冷利華 裴宜斌 周 函 晏晶晶 何小伍 朱 高 黃文勝

（中國(guó)人民解放軍海軍安慶醫(yī)院心血管內(nèi)科，安慶 246003）

冠狀動(dòng)脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）是一種復(fù)雜的多因素疾病，是最常見(jiàn)的死亡原因之一，并在全世界造成了沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)［1］。CAD包括穩(wěn)定/不穩(wěn)定心絞痛、突發(fā)性心臟疾病和心肌梗死（myocardial infarction，MI），病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，導(dǎo)致腔隙狹窄/堵塞。斑塊進(jìn)一步破裂和血栓將阻塞冠狀動(dòng)脈導(dǎo)致急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）［2］。常見(jiàn)的包括高度敏感的肌鈣蛋白、NT-pro BNP、左心室射血分?jǐn)?shù)等，可作為預(yù)測(cè)穩(wěn)定型冠狀動(dòng)脈疾病（stable coronary artery disease，SCAD）向AMI進(jìn)展的傳統(tǒng)診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，但這些指標(biāo)僅在初級(jí)預(yù)防情況下有效，且易受遺傳因素和環(huán)境因素干擾［3-4］。近年AMI早期診斷和治療進(jìn)展較快，但SCAD患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展為不穩(wěn)定型動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的病理機(jī)制尚不清楚。

生物信息學(xué)分析結(jié)合高通量測(cè)序是一種非常有效、準(zhǔn)確的方法用于探索疾病基因表達(dá)譜差異，能深入挖掘潛在的疾病相關(guān)基因，以便開(kāi)發(fā)新的診斷與治療策略。外周血中基因表達(dá)可反映包括心血管疾病在內(nèi)的各種復(fù)雜疾病變化，是檢測(cè)和驗(yàn)證疾病極為重要的生物標(biāo)志物。TAN等［5］觀(guān)察到外周血CPNE3低表達(dá)的SCAD患者更易向AMI進(jìn)展。WANG等［6］采 用GSE71226微 陣 列 數(shù) 據(jù) 集 結(jié) 合RT-qPCR證實(shí)，SCAD患者基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase，MMP）9和C-X-C基序趨化因子受體（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR）1表達(dá)顯著上調(diào)。VIJAY［7］采用GSE66360微陣列數(shù)據(jù)集探索差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，AMI患者CXCL2、MMP9、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）2和TLR4在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用中顯著富集。本研究將進(jìn)一步探索GSE71226與GSE66360微陣列數(shù)據(jù)集，試圖將其整合篩選SCAD向AMI進(jìn)展的相關(guān)核心基因和作用途徑，以期闡述其病理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1微陣列數(shù)據(jù)獲取 在基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載2個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE71226和GSE66360。GSE71226數(shù)據(jù)集包括3例SCAD和3例健康對(duì)照，取兩組外周血樣本，分別提取總RNA，采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)進(jìn)行分析。GSE66360數(shù)據(jù)集包括49例AMI患者和50例健康對(duì)照，取兩組外周血樣本，分別提取總RNA，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺(tái)分析。

1.2GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集處理 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Series Matrix File和Platforms文件。通過(guò)Perl腳本對(duì)2個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集進(jìn)行注釋和整合，去除1個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)分子探針，當(dāng)遇到對(duì)應(yīng)同一個(gè)分子探針時(shí)，僅保留信號(hào)值最大的探針。采用R軟件“sva”包進(jìn)行表達(dá)式值校正和數(shù)據(jù)歸一化處理，得到基因表達(dá)譜文件。采用R語(yǔ)言“l(fā)imma”包進(jìn)行兩組差異基因分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05和|log2 fold change|＞1，利用火山圖進(jìn)行可視化。利用“ggplot2”包對(duì)GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集得到的差異基因取交集，并定義SCAD向AMI進(jìn)展的關(guān)鍵基因，繪制維恩圖，采用熱圖對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行可視化。

