呂堯蘭 綜述 金健 審校

1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 653000；

2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院胸心外科，四川 成都 610036

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，也是我國(guó)近30年來(lái)發(fā)生率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤。2020年全世界肺癌發(fā)病率和死亡率均居前位，新發(fā)病例約220萬(wàn)，死亡約180萬(wàn)[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多年來(lái)國(guó)內(nèi)外一直致力于通過(guò)篩查來(lái)實(shí)現(xiàn)NSCLC的的早診早治，以期降低NSCLC的相關(guān)死亡率，但效果欠佳，即使是接受了根治性手術(shù)的NSCLC患者，也有45%在8~18個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。盡管在診斷和新型靶向藥物方面取得了新進(jìn)展，NSCLC的預(yù)后仍然很差，因?yàn)樯鏁r(shí)間與NSCLC的臨床分期直接相關(guān)，不同的臨床分期的預(yù)后有著顯著差異，所以NSCLC的早期診斷和有效的治療是延長(zhǎng)生存時(shí)間的有效方法，能使患者有更好的轉(zhuǎn)歸。

目前臨床上常用的NSCLC診斷技術(shù)有：影像學(xué)、實(shí)驗(yàn)室(病理)、內(nèi)窺鏡以及近年興起的液體活檢等方法。其中液體活檢是一種分析血液等非實(shí)質(zhì)性生物組織來(lái)診斷或檢測(cè)腫瘤的方法[3]，具有低創(chuàng)傷、標(biāo)本易獲取、可以反映腫瘤的整體狀態(tài)、實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。其中腫瘤教化血小板(tumor-educated platelets，TEPs)作為新型液體活檢標(biāo)志物來(lái)源，其轉(zhuǎn)錄組中MicroRNA(miRNA)是目前用于檢測(cè)早期NSCLC的熱門(mén)生物標(biāo)志物。本文就TEPs轉(zhuǎn)錄組中miRNA區(qū)分肺結(jié)節(jié)良、惡性的可行性進(jìn)行綜述。

1 TEPs概述

TEPs是指惡性腫瘤患者中的癌細(xì)胞與血小板相互作用時(shí)，通過(guò)多種方式影響血小板RNA表達(dá)譜的血小板[4-5]，被認(rèn)為由癌癥存在時(shí)的局部和系統(tǒng)性應(yīng)答轉(zhuǎn)化而來(lái)[6]。TEPs是含有腫瘤RNA的血小板，是腫瘤源性RNA的重要來(lái)源[4]。血小板不僅可以根據(jù)腫瘤釋放的信號(hào)進(jìn)行剪接，血小板與腫瘤釋放的某些生長(zhǎng)因子的相互作用也會(huì)改變血小板中存在的mRNA的表達(dá)。這種由于血小板與腫瘤相互作用而導(dǎo)致的血小板內(nèi)mRNA的差異表達(dá)可被用作早期癌癥檢測(cè)或癌癥轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)記物[7]。

1.1 血小板生理血小板來(lái)源于骨髓巨核細(xì)胞的無(wú)核循環(huán)細(xì)胞片段，具有動(dòng)態(tài)的生物學(xué)功能，包括止血、動(dòng)脈血栓形成、免疫、炎癥、血管重塑和血管生成[7]。血小板大量存在于血液中，是外周血中第二豐富的細(xì)胞類(lèi)型[8]。研究表明肺對(duì)血小板生成的貢獻(xiàn)很大，約占血小板總產(chǎn)量的50%，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明肺是終末血小板生成的主要場(chǎng)所，也是具有相當(dāng)造血潛能的器官[9]。也就是說(shuō)，當(dāng)肺部存在結(jié)節(jié)時(shí)，血小板可能會(huì)從結(jié)節(jié)組織中穿過(guò)，受到結(jié)節(jié)的影響從而改變自身的RNA，為研究提供了理論依據(jù)。而通過(guò)RNA結(jié)合噻唑橙染色測(cè)定，年輕的網(wǎng)狀血小板的總RNA濃度增加了20~40倍[10]，這表明年輕的血小板含有更多的(未切割的)RNA，這些RNA可能在血小板循環(huán)或激活時(shí)衰變或釋放，在血小板激活之前提取RNA，可以獲得大量RNA。目前發(fā)現(xiàn)的血小板含有豐富的RNA種類(lèi)，包括mRNA(前RNA和mRNA)、核糖體RNA(r-RNA)、microRNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、反義RNA(as-RNA)和轉(zhuǎn)移RNA(t-RNA)[11]。其中，MicroRNAs(miRNA)是一個(gè)小的非編碼RNA家族(21-25個(gè)核苷酸)，可以通過(guò)堿基配對(duì)到靶信使RNA(mRNA)的互補(bǔ)位點(diǎn)來(lái)抑制mRNA的翻譯和促進(jìn)mRNA的降解[12]。通過(guò)這種機(jī)制，miRNA在轉(zhuǎn)錄后改變了基因表達(dá)，而這種改變能夠被發(fā)現(xiàn)，借以觀察肺良、惡性結(jié)節(jié)之間的差異性。

