段方方 趙曉麗 侯小霞 王留晏 陳 露 周寒麗 張玉潔 孔天東

（河南省鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450000）

由于空氣、環(huán)境污染等諸多因素，肺癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率均較高，嚴(yán)重威脅公眾的生命安全［1］。肺癌患者中最為常見(jiàn)的類型是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），可占80%左右［2］。臨床顯示，NSCLC患者確診時(shí)已發(fā)展為中晚期階段，其病死率較高，五年生存率僅有20%左右［3-4］。盡管目前可采取手術(shù)、放療、化療等多種手段治療肺癌，以期達(dá)到清除病灶、延緩患者生命周期的目的，但部分患者治療效果不佳，后續(xù)仍可能會(huì)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等情況［5-6］。因此，肺癌的預(yù)防以及治療已成為癌癥研究的熱點(diǎn)。

泛素結(jié)合酶E2T（ubiquitin-conjugating enzyme E2T，UBE2T）基因早期被發(fā)現(xiàn)其可介導(dǎo)Fanconi貧血互補(bǔ)家族成員FANCD2、FANCL、FANCI等多種蛋白的泛素化降解，影響DNA損傷的修復(fù)，在Fanconi貧血的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要角色［7］。近年來(lái)隨著研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)UBE2T還參與了肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其表達(dá)水平與腫瘤患者的TNM分期、病理學(xué)分級(jí)、腫瘤血管浸潤(rùn)等臨床特征及無(wú)病生存期、總體生存期等預(yù)后情況均具有一定的相關(guān)性［8-10］。有研究顯示，UBE2T基因可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲，但其確切作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討［11］。基于此，本研究利用RNA干擾技術(shù)，觀察敲減UBE2T的表達(dá)后對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡、侵襲能力及裸鼠體內(nèi)成瘤的影響，初步探討UBE2T基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞A549增殖、凋亡及侵襲的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞NSCLC A549細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2動(dòng)物 雄性BALB/c裸小鼠40只，8～12周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011。

1.1.3試劑與儀器 慢病毒載體及輔助載體由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司提供；TRIzolTMReagent和LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄RNA試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa生物股份有限公司；Transwell小室及細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)BD公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；CCK-8試劑盒、Ki67、p21抗體、Caspase-3、cleaved cas3、Caspase-9、cleaved cas9、VEGF、N-cad抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；UBE2T抗體購(gòu)自美國(guó)Abgent公司；辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋公司；10%FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、其他常規(guī)分析純化學(xué)試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司或國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNM-9606酶標(biāo)分析儀購(gòu)自中國(guó)北京朗普新技術(shù)有限公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌A549細(xì)胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，0.25%胰酶+0.02%EDTA（1∶1）消化，制成細(xì)胞懸液，每2～3 d更換培養(yǎng)基進(jìn)行傳代。

1.2.2慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染 在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照說(shuō)明書，將LipofectamineTM2000分別與shRNA-NC、shRNA1、shRNA2、shRNA3進(jìn)行稀釋、混合，完成轉(zhuǎn)染。其中靶向UBE2T基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3載體轉(zhuǎn)染A549細(xì) 胞 為UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組，以空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染為陰性對(duì)照組（shRNA-NC組），未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞為空白對(duì)照組（Control組）。采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染各組肺癌A549細(xì)胞中的UBE2T mRNA表達(dá)水平，UBE2T正向引物：5'-CGGAATTCCGATGCAGAGAGATTCACGTCTG-3'，反向引物：5'-CGGGATCCCGGTCCCCTAAACATCAGGATG-3'，以GAPDH作 為 標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，以2-ΔΔCt值表示UBE2T mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染各組肺癌A549細(xì)胞中的UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)水平。選擇其中干擾效果較好的UBE2T-shRNA3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞為2×104個(gè)/L，接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，邊緣孔加入適量無(wú)菌PBS溶液填充，將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在接種前后不同時(shí)間點(diǎn)上向每孔滴加10 μl配好的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用DNM-9606酶標(biāo)分析儀檢測(cè)各孔在450 nm處的OD值，觀察細(xì)胞的增殖情況，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù) 收集各組細(xì)胞于離心管中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清，加入緩沖液混勻后，再加入5 μl Annexin V-FITC、10μl PI混合，4℃避光孵育20 min，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行上樣檢測(cè)，CellQuest軟件分析計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5Transwell小室法 細(xì)胞侵襲檢測(cè)在Transwell小室中進(jìn)行。取Matrigel稀釋液用移液器均勻涂抹在小室底部，待其均勻凝固。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，于小室內(nèi)加入1×105個(gè)/孔細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗滌3次，10%中性甲醛溶液固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，室溫晾干后將微孔薄膜刮下，固定在載玻片上。在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍（×400）視野，采用雙盲計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)侵襲過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6Western blot實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)48 h后，提取各組細(xì)胞的總蛋白，Bradford調(diào)節(jié)蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)至PVDF膜，密封2 h，添加一抗，4℃孵育過(guò)夜，用TBST漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光于X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值。以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，使用相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.7裸鼠分組及體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 將40只SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為2組，每組各20只。于裸小鼠腋下或背部皮下分別注射shRNA3感染的肺癌A549細(xì)胞（UBE2T-shRNA3組）和shRNA-NC感染的肺癌A549細(xì)胞（UBE2T-shRNA-NC組），每次注射5×106個(gè)活細(xì)胞。常規(guī)飼養(yǎng)31 d后將所有小鼠處死，取出皮下腫塊并稱取質(zhì)量。

