鐘 譽(yù)，陳 揚(yáng)，吳靈飛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球新發(fā)食管癌約60.4萬例，食管癌死亡病例約54.4萬例，食管癌患病率居所有惡性腫瘤第7位，病死率居第6位[1]；我國每年因食管癌死亡的患者人數(shù)居惡性腫瘤的第4位[2]。食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌兩種類型。食管鱗狀細(xì)胞癌約占所有食管癌病例的90%，是最常見的組織學(xué)類型。大部分食管癌早期臨床癥狀不明顯，就診時(shí)多數(shù)已為中晚期。食管癌的治療以手術(shù)及放化療為主，順鉑是治療局部進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性食管癌的一線藥物，病人早期治療效果明顯，但其耐藥性是導(dǎo)致治療失敗的重要原因[3]。美國癌癥協(xié)會研究表明，90%以上的腫瘤患者會不同程度地受到所用化療藥物的耐藥性影響[4]。因此，研究耐藥的機(jī)制及尋求耐藥逆轉(zhuǎn)的有效方法成為新近研究的熱點(diǎn)。Guo 等[5]首次發(fā)現(xiàn)，miRNA在食管癌組織中存在差異表達(dá)譜，越來越多研究證實(shí)，miRNA在食管癌中存在差異表達(dá)，調(diào)控癌基因調(diào)控水平進(jìn)而影響食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物學(xué)行為，從而影響食管癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。本文就miRNA在食管癌順鉑耐藥中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 順鉑耐藥的機(jī)制

順鉑主要通過與腫瘤細(xì)胞DNA 結(jié)合形成Pt-DNA 加合物，導(dǎo)致DNA 結(jié)構(gòu)改變，DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄障礙，造成腫瘤細(xì)胞死亡。然而，在此過程中常出現(xiàn)內(nèi)源性耐藥或獲得性耐藥，即腫瘤本身內(nèi)在的和因基因突變或獲得外源性耐藥基因所導(dǎo)致的耐藥性。其主要機(jī)制包括促進(jìn)藥物排出胞內(nèi)和減少藥物蓄積、增強(qiáng)藥物滅活及DNA修復(fù)、產(chǎn)生保護(hù)性自噬、抑制凋亡信號傳導(dǎo)和間接調(diào)控因子的改變等。具體見圖1。

圖1 miRNA參與順鉑耐藥機(jī)制的調(diào)控

1.1 減少順鉑攝取

鉑類藥物發(fā)揮細(xì)胞毒作用的第一步是進(jìn)入細(xì)胞。此過程較復(fù)雜，尚未完全揭示清楚。目前認(rèn)為，順鉑的攝取主要是由哺乳動物中的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。順鉑可引發(fā)銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白快速降解而導(dǎo)致順鉑攝入減少，導(dǎo)致順鉑耐藥[6]。鈉泵、有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2、P 型ATP 酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)亦影響鉑類藥物的入胞過程。此外，內(nèi)吞作用也是鉑類入胞的另一種機(jī)制，內(nèi)吞作用降低可導(dǎo)致順鉑耐藥[7]。

1.2 加速順鉑外排

鉑類藥物進(jìn)入細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)運(yùn)體出胞是導(dǎo)致藥物在胞內(nèi)濃度降低的另一個(gè)原因。P 型ATP 酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是參與順鉑外排的兩種主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。順鉑通過激活P型ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的催化循環(huán)，使其N端金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基處結(jié)合順鉑，形成穩(wěn)定的Pt2+-S鍵。該反應(yīng)將鉑類藥物螯合到分泌途徑的囊泡中，加速順鉑外排，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物毒性降低[8]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族有7個(gè)亞家族成員（從ABCA到ABCG），其中多種藥物耐藥相關(guān)基因 （MRP） 組 成 的 C 亞 家 族 （ABCB1/PGP、 ABCC1/MRP1、 ABCC2/MRP2、 ABCC3/MRP3、 ABCC4/ MRP4 和ABCC5/MRP5）成員參與了順鉑耐藥的調(diào)控[9]。

1.3 加速胞漿內(nèi)失活

順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，可因細(xì)胞解毒機(jī)制在漿內(nèi)失活而產(chǎn)生耐藥。其胞漿失活的主要形式是：谷胱甘肽和金屬硫蛋白通過硫醇基團(tuán)配位與順鉑結(jié)合，抑制氧化應(yīng)激、保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷而降低順鉑毒性。另外，與順鉑結(jié)合的谷胱甘肽更容易通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白出胞而減少藥物在細(xì)胞內(nèi)累積，從而減少了順鉑的抗癌效果[10]。

1.4 促進(jìn)DNA修復(fù)

Pt-DNA 加合物修復(fù)系統(tǒng)被認(rèn)為是順鉑耐藥的主要機(jī)制，順鉑誘導(dǎo)的DNA加合物能夠阻斷轉(zhuǎn)錄和DNA合成，進(jìn)而觸發(fā)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。在修復(fù)受損或過度損傷的情況下，細(xì)胞發(fā)生凋亡。為了抵制順鉑引起的大量細(xì)胞死亡，細(xì)胞會啟動一系列DNA修復(fù)系統(tǒng)，包括核苷酸切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、同源重組和非同源末端連接等[11]。

