.05)，見圖4b、d。與miR-27b-3p mimic組比較，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic組的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少(P<0.05)，見圖4e、f。

a：定量PCR檢測HIF1AN過表達聯(lián)合miR-27b-3p mimic對miR-27a-3p表達的影響；b～d：Western blot檢測HIF1AN過表達聯(lián)合miR-27b-3p mimic對MSCs中HIF1AN和ALP、Runx2、OPN表達水平的影響；e、f：茜素紅染色檢測HIF1AN過表達聯(lián)合miR-27b-3p mimic對MSCs中鈣化結(jié)節(jié)的影響 *：與miR-27b-3p mimic組相比，P<0.05；#：與NC-OE+miR-27b-3p mimic組相比，P<0.05圖4 miR-27b-3p通過HIF1AN調(diào)控MSCs的成骨分化

2.5 miR-27b-3p通過HIF1AN調(diào)控CSCI-OP大鼠的成骨分化

與Control組比較，OP組大鼠股骨組織中ALP、Runx2和OPN蛋白表達降低，且BV/TV明顯降低，而HIF1AN上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與NC mimic+OP組比較，miR-27b-3p mimic+OP組中ALP、Runx2和OPN蛋白表達明顯增加，且BV/TV明顯增加，而HIF1AN明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP組比較，HIF1AN-OE+miR-27b-3p mimic+OP組中ALP、Runx2和OPN蛋白表達降低，且BV/TV明顯降低，而HIF1AN蛋白明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

a～c：Western blot檢測HIF1AN過表達聯(lián)合miR-27b-3p mimic對大鼠股骨組織中HIF1AN和ALP、Runx2、OPN蛋白表達的影響；d：micro-CT分析HIF1AN過表達聯(lián)合miR-27b-3p mimic對股骨的骨體積分數(shù)的影響 *：與Control組相比，P<0.05；#：與NC mimic+OP組相比，P<0.05；&：與NC-OE+miR-27b-3p mimic+OP組相比，P<0.05圖5 miR-27b-3p通過HIF1AN調(diào)控CSCI-OP大鼠的骨生成

3 討論

本研究結(jié)果顯示，miR-27b-3p通過與HIF1AN mRNA的3’-UTR位點結(jié)合，阻礙HIF1AN表達，從而促進MSCs的成骨細胞分化，表明miR-27b-3p在成骨過程中具有重要作用。大量研究表明，miRNA可以作為成骨細胞分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。miR-141和miR-200a可通過靶向MSCs中的Dlx5參與成骨分化[7]；miR-378可以通過靶向BMP2促進成骨細胞分化[8]；此外，miR-764-5p可通過抑制CHIP/STUB1表達促進成骨細胞分化[9]。miR-27b是一種與成骨相關(guān)的miRNA，其表達水平在大鼠脂肪干細胞成骨過程中下調(diào)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，CSCI-OP組患者外周血中miR-27b-3p的表達下調(diào)，而在MSCs受BMP2誘導(dǎo)后miR-27b-3p表達上調(diào)；miR-27b-3p過表達顯著增加了ALP的活性和細胞外基質(zhì)鈣沉積，而miR-27b-3p敲低則抑制了上述過程。這些發(fā)現(xiàn)與先前研究結(jié)果一致[6]。

越來越多的證據(jù)支持Runx2作為關(guān)鍵的成骨細胞譜系決定轉(zhuǎn)錄因子參與指導(dǎo)成骨細胞分化這一觀點[12-13]。Runx2是成骨中的主要基因，其能夠誘導(dǎo)OPN和骨鈣素等骨相關(guān)標志物的表達。本研究中，miR-27b-3p過表達上調(diào)了Runx2、OPN、ALP的表達，miR-27b-3p敲低則下調(diào)了上述蛋白的表達，表明miR-27b-3p可以促進成骨分化，與文獻結(jié)果一致[6]。

據(jù)報道，HIF-1α信號通路的激活可上調(diào)MSCs中的成骨分化相關(guān)基因的表達[14]。研究還表明，增加HIF-1α的表達可以促進骨髓干細胞的成骨細胞分化[15]。HIF1AN被認為是一種可以與HIF-1α相互作用的重要抑制劑。大量證據(jù)表明，HIF1AN在多種組織的分化中起著關(guān)鍵作用。例如，HIF1AN受miR-455的靶向調(diào)控，從而調(diào)節(jié)棕色脂肪細胞分化[16]；HIF1AN還受到miR-31的靶向調(diào)控，可促進表皮和角膜上皮中的促分化表型增加[17-18]。研究表明，miR-27b-3p能影響HIF1AN的蛋白水平，其可與HIF1AN3’-UTR結(jié)合并促進視網(wǎng)膜血管的生成[19]。然而，目前尚未見關(guān)于miR-27b-3p通過靶向HIF1AN調(diào)節(jié)成骨分化的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，在MSCs中HIF1AN是miR-27b-3p的直接靶標，HIF1AN的過表達降低了MSCs中的ALP、OPN和Runx2的表達以及鈣沉積，還逆轉(zhuǎn)了miR-27b-3p mimic對成骨分化的正向影響。另外，我們在頸脊髓損傷后骨質(zhì)疏松癥動物模型中觀察到miR-27b-3p可以通過抑制HIF1AN促進頸脊髓損傷后骨質(zhì)疏松癥大鼠的成骨分化，頸脊髓損傷后骨質(zhì)疏松癥大鼠的股骨組織中ALP、Runx2和OPN下調(diào)，且BV/TV明顯降低，而HIF1AN表達上調(diào)。miR-27b-3p mimic則可以明顯促進ALP、Runx2和OPN蛋白的表達和BV/TV的增加，并明顯抑制HIF1AN的表達；然而過表達HIF1AN后上述指標變化都被逆轉(zhuǎn)。表明miR-27b-3p可通過靶向HIF1AN促進SCI-OP大鼠MSCs的成骨分化。

綜上所述，本研究的體外實驗證實，miR-27b-3p通過靶向抑制HIF1AN促進MSCs的成骨分化；而體內(nèi)實驗證實，miR-27b-3p可通過靶向抑制HIF1AN促進骨生成，進而改善CSCI-OP大鼠的骨質(zhì)疏松癥。這為miRNA在成骨分化中的作用和調(diào)控機制提供了新的見解，提示靶向miR-27b-3p的治療方法可用于增強新骨形成和治療頸脊髓損傷誘導(dǎo)的骨丟失。