張新燕 劉英香 趙國棟（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院，?？谑腥嗣襻t(yī)院肛腸科，?？?570208）

血清淀粉樣蛋白2（serum amyloid A2，SAA2）是急性時相蛋白（serum amyloid A，SAA）的一種，其他亞 型 包 括SAA1、SAA3和SAA4。SAA1、SAA2和SAA3作為急性響應蛋白在體內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮功能［1-3］。越來越多的研究表明，在機體遭受急性損傷等情況下，SAA1、SAA2和SAA3會大量表達，而SAA4則是以持續(xù)激活的形式表達［4］。目前的研究發(fā)現(xiàn)，SAA1、SAA2和SAA3蛋白可作為急性炎癥和組織損傷的重要生物標志物，在病毒、細菌感染、關(guān)節(jié)炎、克羅恩病等疾病中發(fā)揮輔助診斷作用［5-7］。近年來，SAA1在惡性腫瘤中的研究獲得了很大關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)血清中SAA1可作為胃癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌的生物標志物，且其表達水平與疾病的發(fā)展 進 程 密 切 相 關(guān)［8-10］。然 而 關(guān) 于SAA2、SAA3和SAA4亞型在腫瘤中的作用尚不明確。根據(jù)已有報道，SAA2與SAA1的序列同源性較高，因此本研究聚焦SAA2在結(jié)直腸癌中的表達和臨床意義。SAA2在結(jié)直腸癌中的表達及其與結(jié)直腸癌腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系尚未見報道。本研究從SAA2在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達水平入手，分析SAA2表達水平對結(jié)直腸癌患者預后的影響。同時SAA2作為重要的免疫調(diào)節(jié)分子，本研究也進一步闡述了其與結(jié)直腸癌腫瘤免疫微環(huán)境的聯(lián)系，為開發(fā)新的結(jié)直腸癌治療靶點提供重要參考。

1 材料與方法

1.1材料RIPA組織裂解液、蛋白酶抑制劑及羊抗兔過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自碧云天生物科技公司；SAA2抗體（13192-1-AP）及內(nèi)參抗體GAPDH購自武漢三鷹生物科技有限公司。將TCGA數(shù)據(jù)庫中275例結(jié)直腸癌腫瘤標本和349例癌旁正常組織和基因組織表達（genotype-tissue expression，GTEx）結(jié)腸組織納入本研究；將Oncomine數(shù)據(jù)庫中65對結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織納入本研究。4例結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織采集于?？谑腥嗣襻t(yī)院，患者均簽署知情同意書。組織標本取材于術(shù)中，將組織儲存于超低溫冰箱。

1.2方法

1.2.1基因表達分析 利用公共腫瘤數(shù)據(jù)庫TCGA和Oncomine分析結(jié)直腸癌腫瘤組織和癌旁正常組織中SAA2基因表達水平。TCGA數(shù)據(jù)分析在GEPIA工具中完成［11］，基因相對表達水平采用Log處理，以TPM+1表示（TPM：transcript per million）。正常組織由癌旁正常組織及GTEx正常組織共同組成。首先在Oncomine數(shù)據(jù)庫輸入SAA2基因，選擇Cancer type為colorectal cancer，分析類型設置為cancervsnormal，分析出Gaedcke colorectal數(shù)據(jù)集［12］中SAA2在腫瘤組織中的表達是癌旁正常組織的8.446倍。1.2.2Western blot收集的結(jié)直腸癌組織樣本儲存于超低溫冰箱，經(jīng)液氮速凍后進行研磨，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min。離心取上清，測定蛋白濃度，加入蛋白上樣buffer，100℃煮10 min后置于冰上。行8%的SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃過夜孵育一抗，TBST清洗3次后，室溫孵育二抗1 h，采用ECL系統(tǒng)進行蛋白顯影成像。采用Quantity One軟件進行蛋白表達水平的半定量分析。

1.2.3患者生存期分析 在Human protein Altas工具中分析TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)［13］。首先輸入目的基因，選擇病理組織類型為colorectal，將具有臨床隨訪信息的159例結(jié)直腸癌患者納入分析，以SAA2和SAA1基因的中位數(shù)表達水平為截斷值，將159例結(jié)直腸癌患者分為高表達組和低表達組，其中SAA2高表達組119例，低表達組40例，SAA1高表達組80例，低表達組有79例。采用Log-rank法進行生存曲線的統(tǒng)計分析。

