許建春，汪浩鑫，自永宏，楊小芬，閆 茜，陳夢(mèng)佳，石德順，陸鳳花

(廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004)

卵母細(xì)胞體外成熟是進(jìn)行體外胚胎生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)胚胎生物技術(shù)的發(fā)展起著重要的作用。目前，卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)存在成熟率低和發(fā)育能力差等諸多問題，極大地阻礙了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。與體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞相比，體外成熟的卵母細(xì)胞往往會(huì)出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象。這可能是因?yàn)樵隗w外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化敏感，且離體培養(yǎng)的環(huán)境與內(nèi)部環(huán)境之間存在一定差異，比如體外環(huán)境產(chǎn)生的活性氧、培養(yǎng)液成分、O2濃度、光照、溫度和pH值等都會(huì)影響卵母細(xì)胞正常發(fā)育[1-4]。卵母細(xì)胞的質(zhì)量與胚胎發(fā)育潛能存在密切聯(lián)系，高質(zhì)量的卵母細(xì)胞有利于正常受精及胚胎后續(xù)發(fā)育[5]。在眾多影響卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量的因素中，導(dǎo)致卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力改變的一個(gè)重要因素就是活性氧(ROS)的產(chǎn)生?；钚匝踝鳛橹饕拇傺趸瘎?，可以導(dǎo)致DNA損傷、線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化等，從而使卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，阻礙其后續(xù)發(fā)育。因此，如何提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量顯得格外重要。蝦青素是一種紅色的類胡蘿卜素，對(duì)多種細(xì)胞系具有抗氧化和抗炎作用，可以抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和一些相關(guān)疾病的發(fā)生。蝦青素可以保護(hù)線粒體免受內(nèi)源性氧自由基的侵害，保持其氧化還原能力，從而提高其能量產(chǎn)生效率。蝦青素在牛卵母細(xì)胞體外成熟中和其他細(xì)胞系上的研究有見報(bào)道。然而，蝦青素對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響報(bào)道較少。本研究主要通過在豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基中添加一定濃度的蝦青素，以探討其對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟及早期胚胎發(fā)育的影響，以期提高卵母細(xì)胞的體外成熟效率和囊胚的質(zhì)量，為豬卵母細(xì)胞和胚胎體外培養(yǎng)體系的完善提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及液體配制組織培養(yǎng)液(TCM199)和胎牛血清(FBS)購自美國(guó)Gibco公司；蝦青素購自成儀睿有限公司；活性氧檢測(cè)試劑盒(S0033)和總谷胱甘肽檢測(cè)試劑盒(S0052)購自碧云天生物技術(shù)公司；丙二醛檢測(cè)試劑盒(WLA048)購自萬類生物；卵母細(xì)胞洗液為CCM液(TCM199+5 mmol/L NaHCO3+5 mmol/L Hepes+3%發(fā)情牛血清(OCS))；胚胎培養(yǎng)液(4.75 g TCM-199+13.1 mmol/L NaHCO3+30 mg/L 青霉素+50 mg/L 鏈霉素+2.5 mmol/L Hepes+12.5 mL FBS)，攪拌均勻后調(diào)pH值為7.2～7.4；豬卵母細(xì)胞成熟液為PM液；胚胎培養(yǎng)液為NCSU-23液參照文獻(xiàn)[6]配制；離子霉素溶液(胚胎培養(yǎng)液+5 μmol/L 離子霉素)和6-DMAP溶液(胚胎培養(yǎng)液+2 mmol/L 6-DMAP)等均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，并用0.22 μm微孔濾膜過濾器除菌。微量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量試劑購自ABclonal公司。

1.2 豬卵母細(xì)胞的收集豬卵巢取自南寧市屠宰廠，將其置于盛有25～30℃生理鹽水的保溫瓶中，確保4 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。去除卵巢周圍的脂肪組織后，用注射器抽取直徑2～6 mm卵泡的卵泡液，將卵泡液置于60 mm玻璃皿中，在體視顯微鏡下挑出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用卵母細(xì)胞清洗液清洗干凈，只選取卵丘細(xì)胞層完整和胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)挑選含有3層及以上卵丘細(xì)胞包被的折光性良好的COCs，采用微滴培養(yǎng)體系(含10 IU/mL hCG+10 IU/mL PMSG)并且含有不同濃度蝦青素(0，5，10，20，40 μmol/L)的PM液培養(yǎng)。20～22 h后換成不含激素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h至細(xì)胞成熟，統(tǒng)計(jì)第一極體排出率。

