辛?xí)苑迹瑒⑻亟?，張公?/p>

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，廣東 中山 528401；2.廣東藥科大學(xué)，廣東 中山 528458）

槐花顆粒為廣東省中山市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由槐花、野菊花、甘草組成，具有涼血止血、清肝瀉火的功效，主要用于治療便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、肝熱目赤、頭痛、眩暈等，臨床療效顯著?；被w粒目前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)過于簡(jiǎn)單，無法全面反映和控制產(chǎn)品的質(zhì)量。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）已廣泛應(yīng)用于中藥及復(fù)方制劑的質(zhì)控研究［1-4］，通過中藥有效成分內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，以藥材中對(duì)照品廉價(jià)易得的典型成分為內(nèi)標(biāo)，建立該成分與其他成分間的相對(duì)校正因子，再通過校正因子同步計(jì)算出其他成分的量，從而實(shí)現(xiàn)多成分的同步測(cè)定。為了提高制劑質(zhì)量，本研究采用一測(cè)多評(píng)法建立槐花顆粒的多成分質(zhì)控模式，為該制劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Waterse 2695高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX RX-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；色譜柱Merck Purospher STARRP-18 endcapped（4.6 mm×250 mm，5 μm，德國默克公司）；醫(yī)用離心機(jī)2-16R（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；SQP型Sartorius天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］。

1.2 試藥對(duì)照品綠原酸（批號(hào)110753-202018）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201811）、甘草苷（批號(hào)111610-201908）、木犀草苷（批號(hào)111720-201810）、蒙花苷（批號(hào)111528-201911）、木犀草素（批號(hào)111520-202006）、槲皮素（批號(hào)100081-201610），均購于中國藥品生物制品檢定所；乙腈（色譜純），甲醇（分析純）；槐花顆粒（粵 藥 制 備 字Z20200038000，批 號(hào)20001、20002、20003、20004、21001、21002），由廣東省中山市中醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容至50 ml，制成質(zhì)量濃度分別 為0.021 0 mg/ml、0.450 0 mg/ml、0.210 0 mg/ml、0.020 0 mg/ml、0.092 5 mg/ml、0.212 5 mg/ml、0.075 0 mg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用封口膜封口并避光保存。

2.2 供試品溶液的制備取同一批號(hào)的槐花顆粒5 g，加入70%乙醇（固液比1∶20）在80℃水浴中加熱，索氏提取法抽提4 h，待提取液冷卻后過濾，除去提取液中的藥材粉末，分批將濾液置于同一蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移到棕色容量瓶中并定容至50 ml，取定容后的試液少許，以轉(zhuǎn)速13 500 r/min離心15 min，取上清液1 ml置于10 ml棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得供試品溶液，用封口膜封口并避光保存。

2.3 陰性溶液的制備按槐花顆粒制劑的配制工藝分別制成缺槐花、缺野菊花、缺甘草的陰性顆粒。然后按上述2.2提取方法，分別制備出甘草陰性樣品溶液、槐花陰性樣品溶液、野菊花陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，10%～19%乙腈洗脫；20～30 min，19%～20%乙腈洗脫；30～50 min，20%～21%乙腈洗脫；50～85 min，21%～60%乙腈洗脫；85～95 min，10%乙腈洗脫；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：334 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μl。在上述色譜條件下，混合對(duì)照品和供試品中綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素分離良好，且蘆丁峰的理論塔板數(shù)不低于3 000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0 ml、2.0 ml、4.0 ml、6.0 ml、8.0 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋并定容，制得系列混合對(duì)照品溶液。將系列混合對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定其峰面積。以混合對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/ml），測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)r2，結(jié)果r2均大于0.999，顯示進(jìn)樣濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 槐花顆粒中7種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密性試驗(yàn)取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）依次為1.03%、0.99%、1.03%、1.03%、1.03%、1.02%、1.03%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批供試品（批號(hào)20004）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，再按“2.4”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的濃度分別為7.8 μg/ml、329.5 μg/ml、71.2 μg/ml、6.9 μg/ml、41.1 μg/ml、6.4 μg/ml、47.1 μg/ml，RSD分別為1.00%、1.03%、1.02%、1.03%、1.00%、1.02%、1.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批供試品（批號(hào)20004），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的峰面積RSD依次為1.03%、1.03%、1.04%、1.04%、1.00%、1.01%、1.04%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)分別精密稱取綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、槲皮素、木犀草素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定容至10 ml，制成質(zhì)量濃度分 別 為1.950 mg/ml、65.016 mg/ml、15.080 mg/ml、1.740 mg/ml、9.500 mg/ml、1.506 mg/ml、10.500 mg/ml的混合對(duì)照品溶液。精密稱定9份已測(cè)定的槐花顆粒樣品（批號(hào)20004）2.5 g，分為低、中、高3組（分別加入0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml的混合對(duì)照品溶液），每組平行制備3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的平均回收率，各成分平均回收率分別為98.89%、98.69%、98.49%、98.11%、98.21%、98.33%、98.30%，RSD依次為1.53%、0.98%、0.69%、0.88%、1.37%、0.62%、0.81%（n=9），表明該方法的準(zhǔn)確性良好。