1.2 血小板與腫瘤細(xì)胞血小板與腫瘤細(xì)胞之間存在相互作用。一方面，腫瘤細(xì)胞可以“教育”血小板，影響循環(huán)血小板的數(shù)量和激活狀態(tài)，并使其轉(zhuǎn)錄組發(fā)生剪接或拼接，導(dǎo)致功能發(fā)生改變；另一方面，腫瘤教化的血小板含有過(guò)多的活性生物分子，包括血小板特異性和循環(huán)攝取的生物分子，這些生物分子在血小板活化后釋放并參與惡性腫瘤的進(jìn)展。NSCLC患者外周血中TEPs可能處于“半激活”狀，這就使得血小板容易被腫瘤細(xì)胞激活或者聚集[13-14]，激活后的血小板可能改變了原有的miRNA序列，使其與健康人、良性結(jié)節(jié)之間的miRNA存在表達(dá)差異，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)并分析miRNA表達(dá)差異序列，就有可能區(qū)分早期NSCLC與健康人、良性結(jié)節(jié)。

2 TEPs應(yīng)用

血液的液體活檢是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，已有部分應(yīng)用于臨床，具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)早期發(fā)現(xiàn)癌癥(篩查)；(2)確定個(gè)性化治療的新靶點(diǎn)；(3)預(yù)處理治療反應(yīng)；(4)早期治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)和“實(shí)時(shí)”評(píng)估治療效果；(5)早期發(fā)現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)[10,15]。其中TEPs具有數(shù)量大、易提取、擁有大量RNA等特點(diǎn)，在NSCLC的早期診斷領(lǐng)域具有深入研究?jī)r(jià)值。

2.1 TEPs RNA與NSCLC目前臨床上肺部常用的早篩方法存在較多局限，而基于血液的TEPs具有微創(chuàng)性、重復(fù)取樣可能性、較低成本等優(yōu)點(diǎn)[16]，且大量研究提出TEPs檢測(cè)早期NSCLC有較高的檢出率。2015年Best等[17]首次使用Thrombo-Seq技術(shù)評(píng)估腫瘤患者與健康人的TEPs mRNA表達(dá)譜，以96%的準(zhǔn)確率區(qū)分癌癥患者和健康人。在6種腫瘤類(lèi)型(NSCLC、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝膽癌和胰腺癌)中正確地確定了腫瘤的位置，準(zhǔn)確率為71%。之后，該團(tuán)隊(duì)證明了粒子群優(yōu)化算法(PSO)能使早期和晚期NSCLC的TEP檢測(cè)準(zhǔn)確率提高至81%、88%，并獨(dú)立于個(gè)體年齡、吸煙習(xí)慣、全血儲(chǔ)存時(shí)間，PSO算法對(duì)NSCLC診斷的準(zhǔn)確性隨著樣本的增加而提高，與年齡、吸煙狀況、血液儲(chǔ)存以及各種炎癥狀態(tài)無(wú)關(guān)[18]。在此團(tuán)隊(duì)之后，其他團(tuán)隊(duì)也證實(shí)了檢測(cè)TEPs的RNA序列在NSCLC早期篩查中的應(yīng)用。Sheng等[19]通過(guò)分析NSCLC患者和健康對(duì)照組TEP-RNA的測(cè)序數(shù)據(jù)，鑒定了48個(gè)TEP生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物可以準(zhǔn)確篩查出NSCLC患者；Zhang等[20]應(yīng)用RNA-seq檢測(cè)健康人和NSCLC患者的血小板，結(jié)果顯示血小板RNA-Seq在區(qū)分腫瘤組織學(xué)類(lèi)型方面具有診斷潛力。由此可見(jiàn)，TEP-RNAs可作為腫瘤的生物標(biāo)志物，且在NSCLC的早期診斷中的地位越來(lái)越重要，是個(gè)體化治療的基礎(chǔ)之一。