1.4 孤雌胚胎的激活與培養(yǎng)孤雌胚胎采用化學(xué)法激活，成熟的卵母細(xì)胞經(jīng)0.1%透明質(zhì)酸酶處理，去除周圍包裹的卵丘細(xì)胞。挑選排出第一極體和胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞，將裸卵置于5 μmol/L的離子霉素溶液中培養(yǎng)5 min，轉(zhuǎn)移卵母細(xì)胞至2 mmol/L 6-DMAP 溶液中繼續(xù)培養(yǎng)3.5 h，然后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)盤中微滴培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，6～8 d統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.5 活性氧染色、總谷胱甘肽含量和丙二醛含量測(cè)定根據(jù)統(tǒng)計(jì)的第一極體排出率、卵裂率和囊胚率，選出最適處理濃度進(jìn)行以下試驗(yàn)。成熟培養(yǎng)后的COCs去除卵丘細(xì)胞后，PBS清洗3遍。一部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10 μmol/L DCFH-DA的PBS中，37℃避光孵育30 min。孵育后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至CCM液滴中，熒光顯微鏡下拍照。谷胱甘肽含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[7]操作方法進(jìn)行。丙二醛含量的測(cè)定參考試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 囊胚Hoechst33342染色收集第6～7天的囊胚，在不含Ca2+、Mg2+的PBS中清洗2～4遍，4%多聚甲醛(PFA)固定1 h，然后將囊胚轉(zhuǎn)移至10 g/L Hoechst33342染色工作液中，室溫條件下避光孵育10～20 min，孵育結(jié)束后用不含Ca2+、Mg2+的PBS清洗2～4遍，將染料清洗干凈。取載玻片，并在中央滴加約1 μL的抗猝滅劑，放入1枚囊胚，在蓋玻片四周涂上1圈凡士林，壓片，熒光顯微鏡下觀察染色情況，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR收集對(duì)照組和處理組不同時(shí)期的早期胚胎，將其分別移入裝有細(xì)胞裂解液的EP管中，于-80℃冰箱保存。微量反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系：2×SYBR GreenⅠMaster 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃60 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。引物是根據(jù)GenBank公布的豬胚胎抗氧化酶相關(guān)基因GPX4和SOD1的mRNA序列設(shè)計(jì),引物信息見表1。最終使用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析用Image J軟件對(duì)細(xì)胞活性氧和Hoechst染色的結(jié)果進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)，采用SPASS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，所有試驗(yàn)至少重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度蝦青素對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響卵母細(xì)胞在添加不同濃度(0,5,10,20,40 μmol/L)蝦青素的成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)40～44 h后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，蝦青素處理組的第一極體排出率均有顯著提高(P<0.05)，其中10 μmol/L處理組的第一極體排出率顯著高于其他濃度處理組(P<0.05)(表2)。

表2 蝦青素對(duì)豬卵母細(xì)胞第一極體排出率的影響

2.2 成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度蝦青素對(duì)孤雌胚胎發(fā)育效果的影響對(duì)不同濃度蝦青素處理的MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活處理，培養(yǎng)160～168 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率和囊胚率(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(0 μmol/L)相比，5，10，20 μmol/L處理組的卵裂率顯著升高(P<0.05)，40 μmol/L處理組的卵裂率有提高但無顯著性差異(P>0.05)；10，20 μmol/L處理組的囊胚率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，5，40 μmol/L 處理組的囊胚率有升高，但差異不顯著(P<0.05)；其中10 μmol/L處理組的第一極體排出率和囊胚率顯著高于其他處理組，綜合考慮，我們選擇10 μmol/L的濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表3 蝦青素對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育的影響

