謝蓮萍，趙玉梅，陳麗萍，王 崇，國樹梅 (.衡水市第七人民醫(yī)院藥劑科，河北 衡水 053000；.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院藥劑科，黑龍江 牡丹江 57000)

抑郁癥是抑郁障礙的典型情況，是一種患病率和治愈率均較高的精神障礙，但大眾對該疾病的認(rèn)知程度和重視程度欠缺，能夠堅(jiān)持接受正規(guī)治療的病例較少，導(dǎo)致治療后易復(fù)發(fā)[1-2]。抑郁癥會使植物神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，進(jìn)而影響免疫系統(tǒng)功能，引起神經(jīng)性頭痛、神經(jīng)衰弱、反應(yīng)遲鈍等神經(jīng)損傷性疾病。抑郁癥的治療包括藥物、心理以及物理治療，旨在幫助患者提高生活質(zhì)量、恢復(fù)社會功能以及預(yù)防復(fù)發(fā)。氟西汀、舍曲林、文拉法辛、米氮平等可用于抑郁癥治療，但伴有惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[3-4]。利培酮是新一代非經(jīng)典抗精神病藥物，能夠選擇性拮抗分布于中腦和邊緣腦組織中的多巴胺D2受體、5-羥色胺2A(5-hydroxytryptamine 2A，5-HT2A)受體，對精神分裂癥具有較好的治療效果，且錐體外系不良反應(yīng)發(fā)生率較低，患者的耐受性更好[5]。有研究表明，利培酮在治療抑郁癥患者方面具有較好效果[6]，但利培酮是否是通過影響神經(jīng)元細(xì)胞損傷和免疫調(diào)節(jié)來發(fā)揮治療作用目前尚不明確?；诖?，本研究通過制備抑郁癥大鼠模型，探討利培酮對抑郁癥大鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷和免疫紊亂的影響，以期為抑郁癥治療方案的制定提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

兔抗鼠Bax抗體(批號：191114)、兔抗鼠Bcl-2抗體(批號：191208)、兔抗鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體(批號：200311)購自上海恒斐生物科技有限公司，ECL試劑盒(批號：200603)購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，DMSO(批號：191117)購自Sigma公司，尼氏染色液(批號：200412A)購自北京索菜寶科技有限公司，白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(批號：191212)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒(批號：191124)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)試劑盒(批號：191019)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)試劑盒(批號：200216)購自武漢益普生物科技有限公司，5-羥吲哚乙酸(5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA)試劑盒(批號：200321)購自南京森貝伽生物科技有限公司，兔抗鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate transporter-1，GLT-1)抗體(批號：200522)購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。

主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：Avanti J-15R冷凍離心機(jī)(Beckman Coulter)、Primo Star iLED正置熒光顯微鏡(Carl Zeiss)、RM2255全自動輪盤式切片機(jī)(LEICA)、多功能酶標(biāo)儀(上海閃譜生物科技公司，SuPerMax 3000AL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠100只，5～6周齡，體質(zhì)量(270±20)g，購自牡丹江醫(yī)學(xué)院[SCXK(黑)2019-003]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，濕度50%～55%，人工光照(晝12 h/夜12 h)，全天自由飲水、進(jìn)食。

1.3 模型制備與動物分組處理

將100只SD大鼠分為對照組、模型組、利培酮低劑量組、利培酮中劑量組、利培酮高劑量組，每組20只。除對照組外，其余各組均參考文獻(xiàn)[7]采用慢性不可預(yù)見應(yīng)激(chronic unpredictable stress，CUS)法制備抑郁癥大鼠模型，刺激方式包括：①禁水17 h；②禁食和禁水20 h；③持續(xù)光照20 h；④夾尾60 s；⑤ 30 V電壓電擊足底；⑥ 4～5 ℃冷水游泳5 min；⑦飼養(yǎng)籠加入濕鋸屑墊料；⑧將飼養(yǎng)籠傾斜45 ℃，連續(xù)17 h。所有刺激方式在模型制備過程中均使用，連續(xù)刺激21 d，但每種刺激方式不能連續(xù)使用2 d。與健康大鼠相比，大鼠活動能力下降、探索能力減弱表明模型構(gòu)建成功。對照組大鼠正常飼養(yǎng)條件同1.2。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行第22天時，參考文獻(xiàn)[8]中利培酮的給藥劑量，分別給予利培酮低劑量組、利培酮中劑量組、利培酮高劑量組0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.20 mg/kg利培酮腹腔注射干預(yù)，模型組和對照組注射相應(yīng)體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。每組選取5只大鼠采用Longa法評估神經(jīng)功能，然后再用于跳臺實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉處死大鼠，但不用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢測；余下15只大鼠均麻醉處死，取5只大鼠海馬組織用于神經(jīng)遞質(zhì)水平和GLT-1、BDNF和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測，另取5只大鼠海馬組織用于HE染色、尼氏小體染色，余下5只大鼠用于外周血、腦組織炎癥因子水平檢測。

