吳 潔 顧 平 孫 茜 劉 政 梁 蝶 牟晨宇（南京市中心醫(yī)院，南京 210018）

肺癌是全球癌癥患者死亡的首要原因，約占所有癌癥死亡的22%［1］。小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）約占所有肺癌的15%，具有倍增時(shí)間快、生長(zhǎng)分?jǐn)?shù)高、早期發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移等特征，即使SCLC初始化療和放療效果較好，但高復(fù)發(fā)率導(dǎo)致其預(yù)后較差，五年生存率不足5%［2-3］。因此，深入研究SCLC的發(fā)生機(jī)制和治療靶點(diǎn)對(duì)提高患者預(yù)后尤為必要。研究發(fā)現(xiàn)，Linc00996是多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物，大腸癌中Linc00996呈低表達(dá)并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，但其在SCLC中的研究尚無(wú)報(bào)道［4-5］。因此，本研究深入研究Linc00996在SCLC中的分子功能及潛在機(jī)制，為SCLC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 人永生化支氣管上皮細(xì)胞（HBE）及SCLC細(xì)胞系（NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCIH345）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；miR-9-5p mimic、mimic-NC、pcDNA-Linc00996過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照pcDNA-EGF購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Lipofectamine?3000、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit購(gòu) 自 日 本TaKaRa公 司；miScript SYBR Green PCR Kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；ECL試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司；CCK-8試劑購(gòu)自Beyotime Institute of Biotechnology公司；微量平板閱讀器購(gòu)自BioTek。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞均采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2無(wú)菌恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine?3000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimic、mimic-NC、oe-Linc00996和oe-NC。

1.2.2qRT-PCR采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用miScript SYBR Green PCR Kit進(jìn)行qRT-PCR，Linc00996以GAPDH為內(nèi)參，miR-9-5p以U6為內(nèi)參，歸一化處理后，2-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。引物序列miR-9-5p F：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3；R：5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3；U6 F：5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3；R：5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3；Linc00996 F：5'-CTCTGCCACATCGTTCGGTTC-3′；R：5′-CTTCTTACGCTGCCAACTGCTAA-3；GAPDH：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.3Western blot轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加入適量預(yù)冷RIPA裂解液冰上裂解10 min，離心收集總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳（100 V），移至PVDF膜（60 V、120 min），BSA封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒發(fā)光自顯影，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)成像拍照觀察。

1.2.4CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將NCI-H446細(xì)胞以5×103個(gè)/孔（100μl/孔）接種至96孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按照分組轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒24 h、48 h、72 h后，加入10μl CCK-8試劑和90μl新鮮培養(yǎng)基取代細(xì)胞培養(yǎng)液37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，微量平板閱讀器測(cè)量450 nm處吸光度。

1.2.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 采用胰酶將NCI-H446細(xì)胞消化為單細(xì)胞懸液，2×102個(gè)/孔接種至6孔板，37℃培養(yǎng)7 d后形成集落，4%多聚甲醛4℃固定1 h，0.5%結(jié)晶紫室溫染色30 min，光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 將NCI-H446細(xì)胞（5×105個(gè)/孔）接種至6孔板，細(xì)胞80%融合時(shí)采用移液槍槍頭在孔平面輕輕劃過(guò)，PBS洗滌3次，去除游離細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察0 h和24 h細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將2×104個(gè)細(xì)胞懸浮于100μl無(wú)血清培養(yǎng)基，接種于預(yù)涂Matrigel的小室上部，小室下部加入含10%FBS的800μl RPMI1640培養(yǎng)基，孵育24 h后4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，奧林巴斯IX70倒置顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)視野遷移細(xì)胞并拍照。

1.2.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建pmirGLOLinc00996-WT質(zhì) 粒 和pmirGLO-Linc00996-MUT質(zhì)粒，以含海腎熒光素酶的pRL-TK載體為內(nèi)參，細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，分別共轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的野生型質(zhì)粒和突變質(zhì)粒、miR-9 mimic及mimic-NC，48 h后收集細(xì)胞，加入裂解液，Dual-Luciferase Reporter Assay System檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SCLC細(xì)胞系中Linc00996呈低表達(dá)qRTPCR檢 測(cè)SCLC細(xì)胞系 中Linc00996表 達(dá)，結(jié) 果 顯示，與HBE相 比，SCLC細(xì) 胞 系NCI-H446、N69、SHP-77、DMS79、NCI-H345中Linc00996呈顯著低表達(dá)（P＜0.001，圖1）。選擇Linc00996表達(dá)最低的NCI-H446細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)SCLC細(xì)胞系中Linc00996表達(dá)Fig.1 Linc00996 expression in SCLC cell lines detected by qRT-PCR

2.2過(guò)表達(dá)Linc00996抑制NCI-H446細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染oe-Linc00996過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，Linc00996表達(dá)顯著升高（P＜0.001，圖2A），CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Linc00996能夠顯著抑制NCI-H446細(xì)胞增殖（P＜0.001，圖2B）。平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Linc00996后NCI-H446細(xì)胞克隆形成能力顯著減弱（P＜0.001，圖2C）。

圖2 過(guò)表達(dá)Linc00996抑制NCI-H446細(xì)胞增殖Fig.2 Over-expression of Linc00996 inhibits proliferation of NCI-H446 cells

2.3Linc00996抑制NCI-H446細(xì)胞遷移 劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Linc00996后，NCI-H446細(xì)胞遷移水平顯著降低（P＜0.001，圖3A），Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Linc00996后NCI-H446細(xì)胞侵襲水平顯著降低（P＜0.001，圖3B）。Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Linc00996后MMP2、MMP9表達(dá)顯著降低（P＜0.001，圖3C），表明過(guò)表達(dá)Linc00996后NCI-H446細(xì)胞遷移、侵襲水平降低。

Note：Compared with pcDNA-EGF group，***.P＜0.001.