盡管上訴研究已經(jīng)闡明了TEPs轉(zhuǎn)錄組在NSCLC中的應(yīng)用——通過(guò)分析TEPs mRNA表達(dá)譜，以較高的準(zhǔn)確率區(qū)分癌癥患者和健康人，但大多數(shù)研究包含過(guò)多晚期病人，且對(duì)照組只選擇健康人，或無(wú)良性對(duì)照組，重點(diǎn)在于區(qū)分健康人和NSCLC患者，對(duì)于結(jié)節(jié)的良惡性并沒(méi)有給出明確依據(jù)。而隨著科技進(jìn)步，人們健康意識(shí)的提高，越來(lái)越多的人通過(guò)體檢發(fā)現(xiàn)肺部存在結(jié)節(jié)，其中有大部分結(jié)節(jié)，臨床上也無(wú)法準(zhǔn)確判斷其良、惡性。據(jù)報(bào)道肺結(jié)節(jié)診斷或治療學(xué)手術(shù)中有30%~50%的術(shù)后病理診斷為良性[21-22]，從而導(dǎo)致不必要的手術(shù)，造成醫(yī)療資源浪費(fèi)，家庭社會(huì)負(fù)擔(dān)加重。因此，篩查出肺部結(jié)節(jié)的良、惡性才是目前研究的重點(diǎn)難點(diǎn)。

2.2 miRNA與NSCLCmiRNA是一類(lèi)內(nèi)源性的、單鏈的、小的非編碼RNA分子(21~25個(gè)核苷酸)，對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)至關(guān)重要[23-25]，相對(duì)穩(wěn)定、體積小、基因表達(dá)調(diào)控顯著是miRNA區(qū)別于mRNA的獨(dú)特特征，是一種新的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[26]，miRNA被發(fā)現(xiàn)在NSCLC中經(jīng)常失調(diào)，并且與NSCLC的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[27-28]。因此，miRNA被認(rèn)為是診斷NSCLC的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。

近年來(lái)對(duì)miRNA的研究如雨后春筍般快速進(jìn)步，越來(lái)越多證據(jù)證明miRNA是診斷癌癥的重要標(biāo)志物來(lái)源。其中Chen等[29]在400例NSCLC患者和220例對(duì)照組中，從全基因組血清miRNA表達(dá)譜中鑒定10種血清miRNA作為非小細(xì)胞NSCLC診斷新的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物；此外，Akanksha Khandelwal等[30]通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NSCLC患者血漿樣本中的miRNA，結(jié)果表明miR-590-5p通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3通路在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用，可能作為NSCLC診斷的有用生物標(biāo)志物，并作為NSCLC治療的潛在靶點(diǎn)；Zhang等[31]通過(guò)qRT-PCR分析了81例NSCLC患者肺腫瘤組織及其配對(duì)的非腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行miRNA和mRNA芯片分析，結(jié)果提示miRNA可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，可能是NSCLC的有效診斷標(biāo)志物。上述研究提供了可靠的證據(jù)，證明miRNA譜的改變可能使miRNA成為腫瘤早期診斷可靠生物標(biāo)志物。而有部分研究表示miRNA已被證明是NSCLC早期檢測(cè)的可靠生物標(biāo)志物[32-33]。盡管研究中的miRNAs來(lái)源各不相同，但均需提取出穩(wěn)定的RNA，不可否認(rèn)的是，在外周血中也可檢測(cè)到穩(wěn)定形式的腫瘤相關(guān)miRNA，且TEPs中的miRNA更穩(wěn)定、含量高、且不易受到酶的影響。因此,TEPs轉(zhuǎn)錄組miRNA有望成為NSCLC高危人群早期篩查的重要生物標(biāo)志物。

