張藍(lán)心，李欣，楊丹，鄧楊，李登位

1.南充市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000；

2.南充市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000

鉛暴露是全世界最重要的公共衛(wèi)生問題之一。由于具有優(yōu)異性能的含鉛材料應(yīng)用于如光伏、化工、日化和醫(yī)療等多個(gè)領(lǐng)域，使得人類持續(xù)暴露于含鉛的環(huán)境中[1-3]。重要的是，鉛可通過呼吸道、皮膚和胃腸道進(jìn)入人體，經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)全身各組織器官，從而對(duì)重要臟器造成損傷[4]。而心臟作為人體最重要的器官之一，其主要組成單位心肌細(xì)胞僅具有極其有限的再生能力，一旦遭受損傷有可能導(dǎo)致心肌永久性缺失，從而影響心臟功能[5]。因此探討鉛誘導(dǎo)的心肌損傷具有重要意義。

據(jù)報(bào)道，當(dāng)鉛蓄積在心肌組織時(shí)，主要通過誘導(dǎo)大量心肌細(xì)胞凋亡，從而影響心臟功能[6]。眾所周知，凋亡是最重要也是最常見的細(xì)胞死亡形式之一，主要存在三大基本途徑：線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和死亡受體途徑，其中線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑稱為內(nèi)源性途徑，而死亡受體途徑被稱為外源性途徑。目前，研究已經(jīng)表明鉛中毒將誘發(fā)過度氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致線粒體損傷，最終引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。有趣的是，過度氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)以及能量代謝危機(jī)所致的鈣失衡可能誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激的發(fā)生和鈣調(diào)節(jié)紊亂，最終促使細(xì)胞走向凋亡[8]。然而，目前罕有研究去探索鉛暴露是否可通過誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這使得研究者們難以從誘導(dǎo)凋亡的內(nèi)源性途徑整體上去理解鉛暴露誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制。因此，本研究將圍繞凋亡的內(nèi)源性途徑探討鉛誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，深入理解鉛暴露所致心肌損傷的病理過程。

1 材料與方法

1.1 材料AC16人心肌細(xì)胞來源于ATCC。Cell Counting Kit-8(CCK-8)、活性氧熒光探針(DCFH-DA)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；胰酶細(xì)胞消化液(0.25%胰酶)、RIPA細(xì)胞快速裂解液、BCA試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)、Calpain 1單克隆抗體、Caspase 3多克隆抗體、β-actin單克隆抗體、HRP酶標(biāo)抗兔二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermofisher；Bip單克隆抗體、Cleaved-PARP單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST(Cell Signaling Technology)；醋酸鉛購(gòu)自于北京伊諾凱科技有限公司。酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermofisher；低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf；曝光機(jī)購(gòu)自美國(guó)Azure Biosystems；電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)AC16細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)，按照1∶(3~4)的比例傳代3次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有細(xì)胞均隨機(jī)分為正常對(duì)照組和不同濃度的醋酸鉛組。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)制備AC16細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為7×103個(gè)/孔，100μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別設(shè)正常對(duì)照組和不同濃度醋酸鉛組(濃度分別為：3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。然后每孔加入CCK-8液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后取出，用酶標(biāo)儀(450 nm)檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值(OD值)。