1.3GO和KEGG富集分析GO是一種常用注釋基因功能的生物信息學(xué)工具。KEGG是系統(tǒng)分析基因功能，聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識(shí)庫(kù)。GSEA是一種廣泛應(yīng)用的軟件包，可衍生基因集確定兩組間不同生物學(xué)功能。以基因計(jì)數(shù)＞2和P＜

0.05為篩選閾值。

1.4蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)創(chuàng)建和核心基因鑒定 采用檢索相互作用基因的搜索工具（STRING 11.0，https：//string-db.org/）創(chuàng)建PPI網(wǎng)絡(luò)，以分值＞0.4為分界點(diǎn)。采用Cytoscape軟件插件Cytohubba（Cytoscape，3.7.1）顯示關(guān)鍵基因的關(guān)系，采用Cytoscape軟件插件MCODE 1.5.1鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.5核心基因的臨床驗(yàn)證 選取中國(guó)人民解放軍海軍安慶醫(yī)院2019年1月至2020年3月住院的168例SCAD患者作為SCAD組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①SCAD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》［8］；②年齡＞18歲；③本地常住居民。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心臟瓣膜病、先天性心臟??；②合并慢性疾病如阻塞性肺疾病、肝功能、腎功能衰竭；③中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或自身免疫系統(tǒng)疾病；④急慢性感染；⑤凝血功能障礙或血液疾?。虎迱盒阅[瘤。選擇同期體檢的健康志愿者24例作為對(duì)照組。所有SCAD患者均進(jìn)行有效隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2021年3月，期間共有34例患者發(fā)生AMI，定義為AMI組，未發(fā)生AMI定義為無(wú)AMI組（n=134）。AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》［9］。

1.6核心基因表達(dá)168例SCAD患者于入院后第1天8：00抽取空腹靜脈血5 ml，室溫靜置15～30 min，3 000 r/min離心10 min。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清核心基因表達(dá)，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值/標(biāo)準(zhǔn)品OD值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)檢測(cè)標(biāo)本OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算相應(yīng)濃度。隨訪(fǎng)期間發(fā)生AMI的患者于入院后第1天8：00抽取空腹靜脈血5 ml，核心基因表達(dá)檢測(cè)同上。對(duì)照組檢測(cè)血清核心基因表達(dá)方法同上。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用ROC曲線(xiàn)分析核心基因診斷SCAD患者進(jìn)展為AMI的性能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集差異基因分析GSE71226數(shù)據(jù)集中獲得1 122個(gè)差異基因，高表達(dá)327個(gè)，低表達(dá)795個(gè)（圖1A）。GSE66360數(shù)據(jù)集中獲得463個(gè)差異基因，高表達(dá)366個(gè)，低表達(dá)97個(gè)（圖1A）。GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集差異基因的交集基因見(jiàn)圖1B，共得到48個(gè)關(guān)鍵基因，具體表達(dá)特點(diǎn)見(jiàn)圖2。

圖1 GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集差異基因火山圖及交集基因Fig.1 Volcanic map of differential genes and their intersection genes in GSE71226 and GSE66360 datasets

圖2 GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集中48個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)特點(diǎn)熱圖Fig.2 Heat maps of 48 key gene expression characteristics in GSE71226 and GSE66360 datasets

2.248個(gè)關(guān)鍵基因的GO與KEGG分析48個(gè)關(guān)鍵基因?qū)隡etascape在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果顯示：GO分析主要富集于環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)、對(duì)應(yīng)力刺激的響應(yīng)及炎癥反應(yīng)等；KEGG分析主要富集于IL-17信號(hào)通路及PID IL1信號(hào)通路等（圖3）。

圖3 48個(gè)關(guān)鍵基因的GO與KEGG分析Fig.3 GO and KEGG analysis of 48 key genes

2.348個(gè)關(guān)鍵基因的GSEA分析 為進(jìn)一步鑒定48個(gè)關(guān)鍵基因中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因集，進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果顯示：關(guān)鍵基因中正相關(guān)的前3位最豐富基因集為線(xiàn)粒體反應(yīng)途徑、反應(yīng)途徑及基于CRISPR與初級(jí)纖毛發(fā)育相關(guān)的基因；負(fù)相關(guān)的前3位最豐富基因集為中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)、人體補(bǔ)體系統(tǒng)及脊髓損傷（圖4）。

