任文潔，林哲絢

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物分析實驗室，廣東 汕頭 515041）

肝臟是哺乳動物體內(nèi)重要的代謝和解毒器官，參與機體多種生理病理過程[1]。原代肝細胞的培養(yǎng)可用于探索肝臟在物質(zhì)代謝中的作用，闡明各種肝臟疾病的發(fā)病機制，對研發(fā)新藥物也至關(guān)重要。因此獲得高活性和形態(tài)完整的原代肝細胞是進行肝臟體外研究的基礎(chǔ)。原代肝細胞的分離提取方法有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法、胰蛋白酶（胰酶）離體消化法、Seglen灌注法、半原位膠原酶灌注法等[2]。但剪切法，組織塊培養(yǎng)法和胰酶離體消化法所分離得到的肝細胞，存活率不高，機械損傷大，而且酶消化條件不易控制。Seglen灌注法及半原位膠原酶灌注法分離得到的肝細胞存活率高且數(shù)量多，但其操作技巧性較高且需要特殊設(shè)備（如精密型蠕動泵），限制了該方法的廣泛應(yīng)用。本研究在灌注法的基礎(chǔ)上進行改良，建立一種簡單易行，低成本的小鼠原代肝細胞分離方法，并對比胰酶和膠原酶灌注法分離提取的小鼠原代肝細胞。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，10～16周，體重20～25 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。常規(guī)喂養(yǎng)，溫度18～22℃，濕度50%～60%，12 h白天黑夜循環(huán)。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑和儀器

HEPES（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胰蛋白酶（BBI生命科學(xué)有限公司）；膠原酶D、DNA酶Ⅰ（德國默克集團）；蛋白酶、地塞米松（美國Sigma公司）；胰島素（上海麥克林生化科技有限公司）；胎牛血清（美國賽默飛世爾科技公司）；青鏈霉素、Percoll細胞分離液、糖原PAS染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；臺盼藍、Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG（H+L）、熒光染料Hoechst 33258（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔角蛋白-18抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）?？瑺栁⑿腿鋭颖茫ㄉ虾？ù柫黧w科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Imager A1相差倒置熒光顯微鏡、Imager A2正置熒光顯微鏡（德國蔡司公司）。

1.3 溶液配制

胰酶灌注液Ⅰ：EDTA 0.5 mmol/L，HEPES 25 mmol/L，D-Hanks液20 mL。胰酶灌注液Ⅱ：胰酶0.125%，HEPES 15 mmol/L，D-Hanks液10 mL。 膠 原 酶 灌 注 液 Ⅰ ：EDTA 0.5 mmol/L，D-Hanks液10 mL。膠原酶灌注液Ⅱ：蛋白酶E 3.2 mg，Hanks 8 mL。膠原酶灌注液Ⅲ：膠原酶D 4.8 mg，Hanks液12.5 mL。清 洗 液：DNA酶Ⅰ0.02 mg/mL，格氏平衡鹽溶液50 mL。純化液：50% Precoll細胞分離液。鼠尾膠原Ⅰ：鼠尾13 μL，0.02 mol/L冰醋酸10 μL，無菌水1 mL。完全培養(yǎng)基：胰島素0.5 μg/mL，地塞米松100 nmol/L，青鏈霉素1%，胎牛血清10%，DMEM高糖培養(yǎng)基200 mL。