1.2.4結(jié)直腸癌中腫瘤免疫得分相關(guān)性分析 利用TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)，采用CIBERSORT法分析SAA2基因表達水平與腫瘤組織中腫瘤純度得分（estimate score）相關(guān)性、腫瘤免疫得分（immune score）相關(guān)性及腫瘤組織中基質(zhì)得分（stromal score）相關(guān)性，相關(guān)性分析采用Spearman法［14］。

1.2.5結(jié)直腸癌腫瘤中基因相關(guān)性分析 在TISIDB腫瘤免疫交互系統(tǒng)工具中輸入SAA2基因名，選擇immunoinhibitors進行相關(guān)性分析，相關(guān)性分析采用Spearman法［15］。

1.2.6基因富集分析 根據(jù)TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)中SAA2基因表達中位數(shù)分為高表達組和低表達組，采用Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）法進行SAA2的基因富集分析，基因集數(shù)據(jù)庫選擇c2.cp.kegg.v7.1.gmt，number of permutations設置為1 000，phenotype labels設置為lowvshigh，富集統(tǒng)計采 用weighted模 式，metric for ranking genes選 擇Signal2Noise，最小基因集設置為15，最大基因集設置為500。

1.2.7組織中基因水平檢測12例結(jié)直腸癌標本的總RNA采用Trizol試劑盒提取，得到的總RNA采用反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，然后采用熒光定量PCR檢測SAA2、CD274和PDCD1的相對表達水平。SAA2正向引物：5'-GCTTCTTTTCGTTCCTTGGCG-3'，反向引物：5'-GCCGATGTAATTGGCTTCTCTCA-3'；CD274正向引物：5'-GCTGCACTAATTGTCTATTGGGA-3'，反向引物：5'-AATTCGCTTGTAGTCGGCACC-3'；PDCD1正 向 引 物：5'-CCAGGATGGTTCTTAGACTCCC-3'，反 向 引 物：5'-TTTAGCACGAAGCTCTCCGAT-3'。

1.3統(tǒng)計學處理 采用Graphpad Prism軟件進行統(tǒng)計繪圖，以±s展示數(shù)據(jù)。兩組間表達差異采用Student'st檢驗，以Spearman法進行相關(guān)性分析；總生存期分析采用Kaplan-Meier法進行Log-rank統(tǒng)計。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1SAA2基因在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達 在GEPIA工具中分析TCGA結(jié)直腸癌數(shù)據(jù)，其中結(jié)直腸癌腫瘤組織275例，癌旁組織和GTEx正常組織349例，SAA2基因在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常組織（P＜0.001，圖1A）。進一步在Oncomine腫瘤數(shù)據(jù)庫中分析，結(jié)果表明，相對于癌旁正常組織，腫瘤組織中SAA2表達水平顯著升高（8.446倍，P＜0.001，圖1B）。而SAA1在結(jié)直腸癌腫瘤組織中表達雖然有所升高，但不顯著（圖1C），且生存分析曲線也表明SAA1的表達水平對結(jié)直腸癌患者預后無明顯影響（P=0.89，圖1D）。

圖1 結(jié)直腸癌腫瘤組織中SAA2基因高表達Fig.1 SAA2 gene is highly expressed in colorectal tumor tissues

2.2結(jié)直腸癌腫瘤組織中SAA2蛋白高表達4例結(jié)直腸癌手術(shù)切除標本，包括對應癌旁正常組織，Western blot結(jié)果表明SAA2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖2）。

圖2 結(jié)直腸癌腫瘤組織中SAA2蛋白表達高于癌旁組織Fig.2 Protein expression of SAA2 was higher in colorectal tumor tissues than normal tissues

2.3結(jié)直腸癌中SAA2高表達患者生存期下降 由圖3可知，119例SAA2高表達組結(jié)直腸癌患者生存期顯著低于SAA2低表達組患者（P＜0.05）。SAA2高表達組中94例存活，25例死亡，而SAA2低表達組中39人存活，僅1人死亡，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1）。

表1 結(jié)直腸癌中SAA2表達水平與總生存期的關(guān)系Tab.1 Association between SAA2 and overall survival time in colorectal cancer

圖3 結(jié)直腸癌腫瘤組織高表達SAA2的患者生存期差Fig.3 Higher SAA2 expression of colorectal cancer patients showed worse survival rate