圖4 48個(gè)關(guān)鍵基因的GSEA分析Fig.4 GSEA analysis of 48 key genes

2.448個(gè)關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因鑒定 為識(shí)別關(guān)鍵聚類(lèi)，將48個(gè)關(guān)鍵基因?qū)隨TRING構(gòu)建聚類(lèi)PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5A），PPI網(wǎng)絡(luò)中有38個(gè)節(jié)點(diǎn)，23個(gè)邊。采用Cytoscape中MCODE插件識(shí)別PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，得分為4分，共獲得4個(gè)核心基因：前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子AP（transcription factor AP-1，JUN）、CXCL2及MMP9，共4個(gè)節(jié)點(diǎn)，6條邊（圖5B）。

圖5 48個(gè)關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心基因鑒定Fig.5 PPI network construction and core hub gene identification of 48 key genes

2.5GSE71226和GSE66360數(shù)據(jù)集的核心基因表達(dá)比較2個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE71226和GSE66360的基因表達(dá)譜中，提取核心基因PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)。GSE71226數(shù)據(jù)集：SCAD組PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)均高于健康對(duì)照組（P＜0.05，圖6A）。GSE66360數(shù)據(jù)集：AMI組PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)均高于健康對(duì)照組（P＜0.05，圖6B）。

圖6 GSE71226、GSE66360數(shù)據(jù)集中SCAD組與健康對(duì)照組PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)Fig.6 PTGS2，JUN，CXCL2 and MMP9 expressions between SCAD group and healthy control group in GSE71226 and GSE66360 datasets

2.6臨床數(shù)據(jù)集驗(yàn)證外周血核心基因表達(dá)SCAD組患者PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），AMI組患者PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9蛋白表達(dá)高于非AMI組（P＜0.05，表1）。

表1 SCAD組與對(duì)照組核心基因表達(dá)Tab.1 Hub gene expressions in SCAD group and control group

2.7外周血核心基因蛋白表達(dá)ROC曲線(xiàn)分析ROC曲線(xiàn)評(píng)估PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)預(yù)測(cè)168例SCAD患者發(fā)生AMI的效能，PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9 AUC分別為0.747（0.704～0.867）、0.775（0.714～0.887）、0.773（0.708～0.874）、0.850（0.794～0.972），見(jiàn)圖7。

圖7 外周血核心基因蛋白表達(dá)ROC曲線(xiàn)Fig.7 ROC curve of peripheral blood hub gene protein expression

3 討論

SCAD向AMI進(jìn)展的病理機(jī)制尚不清楚。雖有研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病、高血壓、高脂血癥、吸煙和陽(yáng)性家族史是SCAD進(jìn)展為AMI的重要危險(xiǎn)因素，但這些因素并不是SCAD向AMI進(jìn)展的全部原因［10-11］。AMI患者中，20%患者無(wú)任何傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素，50%患者僅有1個(gè)危險(xiǎn)因素［12］。因此，闡述SCAD向AMI進(jìn)展的潛在病理學(xué)機(jī)制可為AMI防治提供理論依據(jù)。本研究根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集篩選出48個(gè)SCAD向AMI進(jìn)展的潛在關(guān)鍵基因，采用PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出4個(gè)核心基因（PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9），通過(guò)臨床驗(yàn)證這些基因表達(dá)可靠地預(yù)測(cè)SCAD向AMI進(jìn)展。

