姜 鯤,劉 爽,李江波，朱先鵬,于清平,鄧旭明,呂強(qiáng)華*

(1.吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2.吉林金梓源生物科技有限公司，吉林 四平 136400；3.吉林省遼源市西安區(qū)農(nóng)林水利工程總站，吉林 遼源 136200；4.吉林省柳河縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化 135300；5.吉林省通化縣農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法大隊，吉林 通化 134100)

沙門菌(Salmonella)一直是歐盟第二大常見的人畜共患病病原菌，作為一種兼性厭氧革蘭陰性菌，它在自然界分布廣泛，大多數(shù)來源于動物性食品[1]。目前，沙門菌主要分為邦戈沙門菌(S.bongori)和腸道沙門菌(S.enterica)2個種屬，腸道亞種(enterica)、薩拉姆亞種(salamae)、亞利桑那亞種(arizonae)、雙亞利桑那亞種(diarizonae)、豪頓亞種(houtenae)和印度亞種(indica)等6個亞種，血清型共計超過2 600種[2]。沙門菌感染畜禽后可導(dǎo)致胃腸炎、傷寒、副傷寒和系統(tǒng)性感染等，嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3]。沙門菌感染人類主要以急性腸胃炎為主，伴有發(fā)熱、發(fā)冷、惡心、頭痛、全身乏力、嘔吐和腹瀉等癥狀[4]。據(jù)報道，法國每年發(fā)生的食源性感染病例約50%來源于沙門菌；美國非傷寒沙門菌每年可導(dǎo)致約120萬人患病，2萬人住院治療和約450人死亡[5]。2013―2017年，歐洲國家因食用受污染的蛋制品和禽肉而引發(fā)的腸炎沙門菌病例不斷增加，給畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生健康和食品安全[6]。

如何有效地防制沙門菌污染和感染成為當(dāng)前需要迫切解決的問題。盡管抗生素、噬菌體和疫苗等手段可在一定程度上控制沙門菌感染，但多藥耐藥和泛耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，導(dǎo)致常規(guī)防控手段陷入困境。研究表明，沙門菌在鞭毛介導(dǎo)下能夠在宿主腸道上皮細(xì)胞表面進(jìn)行滑動運動，黏附定植，最終入侵宿主細(xì)胞完成復(fù)制和增殖[7]?；瑒舆\動是沙門菌建立感染的前提條件，介導(dǎo)其運動性的關(guān)鍵基因或蛋白缺失后，其致病性顯著減弱或喪失[8-9]。相比常規(guī)抗菌藥物直接殺傷或殺滅病原菌的作用機(jī)理，通過抑制或減弱沙門菌的致病性進(jìn)行的藥物篩選和研發(fā)也是一種理想的抗耐藥感染新策略。

羌活是一種傘形科羌活屬多年生草本植物，其根和莖可入藥，常用于外感風(fēng)寒和風(fēng)濕疼痛等病癥。羌活油是羌活中的有效成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抑菌和抗過敏等廣泛的藥理活性[10-12]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)羌活油顯著抑制沙門菌在半固體培養(yǎng)基上的滑動運動，通過抗菌活性測定、細(xì)胞毒性試驗(LDH檢測)和細(xì)胞黏附試驗等研究羌活油對沙門菌體外致病性的抑制作用，并評價羌活油對沙門菌感染小鼠的保護(hù)作用，旨在為羌活油防治沙門菌感染提供科學(xué)依據(jù)，以期為抗沙門菌感染提供候選藥物。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞與試劑鼠傷寒沙門菌SL1344(鏈霉素抗性)由北京大學(xué)劉小云研究員饋贈；人宮頸癌細(xì)胞HeLa購自北京協(xié)和細(xì)胞中心；羌活油(有效成分含量≥75%)購自江西吉安中香天然植物有限公司；LB培養(yǎng)基和瓊脂粉購自青島海博生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自Roche公司；ELISA檢測試劑盒購自Biolegend公司；二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司；鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司；TritonX-100購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 試驗動物6～8周齡SPF雌性BALB/c小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)服份有限公司。

1.3 主要儀器生物安全柜(HDL)，購自哈東聯(lián)有限公司；恒溫振蕩器(THZ-82)，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；電子天平(BSA124S/224S-CW)，購自德國賽多利斯；組織研磨儀，購自上海凈信生物科技有限公司；酶標(biāo)儀，購自奧地利TECAN公司。