1.4 方法

1.4.1 胰酶兩步灌注法（1）準備：灌注液以及DMEM高糖培養(yǎng)基于42℃水浴鍋中預(yù)溫30 min[3]，準備好動物實驗臺以及手術(shù)器械，并在無菌操作臺上照射紫外線30 min。蠕動泵管道以胰酶灌注液Ⅰ循環(huán)運行，防止氣泡產(chǎn)生。（2）灌注：CO2窒息法處死小鼠并將其泡在酒精內(nèi)10～20 s。轉(zhuǎn)移至無菌操作臺。解剖小鼠，暴露腹腔以及整個胸腔。結(jié)扎下腔靜脈肝上段，從下腔靜脈水平進針。開啟灌注，并在門靜脈處剪一個小口。灌注流速3 mL/min；消耗胰酶灌注液Ⅰ15 mL，流出液體澄清，即停止灌注。將泵管轉(zhuǎn)移至胰酶灌注液Ⅱ中，繼續(xù)灌注，消耗胰酶灌注液Ⅱ10 mL。肝臟逐漸腫脹，并用玻璃分針輕按肝臟，凹陷且回彈速度慢，即可。（3）分離：用鑷子夾住連接各個肝葉的纖維束聚集部位，順著結(jié)締組織剪切，將肝臟浸入含3 mL 10%胎牛血清的玻璃皿中以終止灌注，再加入10 mL清洗液。輕輕剝離肝葉包膜，再用鑷子夾住纖維束，搖動以分散殘留的細胞。將細胞懸液過濾，即得到肝細胞懸液。（4）純化：將已過濾的肝細胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，低溫低速離心（4℃，50×g，3 min）。棄上清，加入15 mL清洗液并進行3次輕吹打，重復(fù)離心3次。棄上清，加入10 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，并緩慢加入到10 mL的純化液中，離心（4℃，400×g，10 min），棄上層，剩下的細胞沉淀即為肝實質(zhì)細胞，加入5 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞。

1.4.2 膠原酶灌注法與胰酶兩步灌注法相同，灌注液不同。灌注：灌注流速3 mL/min，待膠原酶灌注液Ⅰ消耗9 mL時，停泵。更換至膠原酶灌注液Ⅱ中，繼續(xù)灌注，消耗8 mL（或15 mL）。停泵，更換至膠原酶灌注液Ⅲ中，消耗11 mL（或21 mL）。若需要更多的細胞數(shù)量，可增加灌注體積及時間[3]。分離：將分離的肝臟放入裝有膠原酶灌注液Ⅲ的離心管中，密封并放入42℃預(yù)溫5 min。將肝臟浸入含10%胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中進行撕肝，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾，濾液即為肝細胞懸液。

1.4.3 細胞計數(shù)及臺盼藍染色細胞懸液稀釋10倍后，與臺盼藍以9∶1（體積比）混勻，顯微鏡下進行細胞計數(shù)。細胞折射率較強的圓形細胞為肝實質(zhì)細胞，被染為藍色的細胞為死細胞。計算細胞存活率（活細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%）。

1.4.4 肝細胞形態(tài)學(xué)觀察分離的肝細胞接種于鼠尾膠原Ⅰ預(yù)處理的含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板，于37℃、5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基。分別于分離6 h、12 h、24 h、48 h，3 d，7 d后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5 肝細胞的鑒定通過糖原PAS染色法[4]及CK-18免疫熒光細胞化學(xué)染色[5]鑒定肝細胞。PAS染色法簡要步驟如下。將純化后的原代肝細胞爬片，高碘酸避光氧化，再經(jīng)希夫試劑室溫避光染色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，晾干，鏡檢拍照。CK-18免疫熒光細胞化學(xué)染色簡要步驟如下。細胞爬片培養(yǎng)24～48 h后，棄上清，4%多聚甲醛室溫固定。PBS沖洗3次，0.2%Triton X-100滲透。PBS洗3次，1%BSA封閉30 min。山羊抗兔CK-18抗體4℃孵育過夜，Alexa Fluor 488標記山 羊 抗 兔IgG（H+L） 抗 體37℃ 孵 育1 h。Hoechst 33258(5 μg/mL)室溫孵育10 min，60%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍照。對照組用PBS替代一抗。

1.4.6 細胞活性的檢測采用MTT法檢測細胞活性。將新鮮提取的小鼠原代肝細胞以5×103/孔接種于96孔板中，分別于接種6 h、12 h、24 h、48 h、3 d、7 d后進行MTT實驗。棄掉培養(yǎng)基，加入含MTT（5 mg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基110 μL（體積比為1∶10）培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜避光震蕩10 min，用酶標儀檢測各孔吸光度值D（570 nm）。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較用獨立樣本t檢驗；不同酶灌注法分離的肝細胞接種不同時間的細胞活性比較采用重復(fù)測量方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種分離方法的提取過程比較