2.4結(jié)直腸癌中SAA2表達與腫瘤免疫浸潤微環(huán)境緊密相關(guān) 結(jié)直腸癌中SAA2表達水平與腫瘤組織中腫瘤純度的相關(guān)性分析顯示，兩者具有顯著的正相關(guān)關(guān)系（R=0.214，P=3.72e-06，圖4A），說明隨著腫瘤組織中腫瘤純度提高，SAA2表達升高，進一步驗證了SAA2在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達。對腫瘤組織中浸潤的免疫細胞進行免疫得分分析，發(fā)現(xiàn)SAA2與結(jié)直腸癌腫瘤組織中免疫得分呈正相關(guān)（R=0.346，P=2.63e-14，圖4B）。然而SAA2表達與結(jié)直腸癌中基質(zhì)得分差異無統(tǒng)計學意義（R=0.074，P=0.111，圖4C），說明結(jié)直腸癌中SAA2與腫瘤免疫浸潤微環(huán)境緊密相關(guān)。

圖4 結(jié)直腸癌腫瘤中SAA2與免疫浸潤微環(huán)境緊密相關(guān)Fig.4 SAA2 was closely associated with immune infiltration microenvironment in colorectal cancer

2.5結(jié)直腸癌中SAA2具有潛在的腫瘤免疫抑制功能 如圖5所示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中SAA2的表達與CD274、CD244、CTLA4、LAG3、PDCD1、IL-10、ADORA2A、TIGIT、BTLA4和CD160等免疫抑制性分子均呈正相關(guān)，提示結(jié)直腸癌中SAA2具有潛在的腫瘤免疫抑制功能。

圖5 結(jié)直腸癌中SAA2具有潛在的腫瘤免疫抑制功能Fig.5 SAA2 has potential regulation function of tumor immune suppression in colorectal cancer

2.6結(jié)直腸癌組織中SAA2與CD274和PDCD1呈正相關(guān) 分析12例結(jié)直腸癌組織中SAA2與CD274和PDCD1表達的相關(guān)性，進一步驗證SAA2與腫瘤免疫抑制分子的相關(guān)性，結(jié)果顯示，12例結(jié)直腸癌組織中SAA2與CD274和PDCD1的表達相關(guān)性較強，相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.90（P＜0.001，圖6），進一步驗證了結(jié)直腸癌中SAA2與免疫抑制分子的正相關(guān)關(guān)系。

圖6 結(jié)直腸癌腫瘤中SAA2與CD274和PDCD1表達的相關(guān)性Fig.6 Correlation between SAA2 and CD274 and PDCD1 expression in colorectal cancer

2.7結(jié)直腸癌中高表達的SAA2可能參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)信號通路負反饋調(diào)節(jié) 進一步基因富集分析顯示，結(jié)直腸癌高表達的SAA2與趨化因子信號通路和細胞因子受體相互作用網(wǎng)絡均呈明顯的負相關(guān)（圖7A、B），結(jié)直腸癌中SAA2表達與自然殺傷細胞介導的細胞毒作用及抗原呈遞信號網(wǎng)絡也呈負相關(guān)（圖7C、D）。而這些信號通路在抗腫瘤免疫功能的調(diào)控中均發(fā)揮重要作用，因此結(jié)直腸癌中高表達的SAA2可能參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)信號通路負反饋調(diào)節(jié)。

圖7 結(jié)直腸癌中SAA2可能參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)信號通路負反饋調(diào)節(jié)Fig.7 SAA2 may involve in negative regulation of antitumor immune-regulation signaling pathways

3 討論

SAA2是最重要的急性時相蛋白之一，在病毒和細菌感染、自體免疫性疾病，如關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等疾病中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能［2，9］。目前的研究進展顯示，SAA2作為SAA重要的成員之一，也能夠發(fā)揮生物標志物作用，在疾病的診斷和輔助治療方面發(fā)揮重要作用［1，6，8］。近年來，關(guān)于SAA2在腫瘤中的研究也獲得了越來越多的關(guān)注，SAA2在結(jié)直腸癌中的表達和功能仍不十分明確。同時，考慮到SAA2在免疫炎癥方面的重要調(diào)節(jié)作用，而炎癥免疫功能紊亂是結(jié)直腸癌炎-癌轉(zhuǎn)化等過程中的一大特點，本研究進一步分析了結(jié)直腸癌中SAA2表達與腫瘤免疫調(diào)節(jié)微環(huán)境間的潛在聯(lián)系。