2.3 成熟液中添加10 μmol/L蝦青素對(duì)MⅡ期卵母細(xì)胞抗氧化能力的影響為了解蝦青素對(duì)卵母細(xì)胞抗氧化能力的影響，我們對(duì)MⅡ期的卵母細(xì)胞進(jìn)行了活性氧染色、丙二醛和谷胱甘肽檢測(cè)(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，10 μmol/L處理組卵母細(xì)胞的活性氧水平和丙二醛含量極顯著降低(P<0.01)，谷胱甘肽含量顯著升高(P<0.05)。

A.活性氧染色(標(biāo)尺：200 μm)；B.總谷胱甘肽含量檢測(cè)；C.丙二醛含量檢測(cè)。**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.4 成熟培養(yǎng)液中添加10 μmol/L蝦青素對(duì)孤雌囊胚細(xì)胞數(shù)的影響使用10 μmol/L蝦青素處理卵母細(xì)胞40～44 h后，對(duì)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，使用Hochest33342染色法統(tǒng)計(jì)囊胚細(xì)胞數(shù)。結(jié)果如圖2所示，10 μmol/L處理組的囊胚細(xì)胞數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

圖2 蝦青素處理對(duì)囊胚細(xì)胞數(shù)的影響(標(biāo)尺：200 μm)

2.5 成熟培養(yǎng)液中添加10 μmol/L蝦青素對(duì)胚胎發(fā)育過程中抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖3)，與對(duì)照組相比，GPX4基因在10 μmol/L處理組中MⅡ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在囊胚期的表達(dá)也有升高。SOD1基因在10 μmol/L處理組中MⅡ期卵母細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚期的表達(dá)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

*表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

體外培養(yǎng)系統(tǒng)的氣相環(huán)境對(duì)卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育起著關(guān)鍵的作用。氧氣作為體外培養(yǎng)系統(tǒng)氣相環(huán)境的因素之一，對(duì)胚胎新陳代謝和發(fā)育很重要。在體外20%氧氣濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體內(nèi)的低氧環(huán)境，過高的氧氣濃度會(huì)產(chǎn)生高濃度的活性氧和其他自由基，對(duì)卵母細(xì)胞造成氧化應(yīng)激[8]。ROS是細(xì)胞內(nèi)活性含氧化合物的總稱，作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信使，參與了多種增殖和分化等細(xì)胞活動(dòng)，但當(dāng)ROS產(chǎn)生超過細(xì)胞的抗氧化能力時(shí)則會(huì)造成氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體損傷，可導(dǎo)致酶類失活、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、ATP消耗和線粒體功能紊亂。研究表明，氧化應(yīng)激與卵母細(xì)胞質(zhì)量下降、體外受精率降低和妊娠率降低有著密切聯(lián)系[9-12]。針對(duì)這一問題，科研人員通過在培養(yǎng)基中添加酶類或非酶類的抗氧化劑，能夠有效降低卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，提高卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量和后續(xù)的胚胎發(fā)育[13-15]。蝦青素是一種類胡蘿卜素，主要來源于藻類和微生物，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。此外蝦青素還具有抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用[16-17]。然而，蝦青素是否影響卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過在成熟液中添加不同濃度的蝦青素，處理44 h后發(fā)現(xiàn)其可以提高卵母細(xì)胞的第一極體排出率、分裂率和囊胚率，其中以10 μmol/L蝦青素處理組效果顯著，說明適當(dāng)濃度的蝦青素有利于豬卵母細(xì)胞的體外成熟和后續(xù)的胚胎發(fā)育。

研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素處理可降低組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性[18]。與其他的抗氧化劑相比，蝦青素有更強(qiáng)的去除自由基能力，同時(shí)還可有效降低過氧化氫刺激引起的細(xì)胞凋亡[19-20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10 μmol/L 蝦青素可以極顯著降低卵母細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平和丙二醛含量，顯著提高總谷胱甘肽的含量，進(jìn)一步說明了蝦青素能夠降低卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，改善卵母細(xì)胞的成熟質(zhì)量。

總之，在豬卵母細(xì)胞體外成熟液中添加適量的蝦青素能有效降低卵母細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和丙二醛含量，提高總谷胱甘肽含量并促進(jìn)抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞成熟的質(zhì)量及其后續(xù)孤雌胚胎的發(fā)育能力。