1.2.8免疫組化法檢測(cè)小鼠瘤體Ki67、VEGF蛋白表達(dá) 取各組小鼠瘤體組織標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，將其制成3 μm切片。參考SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍（×400）視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性著色細(xì)胞所占百分比。Ki67以細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，VEGF以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 研究結(jié)果均以±s表示，采用GraphPad Prism、SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1重組慢病毒感染肺癌細(xì)胞A549后UBE2T基因干擾效果RT-PCR結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的UBE2T mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較差異無(wú) 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＞0.05），UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組 的UBE2T mRNA相對(duì)表達(dá)水平依次下降，且均明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖1A。

Western blot結(jié)果顯示shRNA-NC組和Control組的UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組的UBE2T蛋白相對(duì)表達(dá)水平依次下降，且均明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 重組慢病毒感染肺癌細(xì)胞A549后UBE2T基因干擾效果Fig.1 Interference effect of UBE2T gene after recombinant lentivirus infection in lung cancer cells A549

2.2UBE2T-shRNA3轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組在24 h、48 h、72 h、96 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率均低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。

Western blot結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的Ki67、p21蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的Ki67蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），p21蛋白的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖2B、C。

圖2 UBE2T-shRNA3轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖的影響Fig.2 Effects of UBE2T-shRNA3 transfection on proliferation of lung cancer cells A549

2.3UBE2T-shRNA3轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的細(xì)胞凋亡率明顯高于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、B。Western blot結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9比較差異無(wú)統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組 的cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9明顯高于shRNANC組（P＜0.05），見(jiàn)圖3C、D。

圖3 UBE2T-shRNA3轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響Fig.3 Effects of UBE2T-shRNA3 transfection on apoptosis of lung cancer cells A549

2.4UBE2T-shRNA3轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞侵襲的影響Transwell小室結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的穿膜細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖4A、B。

Western blot結(jié)果顯示，shRNA-NC組和Control組的VEGF、N-cad蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的VEGF、N-cad蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖4C。

2.5干擾UBE2T對(duì)裸鼠成瘤的影響RT-PCR結(jié)果顯示，UBE2T-shRNA3組的UBE2T mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖5A。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UBE2T-shRNA3組小鼠的瘤體質(zhì)量明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖5B。免疫組化結(jié)果顯示，UBE2T-shRNA3組小鼠瘤體組織中的Ki67、VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于shRNANC組（P＜0.05），見(jiàn)圖5C、D。

圖5 干擾UBE2T對(duì)裸鼠成瘤的影響Fig.5 Effects of interfering with UBE2T on nude mouse tumorigenicity

3 討論

肺癌是臨床較為常見(jiàn)的腫瘤之一，其確切的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，長(zhǎng)期大量吸煙、大氣污染等因素均與肺癌的發(fā)生有密切聯(lián)系［12］。近幾十年來(lái)，有多個(gè)國(guó)家報(bào)道肺癌的發(fā)病率、病死率顯著提升，對(duì)患者的生命安全造成巨大威脅［13］。因此，尋找肺癌治療的新突破對(duì)于提高患者生存周期具有重要的積極意義。