1.4 羌活油對鼠傷寒沙門菌SL1344滑動運動的影響挑沙門菌(SL1344)單菌落至LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)(37℃、180 r/min)，次日，將收集菌液離心(8 000 r/min)棄上清，用PBS重懸制備菌懸液。取3 μL制備好的菌懸液滴在含不同質(zhì)量濃度(0.000，0.016，0.032,0.064 g/L)羌活油的0.3%瓊脂半固體LB平板中心，37℃水平靜置培養(yǎng)12 h，測量沙門菌滑動運動直徑拍照并記錄。

1.5 羌活油的體外抗菌活性測定

1.5.1最小抑菌濃度(MIC)測定 根據(jù)CLSI(Clinical And Laboratory Standards Institute)公布的標(biāo)準(zhǔn)方法M7-A8，測定羌活油對沙門菌SL1344的MIC[13]。將過夜培養(yǎng)的沙門菌稀釋至5×105CFU/mL，加入不同質(zhì)量終濃度的羌活油(0.000，0.004,0.008,0.016,0.032,0.064,0.128,0.256,0.512,1.024 g/L)，每孔體系為100 μL。另設(shè)LB培養(yǎng)基陰性對照組和未加羌活油的細(xì)菌培養(yǎng)物陽性對照組，37℃靜置培養(yǎng)24 h，以無細(xì)菌生長的最低藥物濃度作為MIC。

1.5.2羌活油對沙門菌生長曲線的測定 將過夜培養(yǎng)的沙門菌SL1344按1∶100擴(kuò)培至100 mL新鮮LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至600 nm波長吸光度(D600 nm)≈0.3。將菌液等量分裝至5只三角錐形瓶中，同時加入不同體積的羌活油(質(zhì)量濃度分別為0.000，0.016，0.032，0.064，0.128 g/L)，置于37℃、200 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，間隔1 h測定菌液的D600 nm值直至平臺期，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.6 羌活油對鼠傷寒沙門菌SL1344黏附和內(nèi)化至HeLa細(xì)胞的影響

1.6.1HeLa細(xì)胞的培養(yǎng) 將液氮中凍存的HeLa細(xì)胞放置于37℃水浴鍋中，使之快速融化復(fù)蘇。1 000 r/min離心5 min后棄去上清，使用含有10%胎牛血清和1×雙抗(青霉素/鏈霉素)溶液的DMEM高糖完全培養(yǎng)基輕柔重懸，將懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，向瓶中補(bǔ)充4 mL完全培養(yǎng)基并混合均勻，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，5%CO2條件下培養(yǎng)。待瓶底細(xì)胞融合至70%～80%時，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.6.2羌活油對HeLa細(xì)胞毒性測定 按照2.0×104/孔密度接種HeLa細(xì)胞至96孔板過夜培養(yǎng)。次日，分別設(shè)不同質(zhì)量濃度(0.000，0.004，0.008，0.016，0.032，0.064，0.128 g/L)羌活油組、陰性對照組(DMEM處理)和陽性對照組(含0.1% TritonX-100培養(yǎng)基)，每組2個重復(fù)，1 000 r/min離心10 min，置于37℃溫箱培養(yǎng)8 h。1 000 r/min離心10 min取細(xì)胞培養(yǎng)上清置于新96孔板，按照乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒說明測定492 nm處吸光度。按照如下公式計算各組LDH釋放率：LDH釋放率=(不同濃度羌活油處理組-陰性對照組)/(陽性對照組-陰性對照組)×100%。

1.6.3羌活油對沙門菌黏附至HeLa細(xì)胞的影響 按照3.0×104/孔將HeLa細(xì)胞接種于24孔板過夜培養(yǎng)。沙門菌SL1344按1∶100擴(kuò)大培養(yǎng)，加入不同質(zhì)量濃度(0.000，0.016，0.032，0.064 g/L)羌活油，置于37℃、200 r/min水平搖床繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(D600 nm=1.0)。1 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS清洗3次，制備菌懸液。按照感染復(fù)數(shù)(細(xì)菌∶細(xì)胞=100∶1)感染HeLa細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，37℃孵育20 min。PBS清洗3次，洗去未黏附細(xì)菌，加入0.1% Triton X-100裂解細(xì)胞。取細(xì)胞裂解液倍比稀釋涂布于含鏈霉素抗性LB平板，37℃過夜培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)，計算黏附率。

