◆作者：譚文俊，張文，歐豪，潘杰華，向健

◆單位：清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司

嗜酸乳桿菌（Lactobacilus acidophilus）屬于乳桿菌屬，革蘭氏陽性桿菌，是一種重要的益生菌，其形態(tài)多數(shù)呈現(xiàn)細(xì)長桿狀，分布較雜亂，以單個(gè)、成雙或短鏈出現(xiàn)，菌落邊緣較粗糙且不規(guī)則，通常呈中間向兩邊放線狀分布，顏色較透明。嗜酸乳桿菌具有改善腸道健康、調(diào)節(jié)免疫、減輕肥胖、治療腸道疾病等眾多益生功能。眾多試驗(yàn)研究證明了嗜酸乳桿菌對(duì)治療腹瀉和縮短腹瀉時(shí)間有一定的功效，能夠很好地定殖于動(dòng)物腸道，有效抑制致病菌的生長，調(diào)節(jié)宿主的菌群平衡。在其生長過程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)病原菌和腐敗菌有一定的拮抗作用的代謝產(chǎn)物，能夠有效地抑制體內(nèi)有害微生物的生長和繁殖以及毒素的分泌，起到平衡宿主腸道微生物菌群的作用，從而治療由致病菌引起的腹瀉。嗜酸乳桿菌在食品、藥品及飼料添加劑中均有應(yīng)用，市場(chǎng)需求巨大。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為嗜酸乳桿菌LA-Y26高密度培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種、試劑和設(shè)備

1.1.1 菌種和試劑

菌種：嗜酸乳桿菌LA-Y26，分離自健康育肥豬腸道菌群，由本實(shí)驗(yàn)室保藏；MRS培養(yǎng)基：按照GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》方法配置；無水葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠；乳糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；甘露糖：阿拉丁試劑（上海）有限公司；麥芽糖漿：廣州雙橋股份有限公司；蔗糖：市售；蛋白胨；大豆蛋白胨；胰蛋白胨；牛肉浸粉；酵母提取粉均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 設(shè)備

電子天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1菌種活化

將嗜酸乳桿菌LA-Y26凍干管接入MRS液體培養(yǎng)基中，37.0℃培養(yǎng)20h，活化二代；

1.2.2 種子培養(yǎng)

將活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)5.0%接種到裝有200mL MRS培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37.0℃培養(yǎng)20h。

1.2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養(yǎng)基優(yōu)化

以MRS液體培養(yǎng)基為起始培養(yǎng)基，選擇添加量均為10.0g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖、甘露糖作為碳源，進(jìn)行碳源優(yōu)化試驗(yàn)；選擇添加量均為10.0g/L的大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉作為氮源，進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗(yàn)；選擇添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸進(jìn)行促生長因子優(yōu)化試驗(yàn)。在三角瓶中進(jìn)行試驗(yàn)，37.0℃培養(yǎng)20h進(jìn)行發(fā)酵液活菌計(jì)數(shù)，初步確定培養(yǎng)基成分。

在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，選擇最佳碳源、氮源、促生長因子進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳碳源、氮源、促生長因子的最佳添加量。

1.2.4 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

在上述正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察不同接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26生長情況的影響，確定較優(yōu)的三角瓶培養(yǎng)條件。

1.2.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵罐驗(yàn)證

在20L規(guī)模發(fā)酵罐進(jìn)行小試試驗(yàn)，將種子接種至裝有12L培養(yǎng)基的20L發(fā)酵罐中，按照1.2.4最優(yōu)條件進(jìn)行培養(yǎng)，取樣檢測(cè)活菌數(shù)，驗(yàn)證優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果和分析

2.1 嗜酸乳桿菌LA-Y26培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基中主要的能量來源，充足的碳源有利于菌體的生長。由圖1可見，MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖漿、乳糖和甘露糖為碳源的培養(yǎng)基種，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)量分別為2.7×108、4.1×108、3.8×108、3.6×108、4.9×108、3.2×108CFU/mL。以乳糖為碳源的培養(yǎng)基，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，葡萄糖、蔗糖次之。

圖1 不同碳源對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料，用于菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物的合成，充足且易于利用的氮源有利于細(xì)胞快速分裂。由圖2可見，MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，以大豆蛋白胨、酶水解酪蛋白、豆粕提取物、乳清粉、菊粉為氮源的培養(yǎng)基中，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)分別為2.9×108、5.3×108、4.7×108、3.8×108、4.3×108、3.6×108CFU/mL。以大豆蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，酶水解酪蛋白、乳清粉次之。

圖2 不同氮源對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.1.3 促生長因子優(yōu)化結(jié)果