此外，Xing等[34]證實(shí)血小板RNA測(cè)序可以識(shí)別用于NSCLC檢測(cè)的TEP生物標(biāo)志物，用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)對(duì)NSCLC患者、良性肺結(jié)節(jié)和健康對(duì)照者進(jìn)行檢測(cè)，提取和檢測(cè)血小板轉(zhuǎn)錄組不僅可以區(qū)分癌癥患者和健康人，而且還可以進(jìn)一步區(qū)分鱗癌和腺癌、區(qū)分癌癥和良性結(jié)節(jié)。而Florczuk等[35]從循環(huán)外顯體分離的miRNAs作為區(qū)分肺腺癌和肉芽腫的標(biāo)志物更是為miRNA區(qū)分肺結(jié)節(jié)的良、惡性提供可靠依據(jù)。相較于外顯體，血小板在提取技術(shù)上較完善、提取方法也較為簡(jiǎn)單，且擁有大量RNA，有研究表明含有大量的動(dòng)態(tài)mRNA的血小板可應(yīng)用于腫瘤的診斷[36-37]。因此，基于血小板轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)的液體活檢具有數(shù)量大、易提取等特點(diǎn)，在腫瘤的診斷領(lǐng)域具有深入研究?jī)r(jià)值。

3 展望

肺癌是目前世界上死亡率較高的惡性腫瘤，我國(guó)第三次死因回顧調(diào)查顯示肺癌居于癌癥死亡原因首位，在高危人群中開(kāi)展肺癌篩查有益于發(fā)現(xiàn)早期肺癌，提高NSCLC的生存率。歐洲肺癌篩查試驗(yàn)最新研究顯示，通過(guò)低劑量螺旋CT(LDCT)篩查，男性NSCLC死亡率降低24%，女性NSCLC死亡率降低33%[38]，總的來(lái)說(shuō)，LDCT篩查顯著提高了Ⅰ期NSCLC的檢出率，降低了NSCLC死亡率。臨床上常用的生物標(biāo)志物在晚期診斷中比早期更準(zhǔn)確，而IA期NSCLC患者5年生存率約為80%，Ⅲ期NSCLC患者5年生存率僅為20%左右，因此，在發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)之后，能否通過(guò)非手術(shù)方法有效的發(fā)現(xiàn)其良、惡性，是亟待解決的問(wèn)題。

近5年，關(guān)于各類(lèi)腫瘤液體活檢的研究顯著增加，液體活檢檢測(cè)的主要成分包括循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、細(xì)胞外囊泡(EVs)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，以及TEPs等，但研究表明在高度侵襲性的NSCLC患者血液中CTC和ct-DNA含量非常低，特別是在早期NSCLC患者的血液中含量更低。而基于外泌體診斷NSCLC的研究也是如火如荼，已取得一定成績(jī)，但提取方法過(guò)于復(fù)雜，臨床推廣性較差。TEPs作為新型液體活檢來(lái)源，相對(duì)于其他液體活檢來(lái)源來(lái)說(shuō)，具有豐度高、易分離、易儲(chǔ)存、易檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，且其中的RNA受到血小板的保護(hù)，比較穩(wěn)定，不易受內(nèi)源性RNA酶的影響[39]，因此TEPs轉(zhuǎn)錄組中miRNA在肺結(jié)節(jié)的性質(zhì)診斷方面有著巨大的潛力。在前期工作中，研究團(tuán)隊(duì)收集了部分NSCLC以及肺良性結(jié)節(jié)、正常健康人血小板，并提取總RNA檢測(cè)miRNA譜，發(fā)現(xiàn)肺腺癌與肺良性結(jié)節(jié)在部分區(qū)域表達(dá)有著顯著差異[40]，從而說(shuō)明血小板轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)準(zhǔn)物具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

TEPs為區(qū)分癌組織和非癌組織的潛在生物標(biāo)志物提供了一個(gè)有前途的新來(lái)源，這也是未來(lái)基于血液的生物標(biāo)志物研究中能夠進(jìn)一步擴(kuò)展的。隨著人們健康意識(shí)不斷提高，肺部結(jié)節(jié)也不斷被發(fā)現(xiàn)，為了減少社會(huì)及家庭負(fù)擔(dān)，避免醫(yī)療資源浪費(fèi)，明確肺部結(jié)節(jié)的性質(zhì)是目前亟待解決的問(wèn)題。目前許多關(guān)于miRNA的研究依然不少，然而，miRNA在臨床上進(jìn)行診斷的應(yīng)用卻不容樂(lè)觀，主要原因是不同研究之間缺乏可重復(fù)性，而這種不一致的原因可能是血小板miRNAs水平的個(gè)體間變異；另外，由于病例數(shù)量有限，現(xiàn)仍缺少大規(guī)模研究。為使miRNA能更廣泛應(yīng)用于臨床，需要提升檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和特異性、擴(kuò)大臨床試驗(yàn)規(guī)模。