1.5 跨損傷DNA合成

當(dāng)DNA 損傷無法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞可以利用跨損傷DNA合成提高其對DNA 損傷的耐受性?？鐡p傷DNA 合成由具有廣泛催化位點(diǎn)且缺乏校對活性的Y 家庭聚合酶（Polη、Polι、Polκ和Rev1）和B家族聚合酶執(zhí)行[12]，使細(xì)胞通過加合物復(fù)制DNA，避免復(fù)制叉崩潰和死亡信號，造成腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物誘導(dǎo)DNA損傷的耐受性[13]。

1.6 改變細(xì)胞存活途徑

當(dāng)細(xì)胞暴露于順鉑等鉑類藥物后，促細(xì)胞生存和凋亡信號通路會被同時(shí)觸發(fā)。細(xì)胞的最終命運(yùn)取決于這些相反信號的相對強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。MAPK 通路（包括ERK、p38和JNK）是抑制細(xì)胞凋亡的通路，研究表明，MAPK通路激活與順鉑耐藥有關(guān)[14]。TP53可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境觸發(fā)促生存或促凋亡信號。研究表明，順鉑耐藥與TP53功能缺陷有關(guān)。Timmerman 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TP53缺失可促進(jìn)縱隔來源的生殖細(xì)胞腫瘤對順鉑耐藥。除此之外，順鉑治療過程中會增加活性氧水平，導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞器斷裂、線粒體功能破壞和ATP 耗竭，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Pan 等[16]報(bào)道，自噬途徑亦與順鉑耐藥性相關(guān)。自噬是一種分解代謝途徑，根據(jù)應(yīng)激條件回收必需成分。順鉑可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，并通過減少凋亡及增強(qiáng)DNA修復(fù)而介導(dǎo)耐藥[17]。

1.7 改變生物信息傳導(dǎo)通路

研究發(fā)現(xiàn)實(shí)體瘤細(xì)胞在缺氧條件下會誘導(dǎo)順鉑耐藥。缺氧轉(zhuǎn)錄程序主要由HIF 轉(zhuǎn)錄因子激活。HIF 轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)多達(dá)2%的人類基因組的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞凋亡或細(xì)胞存活[18]。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)。大量研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的分子伴侶活性增加與順鉑耐藥相關(guān)[19]。此外DNA甲基化表觀遺傳學(xué)改變[20]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[21]以及 MYC、TGFβ、MYC、RTK 等[13]信號通路改變均參與了順鉑耐藥的調(diào)控。

2 miRNA

miRNA 是一類豐富的調(diào)節(jié)性非編碼單鏈RNA 分子，廣泛存在于真核生物中，長度約為19～23個(gè)核苷酸，這是一類在動植物中新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控因子，它們通過靶向mRNA、誘導(dǎo)翻譯抑制和mRNA 降解來調(diào)節(jié)基因表達(dá)[22]。最初發(fā)現(xiàn)miRNA時(shí)研究人員并沒有意識到它們的重要性。第一個(gè)被確認(rèn)的miRNA 是在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的lin-4基因，并且認(rèn)為是線蟲獨(dú)有的。然而，通過傳統(tǒng)的克隆方法和生物信息學(xué)手段發(fā)現(xiàn)在線蟲、果蠅、哺乳動物中存在著數(shù)百個(gè)miRNA，這引起了各領(lǐng)域科學(xué)家的重視。據(jù)估計(jì)，在人類基因組中至少存在300～1 000 個(gè)miRNA，miRNA已成為最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子[23-25]。

雖然目前已揭示出miRNA的生物學(xué)功能，但如何精確地鑒定miRNA所靶向的基因仍是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，1 個(gè)miRNA 可以結(jié)合多達(dá)200 個(gè)靶基因，而這些靶基因可以行使不同的功能，包括受體、分泌蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子[26]。初步推算，miRNA 可能參與人類1/3基因的調(diào)控，其中包括與癌癥相關(guān)的基因表達(dá)[27]。研究表明，miRNA 通過調(diào)控癌基因表達(dá)發(fā)揮促癌或抑癌作用[28]。miRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)的靶基因而導(dǎo)致細(xì)胞生物性狀的改變，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)展[29]。miR-34 是第一個(gè)被證明受腫瘤抑制基因p53直接調(diào)節(jié)的miRNA[30]，其與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。

3 miRNA參與順鉑耐藥的機(jī)制

與化療敏感的食管癌細(xì)胞相比，順鉑耐藥的細(xì)胞呈現(xiàn)不同程度的miRNA 表達(dá)失調(diào)。miRNA 主要通過影響細(xì)胞生物學(xué)行為及相關(guān)信號通路參與順鉑耐藥的調(diào)控。