UBE2T基因位于人1號(hào)染色體長(zhǎng)臂32.1，共編碼197個(gè)氨基酸，其能夠介導(dǎo)泛素從泛素激活酶E1轉(zhuǎn)移到底物蛋白或E3連接酶，現(xiàn)已被證實(shí)與Fanconi貧血關(guān)系密切［14］。此外，有國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道UBE2T基因在腫瘤的疾病進(jìn)程中可能也起到癌基因的作用［15］。據(jù)報(bào)道，一方面，UBE2T可以干預(yù)細(xì)胞DNA的損傷和修復(fù)，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的過(guò)程；另一方面，UBE2T還能泛素化腫瘤抑癌基因（如p53、BRCA1等），從而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用［11，16］。PEREZ-PE?A等［17］研究顯示，UBE2T可能在乳腺和肺腫瘤的病理生理學(xué)中發(fā)揮作用，且與患者預(yù)后相關(guān)。LUO等［18］研究報(bào)道，UBE2T在胃癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，干擾UBE2T表達(dá)能夠引起胃癌細(xì)胞周期阻滯、凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且能夠通過(guò)改變EMT相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力，可能是胃癌患者的一個(gè)有用的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)來(lái)抑制肺癌細(xì)胞A549的UBE2T基因表達(dá)，并篩選出干擾效果較好的UBE2T-shRNA3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，敲減UBE2T表達(dá)后，肺癌細(xì)胞A549的增殖率明顯降低，提示敲減UBE2T表達(dá)后能抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖能力。同時(shí)，本研究還通過(guò)Western blot檢測(cè)了Ki67、p21蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，敲減UBE2T表達(dá)后，A549細(xì)胞中的Ki67蛋白表達(dá)下調(diào)，p21蛋白表達(dá)上調(diào)。Ki67的功能與有絲分裂密切相關(guān)，是常見(jiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖的蛋白之一，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)［19］；p21是p53抑癌基因的下游基因，其能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而影響細(xì)胞的增殖［20］。本研究推測(cè)，敲減UBE2T表達(dá)后A549細(xì)胞的抑制增殖能力能與Ki67蛋白表達(dá)下調(diào)，p21蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞A549受到sh-RNA3干擾后，細(xì)胞凋亡率顯著增高，提示敲減UBE2T表達(dá)后可誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。凋亡是細(xì)胞極為重要的生物學(xué)特征之一，其受到多種相關(guān)蛋白的調(diào)控，如Caspase家族等。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞A549受到shRNA3干擾后，cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9比值明顯增高，提示UBE2T被抑制后，可能會(huì)激活Caspase家族的凋亡啟動(dòng)子Caspase-3、Caspase-9，從而促進(jìn)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)敲減UBE2T表達(dá)后能抑制肺癌細(xì)胞A549的侵襲能力，下調(diào)VEGF、N-cad蛋白的表達(dá)水平。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及血管生成密切相關(guān)［21-22］；N-cad是EMT的重要標(biāo)志物，其表達(dá)升高可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的骨架系統(tǒng)排列出現(xiàn)異常，改變細(xì)胞的生理學(xué)形狀，造成黏附功能下降，增加腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［23］。推測(cè)UBE2T可能通過(guò)調(diào)控血管生成關(guān)鍵因子VEGF和EMT標(biāo)志物N-cad來(lái)影響A549細(xì)胞的侵襲，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索。

在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究還進(jìn)行了裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)明顯受抑制，其成瘤質(zhì)量明顯下降，證實(shí)了UBE2T基因能夠抑制裸鼠成瘤。同時(shí)，采用免疫組化法觀察到UBE2T-shRNA3組小鼠瘤體組織中Ki-67、VEGF蛋白表達(dá)明顯低于shRNANC組，提示Ki-67、VEGF蛋白在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用；敲減UBE2T表達(dá)能降低瘤體組織中Ki-67、VEGF蛋白表達(dá)。

綜上所述，敲減UBE2T基因的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并能抑制裸鼠成瘤，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)Ki67、p21、Caspase-3、Caspase-9、VEGF、N-cad等蛋白表達(dá)有關(guān)。然而，有關(guān)UBE2T基因?qū)ο嚓P(guān)蛋白的具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。