2.4Linc00996靶向調(diào)控NCI-H446細(xì)胞miR-9-5p表達(dá)Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Linc00996與miR-9-5p存在結(jié)合序列（圖4A），qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p在SCLC細(xì)胞系中呈顯著高表達(dá)（P＜0.001，圖4B）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p+Linc00996野生型組熒光素酶活性被顯著抑制（P＜0.001，圖4C）。qRTPCR結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Linc00996后miR-9-5p表達(dá)顯著降低（P＜0.001，圖4D），證實(shí)Linc00996能夠靶向下調(diào)NCI-H446細(xì)胞miR-9-5p表達(dá)。

2.5過(guò)表達(dá)miR-9-5p可逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制作用qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-9-5p mimic后，miR-9-5p表達(dá)顯著增加（P＜0.01，圖5A）。CCK-8分 別 檢 測(cè)control組、pcDNA-Linc00996組、pcDNA-Linc00996+mimic-NC、pcDNA-Linc00996+miR-9-5p mimic組NCI-H446細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-9-5p后能夠逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0.05，圖5B）。平板克隆實(shí)驗(yàn)也證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-9-5p能夠逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用（P＜0.001，圖5C）。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-9-5p逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.5 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on proliferation of NCI-H446 cells

2.6過(guò)表達(dá)miR-9-5p逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移的抑制作用 劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic能夠逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用（P＜0.001，圖6A、B）。Western blot結(jié)果顯示，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-Linc00996和miR-9-5p mimic后MMP2、MMP9表達(dá)得到一定程度恢復(fù)（P＜0.001，圖6C），表明miR-9-5p能夠逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制作用。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-9-5p逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)NCI-H446細(xì)胞遷移的抑制作用Fig.6 Over-expression of miR-9-5p reverses inhibitory effect of Linc00996 on migration of NCI-H446 cells

Note：Compared with control group，***.P＜0.001.

3 討論

SCLC發(fā)展迅速，早期即可發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后極差。隨著免疫治療技術(shù)發(fā)展，針對(duì)SCLC的免疫治療研究成為新的熱點(diǎn)，且免疫治療能夠使SCLC患者受益［6-7］。因此深入研究SCLC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)SCLC的靶向藥物開(kāi)發(fā)具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)度為200個(gè)核苷酸的非編碼蛋白質(zhì)的RNA，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后修飾廣泛參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［8-9］。核lncRNA linc02095可正向調(diào)節(jié)SOX9轉(zhuǎn)錄和mRNA輸出，促進(jìn)三陰乳腺癌惡性進(jìn)展［10］；SCLC中，ZFPM-AS1能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-3612，上調(diào)TRAF4表達(dá)可促進(jìn)SCLC細(xì)胞增殖和侵襲［11］；Linc00173能夠靶向吸附miR-218，調(diào)節(jié)ETK表達(dá)，增強(qiáng)SCLC的化療耐藥性并促進(jìn)其惡性進(jìn)展［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，Linc00996在SCLC細(xì)胞中低表達(dá)，CCK-8、平板克隆實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell證實(shí)過(guò)表達(dá)Linc00996能夠明顯降低SCLC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力。MMP2、MMP9與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)MMP2、MMP9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Linc00996可降低SCLC細(xì)胞侵襲水平，表明Linc00996在SCLC中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。

研究報(bào)道，LncRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展［13-14］。本研究通過(guò)Starbase預(yù)測(cè)Linc00996的靶向miRNA，發(fā)現(xiàn)其能夠與miR-9-5p、miR-758-3p結(jié)合，但研究發(fā)現(xiàn)miR-758-3p在非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、胃癌等多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用［15-17］，與本研究假設(shè)不符，因此舍棄miR-758-3p。而miR-9-5p在癌癥中發(fā)揮促癌作用，因此選擇miR-9-5p進(jìn) 行 后 續(xù) 研 究。qRT-PCR發(fā) 現(xiàn)，miR-9-5p在SCLC細(xì)胞系中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)Linc00996能夠降低SCLC細(xì)胞系中miR-9-5p表達(dá)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，Linc00996能夠靶向調(diào)控miR-9-5p表達(dá)。miR-9-5p在SCLC中表達(dá)上調(diào)，與本研究結(jié)果一致［18］。此外，研究報(bào)道，miR-9-5p在前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌中均能夠促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展［19-21］。本研究顯示，Linc00996能夠競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-9-5p，過(guò)表達(dá)miR-9-5p能夠逆轉(zhuǎn)Linc00996對(duì)SCLC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用，表明過(guò)表達(dá)Linc00996能夠通過(guò)靶向下調(diào)miR-9-5p表達(dá)調(diào)控SCLC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

綜上，SCLC細(xì)胞中Linc00996通過(guò)調(diào)控miR-9-5p表達(dá)進(jìn)而抑制其增殖、侵襲及遷移，為SCLC免疫治療提供新的思路。