3.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡

Zuo 等[31]證實(shí)過表達(dá) miR-153-3p 通過下調(diào) NRF2 來抑制ESCC 細(xì)胞增殖并增加順鉑抗癌的敏感性。Liu 等[32]發(fā)現(xiàn)，ESCC 細(xì)胞中過表達(dá)miR-455-3p 可通過激活Wnt/β-catenin 和 TGF-β/Smad 通路誘導(dǎo) ESCC 呈現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞特征，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及耐藥性。Zhao 等[33]研究表明，miR-125a-3p 上調(diào)可抑制STAT3 信號通路，增加ESCC 細(xì)胞凋亡，降低其對順鉑耐藥。miR-10b被證實(shí)是多種惡性腫瘤中的癌基因，也參與了介導(dǎo)食管癌順鉑耐藥的調(diào)控。Wu 等[34]研究證實(shí)過表達(dá)miR-10b 介導(dǎo)PPARγ表達(dá)下調(diào)，激活A(yù)KT/mTOR/P70S6K 信號傳導(dǎo)，抑制食管癌細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)其耐藥。Shi等[35]報(bào)道，外泌體過表達(dá)miR-193可下調(diào)TFAP2C，減少順鉑對食管癌細(xì)胞周期蛋白的抑制，促進(jìn)食管癌細(xì)胞分裂增殖而導(dǎo)致耐藥。Zhu 等[36]研究發(fā)現(xiàn)ESCC中上調(diào)的miR-106b-3p通過與蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶E 3′UTR 序列結(jié)合負(fù)性調(diào)控蛋白質(zhì)-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶E 表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)ESCC 對順鉑耐藥。Zheng 等[37]報(bào)道，過表達(dá)miR-145 可通過下調(diào)MRP1 和P-gp 蛋白表達(dá)抑制AKT3，增強(qiáng)其對順鉑化療的敏感性。失調(diào)的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在食管癌順鉑耐藥中亦起著重要作用，miRNAs作為lncRNAs 下游反應(yīng)物常參與其中。Chang 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的circ_0007142通過海綿樣吸附miR-494-3p促進(jìn)LASP1表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡，提高食管癌細(xì)胞對順鉑的耐受性。Zhu 等[39]研究表明，lncRNA-EMS 通過下調(diào)miR-758-3p 促進(jìn)WTAP 表達(dá)，可抑制ESCC 細(xì)胞凋亡并促進(jìn)順鉑耐藥。Liu等[40]證實(shí)lncRNA FOXD2-AS1充當(dāng)競爭性內(nèi)源性RNAs 靶向吸附miR-195，通過活化AKT/mTOR 信號通路促進(jìn)ESCC 細(xì)胞生長，抑制其凋亡并產(chǎn)生順鉑耐藥。Cheng 等[41]報(bào)道，下調(diào)miR-873-3p 可激活SOX4/Wnt/β-catenin 信號通路進(jìn)而促進(jìn)ESCC 細(xì)胞增殖，提高其順鉑耐藥性。Wang 等[42]研究表明，lncRNA-LINC00261 海綿樣吸附miR-545-3p下調(diào)MT1M表達(dá)以促進(jìn)ESCC細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制順鉑耐藥。

3.2 影響細(xì)胞遷移和侵襲能力

Yan 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的miR-624 通過抑制ARRDC3 表達(dá)從而上調(diào)YAP 表達(dá)并激活HIF1α信號通路，促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲能力，增加ESCC 細(xì)胞順鉑耐藥。Yang 等[44]報(bào)道，過表達(dá) miR-21 通過下調(diào)PDCD4的 mRNA和蛋白水平，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的侵襲能力并誘導(dǎo)順鉑耐藥性產(chǎn)生；Wan 等[45]研究證實(shí)，miR-21 通過下調(diào)PTEN表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞順鉑耐藥。Jia 等[46]研究證實(shí)lncRNA NORAD 通過海綿樣吸附miR-224-3p，上調(diào)異黏蛋白（metadherin，MTDH）表達(dá)以促進(jìn)ESCC 細(xì)胞遷移和侵襲，并產(chǎn)生順鉑耐藥。有關(guān)mRNA參與食管癌順鉑耐藥調(diào)控及其機(jī)制詳見表1。

表1 miRNA與食管癌順鉑耐藥的關(guān)系

4 小結(jié)與展望

總之，作為近年非編碼RNA 家族中的一個(gè)新研究熱點(diǎn)，miRNA在食管癌化療耐藥中的作用已得到越來越多研究的證實(shí)。miRNA通過調(diào)控mRNA，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展。在對食管癌進(jìn)行新輔助化療及姑息治療過程中，miRNA不僅可以作為化療藥物的直接治療靶點(diǎn)，另外由于其具有高度穩(wěn)定性，易于在外周血、尿液和唾液中被檢測，因此，還可用于腫瘤的診斷、預(yù)后和療效的觀察。雖然目前尚無miRNA用于抗癌治療的臨床報(bào)道，但是相信在不久的將來，隨著miRNA參與腫瘤發(fā)生及耐藥機(jī)制更深入的研究，開發(fā)針對miRNA的靶向藥物有望在腫瘤治療中探索出一條新途徑。