1.4 Longa法評估大鼠神經(jīng)功能

每組隨機(jī)選取5只大鼠，采用Longa法[9]評估大鼠神經(jīng)功能情況：正常，無神經(jīng)缺損癥狀(0分)；不能伸展前爪，輕度損傷(1分)；行走時向單側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度損傷(2分)；行走時向單側(cè)傾倒，重度損傷(3分)；不能自發(fā)行走，意識喪失(4分)。

1.5 跳臺實(shí)驗(yàn)測量大鼠犯錯誤次數(shù)

在跳臺裝置中放置絕緣平臺(直徑4.5 cm，高5 cm)，神經(jīng)功能評估完成后，將大鼠放入被動條件反射箱內(nèi)絕緣平臺上適應(yīng)3 min，適應(yīng)結(jié)束后，接通40 V交流電，大鼠一般情況下會跳上絕緣平臺以躲避電擊，記錄訓(xùn)練5 min內(nèi)大鼠被電擊次數(shù)(錯誤次數(shù))，訓(xùn)練結(jié)束24 h后，在通電情況下再次將大鼠放置于絕緣平臺，記錄大鼠5 min內(nèi)錯誤次數(shù)。

1.6 ELISA檢測大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)水平

取出大鼠腦組織，4 ℃預(yù)冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面水分，分離出海馬組織，按照質(zhì)量體積比(1∶9)加入4 ℃預(yù)冷生理鹽水，于冰臺上研磨成勻漿，然后于4 ℃、35 000 r/min離心10 min，取上清液于-80 ℃保存，采用ELISA法檢測上清液中5-HT、5-HIAA水平，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，重復(fù)3次。

1.7 HE染色觀察大鼠海馬組織病理損傷情況

取大鼠完整腦組織，并快速分離出海馬組織固定于10%中性甲醛溶液中，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(5 μm)，再進(jìn)行脫蠟、水化、HE染色、水化、透明封片，顯微鏡下(×400)觀察海馬區(qū)病理情況。

1.8 尼氏小體染色觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷情況

每組大鼠海馬組織取樣至脫蠟和水化步驟均與1.7相同，37 ℃尼氏染色液染色5 min，蒸餾水清洗2次，95%無水乙醇進(jìn)行分色，后續(xù)脫水、透明、封片等步驟同1.7，在高倍鏡(×400)下觀察海馬區(qū)尼氏小體染色情況，其中尼氏小體呈藍(lán)紫色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

1.9 Western blot檢測大鼠海馬區(qū)GLT-1、BDNF和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

提取大鼠海馬區(qū)總蛋白，采用Bradford法調(diào)整蛋白濃度至一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳(70 V恒壓電泳1.5 h，再100 V電泳1 h)、電轉(zhuǎn)(恒定電流200 mA、2 h)至PVDF膜，密封2 h，分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、、GLT-1、BDNF、GAPDH一抗(均1∶500)，然后4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶500)繼續(xù)孵育1 h，參照ECL試劑盒說明書進(jìn)行顯影、定影，收集影像。重復(fù)3次。

1.10 ELISA檢測大鼠外周血、腦組織炎癥因子水平

斷頭處死大鼠前，采集心臟血0.5 mL，4 ℃下35 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80 ℃；取1.6中的海馬組織勻漿上清液，采用ELISA法檢測上清液中IL-6、TNF-α、IL-10水平，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，重復(fù)3次。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 利培酮對抑郁癥大鼠神經(jīng)功能的影響

與對照組相比，模型組大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)、神經(jīng)功能損傷評分顯著增加/升高(P<0.05)。與模型組相比，利培酮中劑量組、利培酮高劑量組跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)、神經(jīng)功能損傷評分顯著減少/降低(P<0.05)，見圖1。

a：跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)；b：神經(jīng)功能損傷評分 *：與對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.2 利培酮對抑郁癥大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