本研究首先明確SAA2在結(jié)直腸癌中的表達水平，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌腫瘤組織中，SAA2無論在基因水平還是蛋白水平均呈高表達。既往研究發(fā)現(xiàn)，作為急性時相蛋白的SAA2在急性炎癥反應和組織損傷的情況下表達上調(diào)，進而介導免疫炎癥信號網(wǎng)絡調(diào)節(jié)，那么在結(jié)直腸癌中呈高表達狀態(tài)的SAA2又具有怎樣的生物學功能呢？為解決這一問題，本研究通過分析結(jié)直腸癌患者的生存期，闡述SAA2表達對結(jié)直腸癌患者生存期的影響。結(jié)果表明，高表達SAA2的結(jié)直腸癌患者生存期短，提示在結(jié)直腸癌中高表達的SAA2具有成為結(jié)直腸癌預后標志物的可能。既往研究也證實結(jié)腸癌患者血清中SAA2作為診斷標志物具有較好的診斷特異性和敏感度，即使在早期診斷方面也表現(xiàn)出較好的診斷效率［16-17］。本研究進一步豐富了SAA2在結(jié)直腸癌患者預后方面的意義，為結(jié)直腸癌的診斷和治療提供臨床參考意見。本研究還發(fā)現(xiàn)SAA1雖然在結(jié)直腸癌中的表達有所升高，但不如SAA2明顯，且SAA1表達水平對患者的生存期無明顯影響，進一步突出了SAA2在結(jié)直腸癌中的研究價值。有研究利用免疫組化檢測結(jié)直腸癌組織中SAA1高表達，并闡述其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和生存期顯著相關(guān)［18］。由于SAA1蛋白具有分泌功能，因此其不僅以蛋白組織表達形式存在，還存在分泌形式。本研究以基因水平為切入點分析，在一定程度上概括了其分泌型和組織表達型兩種模式，進一步豐富了既往研究結(jié)果。

既往研究明確了腫瘤基質(zhì)作為腫瘤復雜的微環(huán)境因素，介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］，同時，基于SAA2在免疫調(diào)節(jié)方面的重要作用及腫瘤免疫微環(huán)境對結(jié)直腸癌腫瘤進展的重要影響，本研究進一步分析了結(jié)直腸癌中SAA2表達水平與腫瘤免疫浸潤間的聯(lián)系，SAA2與腫瘤組織中腫瘤純度及浸潤的免疫細胞均呈顯著正相關(guān)，而與腫瘤組織中基質(zhì)無明顯相關(guān)性。大量研究表明腫瘤組織的免疫浸潤與腫瘤免疫耐受緊密相關(guān)，而SAA2與結(jié)直腸癌腫瘤組織中免疫浸潤得分顯著相關(guān)，表明SAA2可能參與結(jié)直腸癌免疫抑制微環(huán)境的調(diào)控。而關(guān)于SAA2在機體免疫調(diào)控方面的報道顯示，SAA2在機體炎癥應激條件下可介導TNF-α等促炎基因表達，然而其具體分子機制還有待進一步深入探究［20］。

炎癥是腫瘤微環(huán)境最重要的一方面［19］，因此本研究通過分析結(jié)直腸癌腫瘤組織中SAA2與系列免疫抑制性分子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)SAA2與CD274、CD244、CTLA4、LAG3、PDCD1、IL10、ADORA2A、TIGIT、BTLA4和CD160等經(jīng)典免疫抑制性因子均呈正相關(guān)。本研究還進一步在12例結(jié)直腸癌組織標本中驗證了SAA2與CD274和PDCD1的正相關(guān)關(guān)系，揭示SAA2可能具有潛在的腫瘤免疫抑制功能，而GSEA基因聚類分析也進一步說明結(jié)直腸癌中SAA2與趨化因子信號通路、細胞因子受體相互作用網(wǎng)絡、自然殺傷細胞介導的細胞毒作用及抗原呈遞信號通路均呈負相關(guān)，而這些信號通路在腫瘤免疫功能維持、免疫耐受產(chǎn)生等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，以上結(jié)果提示結(jié)直腸癌中高表達的SAA2可能參與抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)信號通路負反饋調(diào)節(jié)，進而促進結(jié)直腸癌腫瘤進展，提示結(jié)直腸癌患者的不良預后。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SAA2在結(jié)直腸癌中高表達，且其高表達與腫瘤免疫浸潤，特別是免疫抑制性分子緊密相關(guān)，進而在參與結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中影響結(jié)直腸癌患者的預后水平。