1.2.3 LDH釋放檢測(cè)制備AC16細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為7×103個(gè)/孔，100μL/孔接種到96孔板，放置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后分別設(shè)正常對(duì)照組和不同濃度醋酸鉛組(濃度同上)，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400×g離心5 min。分別取各孔的上清液120μL，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即按照說明書進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)檢測(cè)經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平。按2×105個(gè)/孔在普通小皿中接種AC16細(xì)胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細(xì)胞進(jìn)行共孵育，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，待再次培養(yǎng)6 h后，用染核試劑和ROS熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行探針裝載。然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生情況。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè)檢測(cè)經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細(xì)胞線粒體膜電位變化。按2×105個(gè)/孔在普通小皿中接種AC16細(xì)胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細(xì)胞進(jìn)行共孵育，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，待再次培養(yǎng)6 h后，按照說明書用線粒體膜電位熒光探針JC-1處理細(xì)胞。然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)經(jīng)過不同濃度(50μg/mL、100μg/mL)醋酸鉛處理的AC16細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的改變。按8×105個(gè)/孔在普通大皿中接種AC16細(xì)胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后，將醋酸鉛與細(xì)胞進(jìn)行共孵育，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組，待再次培養(yǎng)12 h后移除培養(yǎng)液，用冰PBS洗一遍，加入適量RIPA裂解液，置于搖床冰上，裂解15 min，用細(xì)胞刮充分刮數(shù)下，收集蛋白至EP管，采用BCA法進(jìn)行的蛋白定量。各組樣本取相同適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(初始電壓為80 V，待蛋白條帶入分離膠，調(diào)整電壓至120 V)，預(yù)先將PDVF膜泡在甲醇液中30~60 s，待電泳結(jié)束，將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜，趕走膜和膠之間的氣泡，放入轉(zhuǎn)膜槽(90 V，90 min)，1×TBST稀釋的5%脫脂牛奶，搖床上常溫封閉1.5 h。將一抗和膜置于孵育盒中共同孵育(一抗稀釋液配制所有的一抗，濃度為1∶1 000)，4℃搖床過夜?；厥找豢?，1×TBST洗膜3次，15 min/次。二抗用1×TBST稀釋的5%脫脂牛奶溶解，與膜在搖床上常溫孵育1.5 h。1×TBST洗膜3次，15 min/次，隨即進(jìn)行顯色及曝光。采用ImageJ對(duì)Western blot條帶進(jìn)行量化，將歸一化后目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值之間比值視為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA test)，組間多重比較采用最小顯著性差異法(LSD法)檢驗(yàn)；組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞毒性作用檢測(cè)醋酸鉛對(duì)細(xì)胞存活率和LDH釋放以明確醋酸鉛對(duì)AC16的細(xì)胞毒性。如圖1所示，當(dāng)≥25μg/mL醋酸鉛處理24 h后，細(xì)胞存活率較正常對(duì)照組明顯下降且具有濃度依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)隨著醋酸鉛的濃度增高，培養(yǎng)液中LDH的濃度成梯度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 不同濃度醋酸鉛處理后，AC16心肌細(xì)胞存活率和LDH釋放情況Figure 1 The viability and LDH release of AC16 cardiomyocytes after treatment with different concentrationsof lead acetate

2.2 ROS蓄積和線粒體損傷基于上述結(jié)果，選擇適當(dāng)暴露濃度(50μg/mL、100μg/mL)進(jìn)一步驗(yàn)證醋酸鉛經(jīng)線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡。通過熒光探針標(biāo)記ROS以及反應(yīng)線粒體膜電位變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋酸鉛處理后，心肌細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平相較于正常對(duì)照明顯升高，從而造成線粒體損傷、膜電位下降，引起能量衰竭，進(jìn)而使得ROS水平進(jìn)一步上升(圖2)。

圖2 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細(xì)胞內(nèi)ROS水平和線粒體膜電位的變化Figure2 Changesof ROSlevels and mitochondrial membranepotential in AC16 cellstreated with different concentrationsof lead acetate

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激為進(jìn)一步理解醋酸鉛所致AC16心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制，通過Western blotting檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的關(guān)鍵蛋白。結(jié)果顯示，相較于正常對(duì)照組，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的感受器蛋白Bip和通路關(guān)鍵蛋白Calpain 1表達(dá)均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)醋酸鉛處理后AC16的凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP較正常對(duì)照組表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3~圖5。

圖3 Western blotting檢測(cè)醋酸鉛處理后AC16細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Calpain 1和Bip蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP的表達(dá)Figure 3 Western blotting was used to detect the expressions of endoplasmic reticulum stress-related proteins Calpain 1 and Bip proteins and apoptosis-related proteins Cleaved-caspase3 and Cleaved-PARP in AC16 cells after lead acetatetreatment

圖4 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白Bip和Calpain 1蛋白的相對(duì)表達(dá)量Figure 4 The relative expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins Bip and Calpain 1 in AC16 cells treated with different concentrationsof lead acetate

圖5 不同濃度醋酸鉛處理后AC16細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-caspase3的相對(duì)表達(dá)量Figure 5 The relative expression of apoptosis-related proteins Cleaved-PARP and Cleaved-caspase3 in AC16 cells treated with different concentrationsof lead acetate