與對照組相比，模型組大鼠5-HT、5-HIAA水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，利培酮中劑量組和利培酮高劑量組5-HT、5-HIAA水平顯著升高(P<0.05)，見圖2。

a：跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)；b：神經(jīng)功能損傷評分 *：與對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05圖2 利培酮對抑郁癥大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

2.3 各組大鼠海馬區(qū)GLT-1和BDNF蛋白水平比較

與對照組相比，模型組大鼠GLT-1、BDNF蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，利培酮中劑量組、利培酮高劑量組GLT-1、BDNF蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖3。

2.4 各組大鼠海馬區(qū)HE染色結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則；模型組大鼠和利培酮低劑量組大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞均表現(xiàn)為核固縮、胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞排列雜亂無章；利培酮中劑量組、利培酮高劑量組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列較緊密有序，損傷程度減輕，見圖4。

圖4 大鼠海馬區(qū)HE染色

2.5 各組大鼠海馬區(qū)尼氏小體染色

尼氏小體染色結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)較好，且染色藍(lán)紫色的尼氏小體顆粒較多；模型組、利培酮低劑量組大鼠的海馬區(qū)尼氏小體顆粒減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞質(zhì)著色變淺；利培酮中劑量組、利培酮高劑量組海馬區(qū)尼氏小體顆粒增多，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)相對較好，見圖5。

圖5 大鼠海馬區(qū)尼氏小體染色

2.6 各組大鼠海馬區(qū)Caspase-9、Caspase-3和Bcl-2/Bax水平比較

與對照組相比，模型組大鼠Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利培酮中劑量組、利培酮高劑量組Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

a：蛋白凝膠成像結(jié)果；b：蛋白相對表達(dá)水平 *：與對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.7 各組大鼠外周血和腦組織中IL-6、TNF-α和IL-10水平比較

與對照組相比，模型組外周血和腦組織中IL-6、TNF-α、IL-10水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，利培酮中劑量組、利培酮高劑量組外周血和腦組織中IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，IL-10水平顯著升高(P<0.05)，見圖7。

a：外周血IL-6、TNF-α和IL-10水平；b：腦組織IL-6、TNF-α和IL-10水平 *：與對照組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

3 討論

抑郁癥是病情易反復(fù)的慢性情感性疾病，誘導(dǎo)抑郁癥發(fā)病的因素眾多，并且各種因素之間會相互影響[9-10]。普遍認(rèn)為抑郁癥發(fā)病與遺傳、心理、神經(jīng)內(nèi)分泌以及神經(jīng)遞質(zhì)功能異常有關(guān)，大部分抑郁癥患者存在認(rèn)知功能損傷，表現(xiàn)出反應(yīng)變慢、注意力分散、記憶損傷等癥狀，患者日常生活受到較大影響[11-12]。目前多采用抗抑郁藥物進(jìn)行治療，主要是通過改變單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能發(fā)揮治療效果，但存在藥物起效慢和副作用反應(yīng)大等缺點(diǎn)[13]。

利培酮是治療精神分裂癥的非典型精神藥物，屬于苯丙異噁唑類衍生物，其可以減少感染性腦膜炎引起的精神障礙患者的行為、精神障礙癥狀[14]。5-HT、5-HIAA為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在調(diào)節(jié)機(jī)體正常精神活動中具有重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥大鼠的跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)、神經(jīng)功能損傷評分較健康大鼠顯著增加/升高，而海馬組織中5-HT、5-HIAA水平顯著降低，說明抑郁癥大鼠存在認(rèn)知障礙和神經(jīng)功能損傷。有研究表明，雞豆黃素A可通過增加抑郁癥大鼠海馬組織中5-HT含量和促進(jìn)cAMP-CREB-BDNF信號通路蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗抑郁作用[16]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)利培酮干預(yù)劑量為0.10 mg/kg時可以顯著減少/降低抑郁癥大鼠跳臺實(shí)驗(yàn)犯錯誤次數(shù)、神經(jīng)功能損傷評分，提高抑郁癥大鼠海馬組織中5-HT、5-HIAA的水平，說明利培酮具有抗抑郁作用，這可能與調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平有關(guān)。