2.6 QAMS法

2.6.1 相對(duì)校正因子（fS/I）的測(cè)定取“2.5.1”項(xiàng)數(shù)據(jù)，以蘆丁為內(nèi)參物（S），按公式fS/I＝（AS×CI）/（AI×CS）計(jì)算，AI、CI分別為待測(cè)成分對(duì)照品的峰面積和質(zhì)量濃度，AS、CS分別代表內(nèi)參物的峰面積和質(zhì)量濃度。計(jì)算綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的RSD分別為1.73%、2.71%、2.45%、2.26%、2.53%、1.64%，結(jié)果見表2。

表2 以蘆丁為內(nèi)參物的fS/I測(cè)定結(jié)果

2.6.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

2.6.2.1 不同儀器對(duì)fS/I的影響試驗(yàn)考察了2種高效液相色譜系統(tǒng)Agilent 1 260高效液相色譜儀和Waterse 2 695高效液相色譜儀對(duì)槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結(jié)果顯示RSD依次為1.47%、1.19%、1.26%、0.65%、1.38%、0.73%，結(jié)果見表3。表明不同儀器對(duì)各成分的fS/I無顯著性差異。

表3 不同儀器對(duì)fS/I的影響

2.6.2.2 不同色譜柱對(duì)fS/I的影響試驗(yàn)考察了4種色譜柱Merck Purospher STARRP-18 endcapped、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18、Agilent ZORBAX RX-C18、Agilent ZORBAX SB-C18對(duì)槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結(jié)果顯示RSD依次為1.00%、1.61%、1.99%、0.79%、1.94%、0.42%，結(jié)果見表4。表明不同色譜柱對(duì)各成分的fS/I無顯著性差異。

表4 不同色譜柱對(duì)fS/I的影響

2.6.2.3 不同柱溫對(duì)fS/I的影響試驗(yàn)考察了同一色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18）不 同 柱 溫（20℃、25℃、30℃、35℃）對(duì)槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結(jié)果顯示RSD依次為0.88%、0.77%、1.20%、0.39%、1.16%、0.66%，結(jié)果見表5。表明不同柱溫對(duì)各成分的fS/I無顯著性差異。

表5 不同柱溫對(duì)fS/I的影響

2.6.2.4 不同操作人員對(duì)fS/I的影響試驗(yàn)考察了3名試驗(yàn)人員對(duì)槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結(jié)果顯示RSD依次為0.50%、0.63%、0.98%、0.39%、1.18%、0.23%，結(jié)果見表6。表明不同試驗(yàn)人員對(duì)各成分的fS/I無顯著性差異。

表6 不同試驗(yàn)人員對(duì)fS/I的影響

2.6.2.5 不同流速對(duì)fS/I的影響試驗(yàn)考察了3種流速（0.8 ml/min、1 ml/min、1.2 ml/min）對(duì)槐花顆粒中6種有效成分綠原酸、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)校正因子fS/A、fS/B、fS/C、fS/D、fS/E、fS/F的影響，結(jié)果顯 示RSD依 次 為0.80%、1.39%、0.92%、0.39%、1.21%、0.33%，結(jié)果見表7。表明不同流速對(duì)各成分的fS/I無顯著性差異。