3 討論

鉛是廣泛存在的工業(yè)污染物，進(jìn)入人體后經(jīng)血液循環(huán)蓄積在全身各組織器官，通過干擾細(xì)胞的各種生理、生化過程，造成多組織器官損傷，尤其是鉛中毒誘導(dǎo)的心肌損傷受到廣泛關(guān)注。研究表明，鉛暴露對(duì)心臟組織產(chǎn)生毒性作用，可導(dǎo)致心臟功能受損[9]。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)鉛暴露與心臟組織損傷程度、血清LDH活性水平和肌酸激酶同工酶濃度相關(guān)，表明鉛暴露會(huì)導(dǎo)致心臟毒性[10]。近年臨床研究也揭示了血鉛水平與左心室每博輸出量和射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)[11]。同時(shí)，前瞻性研究發(fā)現(xiàn)左心室的收縮能力隨著鉛暴露而下降[12]。這些不利影響最終可能導(dǎo)致心力衰竭，嚴(yán)重威脅人類生命安全。因此鉛暴露所引起的心臟疾病的防治是迫切需要解決的問題，那么探索鉛暴露所致心肌損傷的機(jī)制可能為鉛中毒的防治提供新的思路。

為此，本研究選用人源心肌細(xì)胞AC16建立體外研究模型，首先通過經(jīng)典的CCK-8實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶的釋放明確鉛化合物的心肌細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露會(huì)顯著降低細(xì)胞的存活率，同時(shí)設(shè)置不同暴露濃度，明確了醋酸鉛致心肌細(xì)胞毒性的量-效關(guān)系。這將為鉛暴露的防治提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為下一步機(jī)制探索提供依據(jù)。

基于上述結(jié)果，本研究選擇合適的鉛暴露濃度探索毒性損傷機(jī)制。目前普遍認(rèn)為鉛具有誘發(fā)氧化應(yīng)激的能力，近年來的研究也揭示氧化應(yīng)激在鉛中毒的病理過程中的作用[13-15]。因此，通過檢測(cè)ROS水平的變化，揭示了鉛暴露后AC16細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，提示鉛可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。同時(shí)由于鉛對(duì)巰基(-SH)具有高的親和力，與-SH形成硫醇鹽，抑制氧化還原體系中酶的活性，進(jìn)一步破壞氧化還原的調(diào)節(jié)能力[16]。這一過程也將加劇氧化應(yīng)激的程度，從而嚴(yán)重影響細(xì)胞的生理活動(dòng)，還使得細(xì)胞各種成分受到破壞。本次研究也發(fā)現(xiàn)，鉛暴露后細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位明顯下降，提示ROS水平持續(xù)升高使得線粒體受到損傷。當(dāng)線粒體膜完整性受到損害時(shí)，細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)中，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。

為了明確細(xì)胞凋亡的發(fā)生，檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)改變。研究發(fā)現(xiàn)鉛暴露誘導(dǎo)AC16心肌細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表達(dá)明顯增加，證明了鉛誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但是，凋亡的內(nèi)源性途徑主要有兩條，分別為線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，不僅引起氧化應(yīng)激和線粒體損傷，還使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中積累未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這會(huì)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)，從而影響細(xì)胞的存活[18]。然而目前鮮有研究探索鉛暴露是否會(huì)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為此，繼續(xù)深入分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Bip蛋白明顯升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生。重要的是，研究還發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白Calpain1表達(dá)增加，這不僅證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，還提示Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放到胞質(zhì)中。而Ca2+被線粒體吸收，通過不同的機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)線粒體產(chǎn)生ROS和細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并損害線粒體功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[19]。因此，本次研究發(fā)現(xiàn)線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑在鉛暴露誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中具有重要協(xié)同作用，不僅加深對(duì)毒性損傷機(jī)制的理解，有助于為疾病的防治提供基礎(chǔ)理論。

綜上，本研究通過體外模型明確了鉛暴露會(huì)造成心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)首次初步闡明鉛誘發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，揭示其與氧化應(yīng)激和線粒體損傷在鉛暴露所致心肌細(xì)胞凋亡的協(xié)同效應(yīng)。這為全面理解鉛所致毒性損傷機(jī)制提供新的依據(jù)，有助于拓展該疾病的治療策略。然而，本次研究仍然存在一些不足之處，一方面是對(duì)機(jī)制的探索有待進(jìn)一步深入，另一方面是未通過體內(nèi)模型進(jìn)行研究。為此，接下來的工作將建立體內(nèi)模型，深入挖掘鉛暴露損傷機(jī)制和特點(diǎn)，力爭(zhēng)為鉛暴露所致心血管疾病的防治提供新思路。