海馬組織在學(xué)習(xí)、記憶過程中具有重要作用，可通過調(diào)節(jié)下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素來參與腦應(yīng)激反應(yīng)過程，而持續(xù)性腦應(yīng)激反應(yīng)會縮小海馬體積，降低海馬的可塑性，同時還會使海馬神經(jīng)發(fā)生減少[17]，而海馬神經(jīng)發(fā)生在人類學(xué)習(xí)、記憶和情感控制方面具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、核固縮且排列雜亂，而中、高劑量利培酮干預(yù)后的神經(jīng)元細(xì)胞的損傷程度明顯減輕，說明中、高劑量利培酮可以緩解抑郁癥大鼠的海馬組織損傷，對海馬損傷具有改善作用。

尼氏小體是神經(jīng)元胞體或樹突內(nèi)大嗜堿性團(tuán)塊或顆粒，其主要功能是合成/更新細(xì)胞器、神經(jīng)遞質(zhì)所需的蛋白質(zhì)和酶類，其形狀、數(shù)量和分布情況因神經(jīng)元類型不同而存在差異[18]。分布于軸突端的大量蛋白質(zhì)均是由胞體的尼氏體合成，代謝旺盛的神經(jīng)元中含有大量尼氏體。當(dāng)神經(jīng)受損時，尼氏體含量降低，甚至消失；當(dāng)受損神經(jīng)元恢復(fù)時，尼氏體含量又會恢復(fù)至正常水平，故尼氏體可作為神經(jīng)元功能的觀察對象。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥大鼠海馬區(qū)尼氏體呈現(xiàn)出明顯減少趨勢，而中、高劑量利培酮干預(yù)后大鼠海馬區(qū)尼氏體呈明顯升高趨勢，說明抑郁癥大鼠存在海馬區(qū)神經(jīng)元損傷，而給予中、高劑量的利培酮干預(yù)有助于抑郁癥大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元功能恢復(fù)。

BDNF是海馬區(qū)神經(jīng)元發(fā)生、存活的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，正常生理狀態(tài)下在海馬、皮層中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平降低可能加速應(yīng)激反應(yīng)引起的海馬區(qū)神經(jīng)元損傷程度[19]。氟西汀可通過減少抑郁癥大鼠的海馬細(xì)胞凋亡、提高BDNF水平來發(fā)揮對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[20]。GLT-1為膠質(zhì)細(xì)胞性轉(zhuǎn)運(yùn)體，可清除突出間隙中的興奮性氨基酸谷氨酸。Caspase-9、Caspase-3均屬于細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)途徑中的細(xì)胞凋亡因子，凋亡信號刺激可使無生物活性的Caspase-9、Caspase-3快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[21-22]。Bax和Bcl-2分別分布于線粒體膜上和線粒體膜外，可調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，兩者比值可反映細(xì)胞凋亡情況[23]。本研究結(jié)果顯示，抑郁癥大鼠海馬組織中的GLT-1和BDNF蛋白水平明顯降低，Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平明顯升高，而通過給予中、高劑量的利培酮干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)上述趨勢，說明中、高劑量的利培酮可以調(diào)節(jié)GLT-1和BDNF、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2/Bax蛋白水平，提示利培酮可能通過提高抑郁癥大鼠海馬區(qū)BDNF、GLT-1蛋白水平、降低凋亡相關(guān)蛋白水平來發(fā)揮對神經(jīng)元的保護(hù)作用。

組織損傷凋亡受到多種因素激活，免疫炎癥反應(yīng)增強(qiáng)就是其中之一，IL-6、TNF-α均屬于促炎因子，IL-10屬于抑炎因子，炎癥因子主要是由輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞所合成分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥大鼠外周血和海馬組織IL-6、TNF-α、IL-10水平較健康大鼠呈升高趨勢，而中、高劑量的利培酮干預(yù)可降低抑郁癥大鼠外周血和海馬組織IL-6、TNF-α水平，增加IL-10水平，說明中、高劑量的利培酮干預(yù)可能對抑郁癥大鼠的免疫功能存在改善作用，但其中具體機(jī)制尚還需要深入研究。

綜上所述，在0.10 mg/kg利培酮作用下可以緩解抑郁癥大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷程度和免疫紊亂狀態(tài)，但利培酮是通過何種信號通路調(diào)節(jié)抑郁癥大鼠海馬區(qū)神經(jīng)損傷和免疫狀態(tài)，還需要進(jìn)一步深入研究。