1.7 羌活油對沙門菌感染小鼠的治療作用

1.7.1致死劑量感染小鼠存活率測定 將50只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。感染模型組和不同質(zhì)量濃度羌活油組沙門菌SL1344攻菌劑量為5×107CFUs/只，體積為100 μL。攻菌后，間隔12 h灌胃不同劑量羌活油和等體積DMSO，間隔12 h統(tǒng)計各組小鼠存活情況，繪制存活率曲線，試驗動物分組及處理方法見表1。

表1 致死劑量感染小鼠分組及處理方法

1.7.2亞致死劑量感染小鼠保護(hù)作用 將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。感染模型組和100 mg/kg體質(zhì)量羌活油組灌胃攻菌，劑量為1×107CFUs/只，體積為100 μL。攻菌后，間隔12 h 口服灌胃100 mg/kg體質(zhì)量的羌活油和等體積DMSO，攻菌后96 h頸椎脫臼處死各組小鼠，觀察盲腸組織病理損傷程度、靶器官菌落定植數(shù)和盲腸炎性細(xì)胞因子釋放情況，試驗動物分組及處理方法見表2。

表2 亞致死劑量感染小鼠分組及處理方法

1.7.3盲腸組織病理學(xué)觀察 攻菌后96 h剖檢各組小鼠，無菌摘除盲腸肉眼觀察病變情況，并且制備HE染色組織切片，鏡檢觀察盲腸組織的病理學(xué)變化。

1.7.4靶器官菌落定植數(shù)檢測 攻菌后96 h剖檢各組小鼠，無菌摘除肝臟和脾臟，稱質(zhì)量后制備含0.2% TritonX-100的PBS組織研磨液，倍比稀釋涂布于含鏈霉素抗性LB固體平板，37℃過夜培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)，計算肝臟和脾臟的菌落定植數(shù)。

1.7.5盲腸炎性細(xì)胞因子水平檢測 取上述盲腸組織研磨液6 000 r/min離心5 min取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒使用說明測定盲腸炎性細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)的含量。

2 結(jié)果

2.1 羌活油抑制沙門菌的滑動運動通過測定沙門菌在半固體瓊脂培養(yǎng)基上的滑動運動，發(fā)現(xiàn)相比于無羌活油處理組，質(zhì)量濃度為0.032 g/L羌活油組沙門菌的滑動運動程度顯著降低(圖1A)；測量不同處理組滑動運動的直徑，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.032 g/L的羌活油組沙門菌滑動運動率顯著低于無羌活油處理組，降低至20%(圖1B)。結(jié)果表明，羌活油顯著抑制鼠沙門菌的滑動運動。

圖1 羌活油抑制沙門菌在半固體培養(yǎng)基上的滑動運動

2.2 羌活油對沙門菌無體外抗菌活性不同質(zhì)量濃度羌活油組沙門菌SL1344的生長曲線與無羌活油組相似，說明在0～0.128 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，羌活油對沙門菌的生長無顯著性影響(圖2)；同時，羌活油對沙門菌SL1344的MIC值大于0.256 g/L，表明羌活油在有效質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對沙門菌無抗菌活性。

圖2 羌活油對沙門菌生長的影響

2.3 羌活油抑制沙門菌黏附至HeLa細(xì)胞且無明顯細(xì)胞毒性通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗測定羌活油對HeLa細(xì)胞的毒性。在一定濃度范圍(0.000～0.128 g/L)內(nèi)，羌活油對HeLa細(xì)胞無明顯藥物毒性(圖3A)。接下來，測定羌活油對沙門菌黏附至HeLa細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，羌活油在質(zhì)量濃度為0.032 g/L時，顯著抑制沙門菌SL1344黏附至HeLa細(xì)胞，相比于無羌活油組，沙門菌的黏附率下降約40%(圖3B)。

圖3 羌活油抑制沙門菌黏附至HeLa細(xì)胞且無明顯細(xì)胞毒性

2.4 羌活油對沙門菌感染小鼠的治療作用

2.4.1存活率 如圖4所示，空白對照組試驗過程小鼠未發(fā)生感染，未發(fā)生死亡；感染模型組攻菌144 h后小鼠全部死亡；相比于感染模型組，50 mg/kg體質(zhì)量的羌活油治療后感染小鼠存活率為20%；100 mg/kg 和200 mg/kg體質(zhì)量的羌活油治療后感染小鼠存活率均為40%。結(jié)果表明，羌活油顯著降低沙門菌SL1344感染小鼠的病死率，綜合考慮各方面因素，故推薦100 mg/kg體質(zhì)量為最佳劑量。