48個(gè)潛在關(guān)鍵基因的GO分析主要富集于環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)、對(duì)應(yīng)力刺激的響應(yīng)及炎癥反應(yīng)等。劉波等［13］發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)在AMI患者后心肌纖維化中起重要作用，且炎癥反應(yīng)也起重要作用［14］。KEGG分析主要富集IL-17信號(hào)通路及PID IL1信號(hào)通路等。自身免疫性疾病、心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌缺血中，IL-17在保護(hù)宿主不受細(xì)胞外病原體侵襲和促進(jìn)炎癥病理方面發(fā)揮重要作用［15］。進(jìn)一步研究表明，IL-17及其下游靶基因表達(dá)可能在誘導(dǎo)缺血性心力衰竭中起重要作用［16］。GSEA證明與SCAD向AMI進(jìn)展相關(guān)的前3位顯著富集基因集為線(xiàn)粒體反應(yīng)途徑、反應(yīng)途徑及基于CRISPR與初級(jí)纖毛發(fā)育相關(guān)的基因；負(fù)相關(guān)的前3位為中性粒細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)、人體補(bǔ)體系統(tǒng)及脊髓損傷。表明SCAD向AMI進(jìn)展的潛在病理機(jī)制復(fù)雜，是多種機(jī)體反應(yīng)參與及多種信號(hào)通路共同作用的結(jié)果。

聚類(lèi)分析顯示，PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9是參與SCAD向AMI進(jìn)展病理機(jī)制的核心基因。PTGS2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的一種酶，與腦卒中和心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，也可通過(guò)促進(jìn)增殖、抑制凋亡和血管生成參與腫瘤進(jìn)展［17］。大鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PTGS2可通過(guò)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)促進(jìn)AMI進(jìn)展［18］。JUN是二聚體轉(zhuǎn)錄復(fù)合物家族，參與多種細(xì)胞和生理功能，被認(rèn)為是細(xì)胞外信號(hào)的主要承擔(dān)者，使細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化，與移植排斥、纖維化、器官損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及哮喘等嚴(yán)重疾病有關(guān)，其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)途徑能促進(jìn)內(nèi)啡肽表達(dá)和心肌纖維化［19-20］。研究表明，JUN表達(dá)增加與冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［19］。此外，JUN在人類(lèi)頸動(dòng)脈斑塊中增加，與膽固醇酯相關(guān)，表明JUN可能是斑塊易損的生物學(xué)標(biāo)志［21］。CXCL2由激活的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生并在炎癥部位表達(dá)，損害機(jī)體心血管系統(tǒng)［22］。臨床觀(guān)察到AMI和SCAD患者CXCL2表達(dá)失衡，提示AMI患者免疫系統(tǒng)功能紊亂［23］。MMP9是鋅依賴(lài)的內(nèi)蛋白酶，負(fù)責(zé)組織重塑和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解，也是SCAD患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，MMP9水平與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定及壞死核心大小呈正相關(guān)［24-25］。PTGS2、JUN、CXCL2在SCAD向AMI進(jìn)展中具體的病理機(jī)制尚未明確，但被證實(shí)與心血管疾病相關(guān)。

為進(jìn)一步明確核心基因的臨床表達(dá)，課題組進(jìn)行了臨床樣本數(shù)據(jù)集驗(yàn)證。SCAD患者中觀(guān)察到PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9蛋白表達(dá)高于對(duì)照組；AMI組患者PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9蛋白表達(dá)高于SCAD組。表明PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9在SCAD向AMI進(jìn)展的病理機(jī)制中扮演重要角色。ROC曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，PTGS2、JUN、CXCL2及MMP9表達(dá)預(yù)測(cè)168例SCAD患者發(fā)生AMI的AUC分別為0.747、0.775、0.773、0.850，表明這些基因可有效預(yù)測(cè)SCAD向AMI進(jìn)展。同時(shí)其鑒定可為后續(xù)藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

本研究也存在局限性，一是本研究是在GEO數(shù)據(jù)集中分析篩選SCAD和AMI的外周血生物標(biāo)志物，入組患者較少；二是經(jīng)費(fèi)限制，無(wú)法開(kāi)展細(xì)胞層面的核心基因驗(yàn)證；最后，驗(yàn)證集樣本量較小，需進(jìn)一步證實(shí)。

綜上，本研究采用GEO數(shù)據(jù)集鑒定出PTGS2、JUN、CXCL2、MMP9 4個(gè)核心基因，可能為SCAD進(jìn)展為AMI的預(yù)防和治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。