2.6.3 色譜峰定位參數(shù)考察利用相對(duì)保留時(shí)間（rI/S）進(jìn)行峰定位，r（I/S）=tR（I）/tR（S）（注：I為待測(cè)成分，S為內(nèi)參物），測(cè)得綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素的相對(duì)保留時(shí)間（rI/S）的結(jié)果，見表8。不同色譜條件所的到相對(duì)保留值變動(dòng)較小，rA/S、rB/S、rC/S、rD/S、rE/S、rF/S的RSD（%）均＜2%，表明采用rI/S對(duì)綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素進(jìn)行色譜峰的定位良好。

表8 不同儀器和色譜柱測(cè)得的相對(duì)保留時(shí)間

2.6.4 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較取6批次的樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，分別采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算各批次樣品中綠原酸、蘆丁、甘草苷、木犀草苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素含量，并采用t檢驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果見表9。結(jié)果顯示，兩組數(shù)據(jù)的方差無顯著性差異（P＞0.05），表明兩種方法計(jì)算的含量無顯著性差異，一測(cè)多評(píng)法用于槐花顆粒的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)研究是可行的。

表9 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較 （mg/g）

3 討 論

3.1 準(zhǔn)確度的判斷判斷QAMS法的準(zhǔn)確度，大多是將外標(biāo)法實(shí)測(cè)值與QAMS法計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)后進(jìn)行評(píng)價(jià)，如果2種方法測(cè)定結(jié)果無顯著性差異，則說明QAMS法是準(zhǔn)確的。如黃帥等［5］在應(yīng)用QAMS法測(cè)定柴胡藥材中幾種不同皂苷的含量時(shí)，采用t檢驗(yàn)法來評(píng)價(jià)QAMS法的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。另外，還可以利用夾角余弦算法來證明QAMS法計(jì)算結(jié)果與外標(biāo)法有無顯著性差異，陳馳等［6］在應(yīng)用QAMS法測(cè)定人參中不同人參皂苷的含量時(shí)就是采用夾角余弦算法來進(jìn)行驗(yàn)證。t檢驗(yàn)法較夾角余弦算法更簡(jiǎn)單易行，且認(rèn)可度較高，因此，本文采用t檢驗(yàn)法對(duì)QAMS法和外標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行精準(zhǔn)度的判斷。

3.2 內(nèi)參物的選擇研究發(fā)現(xiàn)，槐花顆粒中的綠原酸具有抑菌、抗氧化、抗病毒等作用［7］；蘆丁具有維生素P樣作用和抗菌抗炎等作用［8］；甘草苷具有抗抑郁、保護(hù)神經(jīng)、保肝、抗氧化等作用［9］；木犀草苷具有呼吸系統(tǒng)及心腦血管保護(hù)作用、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等作用［10］；蒙花苷具有抗衰老、抗缺氧和促進(jìn)凝血等作用［11］；木犀草素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏等作用［12］；槲皮素具有抗氧化、清除自由基和免疫調(diào)節(jié)等作用［13］。所以本試驗(yàn)選取上述7種成分為目標(biāo)化合物，且上述成分含量相對(duì)較高，能作為槐花顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。其中蘆丁化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在槐花顆粒處方中含量較高，且蘆丁易于制備，價(jià)格便宜，將其作為內(nèi)參物時(shí)，相對(duì)校正因子較穩(wěn)定，能體現(xiàn)QAMS法操作便捷、成本低以及效率高的特點(diǎn)，故選擇蘆丁為內(nèi)參物。

3.3 QAMS法對(duì)待測(cè)色譜峰定位的重現(xiàn)性考察參考相關(guān)文獻(xiàn)［14-16］，本試驗(yàn)通過考察不同品牌的高效液相色譜儀和色譜柱中各待測(cè)成分與蘆丁內(nèi)參物rI/S的重現(xiàn)性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，可通過蘆丁與槐花顆粒中另外6種成分的相對(duì)保留時(shí)間來實(shí)現(xiàn)色譜峰定位，且相對(duì)保留時(shí)間的測(cè)定經(jīng)常用于色譜研究中，重現(xiàn)性可靠，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)。

本試驗(yàn)建立的一測(cè)多評(píng)法適用于槐花顆粒中7種有效成分的含量測(cè)定，相對(duì)校正因子穩(wěn)定；該法不僅節(jié)約檢測(cè)成本、縮短檢測(cè)時(shí)間，而且簡(jiǎn)化了槐花顆粒的定量檢測(cè)方法，具有很強(qiáng)的實(shí)用性，可為槐花顆粒后續(xù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。