圖4 羌活油對沙門菌感染小鼠存活率

2.4.2羌活油緩解沙門菌感染小鼠盲腸病理損傷 如圖5A所示，感染模型組小鼠盲腸盲端萎縮和縮短，而100mg/kg體質(zhì)量羌活油組盲腸肉眼僅見輕微損傷，與健康對照組小鼠盲腸形態(tài)相似。同眼觀病變一致，鏡檢發(fā)現(xiàn)感染模型組小鼠盲腸上皮變性、壞死和脫落，細(xì)胞層潰瘍嚴(yán)重并伴隨出血，腸絨毛大量崩解脫落，杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少，黏膜肌層水腫并伴隨炎性細(xì)胞浸潤；100 mg/kg體質(zhì)量羌活油組小鼠盲腸絨毛斷裂，少量腸上皮細(xì)胞變性、壞死和脫落，并伴隨少量出血，少量的炎性細(xì)胞浸潤；健康對照組腸黏膜上皮相對較完整，無明顯病變(圖5B)。

A.眼觀病變；B.鏡檢病理變化

2.4.3羌活油緩解沙門菌感染小鼠盲腸組織炎性反應(yīng) 如圖6所示，100 mg/kg體質(zhì)量羌活油組小鼠盲腸炎性細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)的含量顯著低于感染模型組，表明100 mg/kg體質(zhì)量羌活油能夠有效緩解沙門菌感染小鼠盲腸的炎癥反應(yīng)。

圖6 羌活油降低沙門菌感染小鼠盲腸炎性細(xì)胞因子含量

2.4.4羌活油降低沙門菌感染小鼠靶器官(肝臟和脾臟)菌落定植數(shù) 100 mg/kg體質(zhì)量羌活油組感染小鼠靶器官(肝臟和脾臟)菌落定植數(shù)均極顯著低于感染模型組(圖7)。

圖7 羌活油降低靶器官(肝臟和脾臟)菌落定植數(shù)

3 討論

沙門菌的持續(xù)存活和廣泛傳播，引發(fā)人類和動物的各種疾病，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生和畜禽養(yǎng)殖，造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。沙門菌通過利用鞭毛、菌毛、黏附素、生物膜、耐酸耐熱性及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等不同毒力因子在人和動物消化道及不同食品基質(zhì)中存活繁殖并廣泛傳播[14]。隨著全球經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和生活條件的不斷改善，食源性疾病對全球的影響持續(xù)存在，人們越來越重視食品安全，控制沙門菌在食品中的污染仍是今后發(fā)展的重要方向[15]。為了從根本上解決沙門菌引起的不同類型的人和動物的疾病，降低食源性疾病發(fā)生風(fēng)險，充分了解沙門菌的致病機(jī)理是至關(guān)重要的。雖然物理、化學(xué)及生物防控措施在防控沙門菌感染方面取得了較大的成功，但耐酸型、耐熱型及耐藥型沙門菌菌株的大量出現(xiàn)，仍是食品工業(yè)所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[4]。通過靶向細(xì)菌感染致病過程非生命必需成分，以非抑菌或殺菌方式研制新型抗菌藥物，給予細(xì)菌較小的生存壓力可以有效應(yīng)對目前各種防控策略的弊端。

在本研究中，通過滑動運動、抗菌活性測試、細(xì)胞毒性試驗、細(xì)胞黏附試驗和沙門菌感染小鼠治療試驗，研究羌活油對沙門菌體內(nèi)外致病性的影響。本試驗結(jié)果表明，羌活油在質(zhì)量濃度為0.032 g/L時，顯著抑制沙門菌的滑動運動能力，顯著降低沙門菌黏附至HeLa細(xì)胞，且在有效濃度范圍內(nèi)不影響細(xì)菌的生長和無明顯細(xì)胞毒性；體內(nèi)保護(hù)作用研究發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg體質(zhì)量的羌活油顯著提高沙門菌感染小鼠的存活率，緩解感染小鼠盲腸組織病理損傷，降低感染小鼠靶器官(肝臟和脾臟)菌落定植數(shù)和盲腸組織炎性細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)水平。綜上所述，羌活油是一種治療沙門菌感染的有效藥物，該研究將會為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。