胰酶灌注法經(jīng)過兩步灌注后，肝臟土灰色并呈現(xiàn)腫脹狀態(tài)，輕按肝葉回彈速度慢。在進行撕肝時，肝葉成塊狀，不易形成糜狀。過濾前后，溶液渾濁程度低（圖1A）。膠原酶灌注法經(jīng)過三步灌注后，肝葉逐漸塌軟，輕按肝葉回彈速度慢或基本不回彈。撕肝時肝葉呈糜狀，溶液渾濁程度高（圖1B）。經(jīng)過低溫低速離心3次并純化后，兩種方法均可獲得肝實質(zhì)細胞。

圖1 不同酶灌注法分離提取肝細胞過程

2.2 細胞數(shù)量與存活率

與胰酶灌注法相比，膠原酶灌注法分離提取的肝細胞數(shù)量明顯更多（P＜0.05），見表1。肝細胞懸液經(jīng)純化后，兩種方法分離所得細胞存活率均可達到90%以上。臺盼藍染色觀察到剛分離的活細胞呈圓形或橢圓形，細胞體透亮、飽滿，而被染為藍色的為死細胞（圖2）。

表1 兩種灌注法分離所得肝細胞數(shù)量及存活率的比較（n=6，）

表1 兩種灌注法分離所得肝細胞數(shù)量及存活率的比較（n=6，）

1）與胰酶灌注法比，P＜0.05。

方法胰酶灌注法膠原酶灌注法細胞總數(shù)（個/10 μL）63.0±7.4 119.5±20.51）活細胞數(shù)（個/10 μL）58.5±7.0 109.0±16.9死細胞數(shù)（個/10 μL）4.0±2.5 10.5±6.7存活率/%93.0±2.0 93.0±5.0

圖2 肝實質(zhì)細胞的臺盼藍染色（×100）

2.3 肝細胞形態(tài)學(xué)觀察

接種6 h后，肝細胞基本貼壁，呈鋪路石狀，細胞邊界清晰，可見單核或雙核。接種24 h后，肝細胞有向外延伸的趨勢，胞體明顯增大、平展并呈不規(guī)則多角形。培養(yǎng)3 d后，肝細胞形成條索狀或島狀結(jié)構(gòu)，相鄰的細胞彼此連接更加緊密（圖3）。細胞貼壁7 d后，細胞間融合成片，界限消失，未見明顯細胞核。兩種酶灌注法分離出的肝細胞在形態(tài)上無明顯差異。

圖3 原代肝細胞培養(yǎng)不同時間的形態(tài)圖（×100）

2.4 肝細胞鑒定

肝細胞培養(yǎng)24 h經(jīng)PAS染色后可見細胞胞質(zhì)呈紫紅色，并呈均質(zhì)或顆粒狀分布（圖4）。免疫熒光染色結(jié)果表明，陽性細胞胞質(zhì)可觀察到綠色熒光（圖5）。兩種酶灌注法分離出的細胞經(jīng)鑒定并計數(shù)，獲取的原代肝細胞純度均＞90%。

圖4 原代肝細胞的PAS染色（×200）

圖5 原代肝細胞的抗CK-18免疫熒光染色（× 200）

2.5 不同培養(yǎng)時間的肝細胞活性

重復(fù)測量方差分析結(jié)果表明小鼠原代肝細胞培養(yǎng)48 h后，膠原酶灌注法分離的細胞吸光度值高于胰酶灌注法（F=5.501，P＜0.001）；不同酶灌注法分離提取的細胞在接種12 h時吸光度值達到最大值，并隨接種時間的延長，細胞吸光度值逐漸下降（F=628.787，P＜0.001）；不同酶灌注法和接種時間之間存在交互效應(yīng)，胰酶灌注法分離的細胞吸光度值下降幅度高于膠原酶灌注法（F=52.527，P＜0.001），見圖6。