嗜酸乳桿菌依賴于培養(yǎng)基提供某些生長必需的維生素、氨基酸，在培養(yǎng)基中添加促生長因子，可提高氮源利用率，促進(jìn)嗜酸乳桿菌生長。由圖3可見，MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，添加量為1.0g/L的葉酸、生物素、維生素B1、天冬氨酸、賴氨酸時(shí)，嗜酸乳桿菌活菌數(shù)分別為3.0×108、4.7×108、5.5×108、4.2×108、6.1×108、5.6×108CFU/mL。以天冬氨酸為促生長因子時(shí)，嗜酸乳桿菌生長狀態(tài)明顯優(yōu)于其他成分的培養(yǎng)基，賴氨酸、生物素次之。

圖3 促生長因子對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乳糖、大豆蛋白胨、天冬氨酸進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，考察碳源、氮源及促生長因子對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26生長的影響。由表1可見，乳糖、大豆蛋白胨及天冬氨酸的影響順序?yàn)槿樘牵咎於彼幔敬蠖沟鞍纂?，較優(yōu)組合為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，按照最優(yōu)組合進(jìn)行三角瓶培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)35.7×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)

2.3 嗜酸乳桿菌LA-Y26三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 接種量?jī)?yōu)化

根據(jù)上述正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果配置培養(yǎng)基，分別按1.0%、3.0%、5.0%、10.0%接種量接種，37.0℃培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計(jì)數(shù)。由表2可見，當(dāng)接種量在3.0%時(shí)，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)37.5×108CFU/mL。

表2 不同接種量對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.2 初始pH值優(yōu)化

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0，按3.0%接種量接種，37.0℃培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計(jì)數(shù)。由表3可見，當(dāng)初始pH值在6.0時(shí)，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)42.7×108CFU/mL。

表3 不同初始pH值對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度優(yōu)化

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，按初始pH值6.0，3.0%接種量接種，調(diào)整培養(yǎng)溫度為28.0℃、32.0℃、37.0℃、42.0℃，培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計(jì)數(shù)。由表4可見，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37.0℃時(shí)，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)43.9×108CFU/mL。

表4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)嗜酸乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.4 轉(zhuǎn)速優(yōu)化

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養(yǎng)溫度37.0℃，調(diào)整轉(zhuǎn)速為0、50、100、200r/min，培養(yǎng)20h，發(fā)酵液在MRS瓊脂涂布計(jì)數(shù)。由表5可見，當(dāng)轉(zhuǎn)速為50r/min時(shí)，嗜酸乳桿菌LA-Y26發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)63.1×108CFU/mL。

表5 不同轉(zhuǎn)速對(duì)失算乳桿菌LA-Y26活菌數(shù)的影響

2.3.5 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，按初始pH6.0，3.0%接種量，培養(yǎng)溫度37.0℃，轉(zhuǎn)速50r/min，間隔2h取樣檢測(cè)發(fā)酵液OD600nm及活菌數(shù)，考察嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養(yǎng)時(shí)間。由圖4可見，隨培養(yǎng)時(shí)間不斷增加，發(fā)酵液的OD600nm值和活菌數(shù)同步呈上升趨勢(shì)，培養(yǎng)6h嗜酸乳桿菌LA-Y26進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)20h后進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，發(fā)酵液的OD600nm及活菌數(shù)均呈略微下降趨勢(shì)，因此嗜酸乳桿菌LA-Y26最佳培養(yǎng)時(shí)間為20h。

圖4 嗜酸乳桿菌LA-Y26生長曲線及活菌數(shù)

2.4 20L發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果

在20L發(fā)酵罐中，配置MRS培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基，按照相同的優(yōu)化條件培養(yǎng)嗜酸乳桿菌LA-Y26。結(jié)果表明，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)，嗜酸乳桿菌LAY26在20L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)82.1×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的40倍。

3 結(jié)論

本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)了嗜酸乳桿菌LA-Y26的高密度培養(yǎng)，優(yōu)化后培養(yǎng)基為乳糖20.0g/L，大豆蛋白胨20.0g/L，天冬氨酸1.5g/L，吐溫80 1.0mL/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸三銨2.0g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸錳0.05g/L；培養(yǎng)條件為初始pH6.0，接種量3.0%，溫度37.0℃，轉(zhuǎn)速50r/min，培養(yǎng)時(shí)間20h。在20L發(fā)酵罐中進(jìn)行多次驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)82.1×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的40倍。按優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行多次500L、1000L發(fā)酵罐試驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵液活菌數(shù)比優(yōu)化前水平有大幅度提升。

參考文獻(xiàn)：（略）