圖6 原代肝細胞接種不同時間的細胞MTT顯色吸光度值

3 討論

原代肝細胞比永生化的肝細胞系更真實地反映肝細胞的生理反應(yīng)，因而廣泛地應(yīng)用于肝臟毒理學(xué)、藥理學(xué)、生理學(xué)等各方面的研究[6]。原代肝細胞的分離提取是肝細胞體外培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟，獲取高活性，高純度以及形態(tài)完整的肝細胞是原代肝細胞分離提取的核心目標。國內(nèi)外研究者建立了多種原代肝細胞分離培養(yǎng)的方法，但存在操作復(fù)雜、技術(shù)性高、實驗條件高、成本高以及低活性，低產(chǎn)率等問題[7]。例如直接剪切法對細胞的機械損傷大，導(dǎo)致細胞存活率和獲得率低；組織塊培養(yǎng)法操作復(fù)雜，剪切以及剔除組織塊時易造成污染，肝細胞爬出時間長且純度不高；胰酶離體消化法的消化時間及用量不易控制，消化過度形成絮狀組織塊，不易剔除導(dǎo)致純度不高，消化不充分導(dǎo)致獲得率低；Seglen 灌注法操作技術(shù)高，流程多且繁瑣，膠原酶成本高等。本研究根據(jù)實驗室現(xiàn)有條件對經(jīng)典兩步灌注法進行改良，使用0.125%胰酶進行消化，得出最佳消化用量為10 mL，細胞獲得率，活性及純度高，且成本低。本研究根據(jù)文獻[3]，減少膠原酶用量，縮短灌注時間及操作流程，既可獲得大量肝細胞，細胞純度及存活率均滿足體外原代肝細胞實驗要求，也大大降低了成本。同時，本研究對胰酶和膠原酶灌注法分離提取小鼠原代肝細胞的形態(tài)、活性、純度、細胞數(shù)量及存活率進行了比較。

胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，作為肽鏈內(nèi)切酶，可水解賴氨酸或精氨酸羧基端，從而可使細胞間的蛋白質(zhì)水解，細胞離散。然而，膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，因其穩(wěn)定而保守的三螺旋結(jié)構(gòu)，不易被普通蛋白酶降解。膠原蛋白酶D 是一種膠原蛋白水解酶，具有解離組織以釋放單個細胞的作用，但價格較高。在本研究中，胰酶灌注法先用含EDTA 的D-Hanks 溶液灌注以去除血細胞和螯合肝細胞間的鈣離子，破壞肝細胞間的橋粒連接；再用含胰酶的D-Hanks 溶液進行灌注，以利于肝細胞的分離，可獲取肝細胞量為（3～7）×106/只。經(jīng)反復(fù)試驗得出最適胰酶濃度為0.125%，最適灌注體積為10 mL。膠原酶灌注法同樣先以EDTA 灌注減少細胞間的黏附；其次鏈蛋白酶E 聯(lián)合膠原酶灌注以充分消化肝組織。Hanks 溶液的Ca2+可激活膠原酶D，使用含膠原酶D 的Hanks 溶液灌注充分消化細胞間的連接以及纖維組織，獲得肝細胞（2～8）×107/只。不管使用何種蛋白酶，在灌注過程中，均需控制灌注用量及時間，避免消化不充分或消化過度，從而保持高活性和高產(chǎn)率。

原代肝細胞的培養(yǎng)條件較高。在本研究中，將新鮮提取的肝細胞接種于Ⅰ型鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿（培養(yǎng)板），可促進肝細胞貼壁，避免細胞聚集成團生長。在高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和胰島素，既滿足細胞生長需求，又可增加肝細胞的貼壁率，促進核蛋白磷酸化以及鐵的攝入[8]。原代肝細胞培養(yǎng)時，地塞米松可促進肝細胞線粒體再生，并提高肝細胞穩(wěn)定性[9]。本研究中兩種分離方法獲得的肝細胞在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)不同時間的細胞形態(tài)變化基本一致；通過臺盼藍染色，糖原染色和抗CK-18 免疫熒光細胞化學(xué)染色鑒定，存活率及純度均達到90%以上。顯然，膠原酶的消化更有利于獲得大量肝細胞，這與膠原酶作用機制有關(guān)，而胰酶灌注法雖得率較低，但仍可獲得活性、純度較高的原代肝細胞，因其成本更低，也不失為一種較好的替代方法。

綜上所述，本研究建立了簡單易行，低成本的酶灌注法，分離提取的肝細胞可在一定條件下保持穩(wěn)定的活性，可應(yīng)用于與肝細胞相關(guān)的多種體外實驗研究。