段方方 趙曉麗 侯小霞 王留晏 陳 露 周寒麗 張玉潔 孔天東

（河南省鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，鄭州 450000）

由于空氣、環(huán)境污染等諸多因素，肺癌在世界范圍內的發(fā)病率均較高，嚴重威脅公眾的生命安全［1］。肺癌患者中最為常見的類型是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），可占80%左右［2］。臨床顯示，NSCLC患者確診時已發(fā)展為中晚期階段，其病死率較高，五年生存率僅有20%左右［3-4］。盡管目前可采取手術、放療、化療等多種手段治療肺癌，以期達到清除病灶、延緩患者生命周期的目的，但部分患者治療效果不佳，后續(xù)仍可能會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)、轉移等情況［5-6］。因此，肺癌的預防以及治療已成為癌癥研究的熱點。

泛素結合酶E2T（ubiquitin-conjugating enzyme E2T，UBE2T）基因早期被發(fā)現(xiàn)其可介導Fanconi貧血互補家族成員FANCD2、FANCL、FANCI等多種蛋白的泛素化降解，影響DNA損傷的修復，在Fanconi貧血的發(fā)病過程中扮演了重要角色［7］。近年來隨著研究的深入，有學者發(fā)現(xiàn)UBE2T還參與了肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，其表達水平與腫瘤患者的TNM分期、病理學分級、腫瘤血管浸潤等臨床特征及無病生存期、總體生存期等預后情況均具有一定的相關性［8-10］。有研究顯示，UBE2T基因可抑制NSCLC細胞的增殖和侵襲，但其確切作用機制仍有待進一步探討［11］?；诖耍狙芯坷肦NA干擾技術，觀察敲減UBE2T的表達后對肺癌細胞A549增殖、凋亡、侵襲能力及裸鼠體內成瘤的影響，初步探討UBE2T基因對肺癌細胞A549增殖、凋亡及侵襲的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞NSCLC A549細胞系購自中國科學院（上海）生物化學與細胞生物學研究所。

1.1.2動物 雄性BALB/c裸小鼠40只，8～12周齡，體質量20～25 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.1.3試劑與儀器 慢病毒載體及輔助載體由上海吉凱基因技術公司提供；TRIzolTMReagent和LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉錄RNA試劑盒、PCR試劑盒購自日本TaKaRa生物股份有限公司；Transwell小室及細胞培養(yǎng)皿購自美國BD公司；PVDF膜、ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司；CCK-8試劑盒、Ki67、p21抗體、Caspase-3、cleaved cas3、Caspase-9、cleaved cas9、VEGF、N-cad抗體購自英國Abcam公司；UBE2T抗體購自美國Abgent公司；辣根酶標記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋公司；10%FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、其他常規(guī)分析純化學試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司或國藥集團化學試劑有限公司；DNM-9606酶標分析儀購自中國北京朗普新技術有限公司；FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 肺癌A549細胞在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，0.25%胰酶+0.02%EDTA（1∶1）消化，制成細胞懸液，每2～3 d更換培養(yǎng)基進行傳代。

1.2.2慢病毒包裝及轉染 在細胞對數(shù)生長期，細胞密度達80%時進行轉染。參照說明書，將LipofectamineTM2000分別與shRNA-NC、shRNA1、shRNA2、shRNA3進行稀釋、混合，完成轉染。其中靶向UBE2T基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3載體轉染A549細 胞 為UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組，以空載體質粒轉染為陰性對照組（shRNA-NC組），未轉染質粒的細胞為空白對照組（Control組）。采用RT-PCR法檢測轉染各組肺癌A549細胞中的UBE2T mRNA表達水平，UBE2T正向引物：5'-CGGAATTCCGATGCAGAGAGATTCACGTCTG-3'，反向引物：5'-CGGGATCCCGGTCCCCTAAACATCAGGATG-3'，以GAPDH作 為 標準內參，以2-ΔΔCt值表示UBE2T mRNA的相對表達量。Western blot法檢測轉染各組肺癌A549細胞中的UBE2T蛋白相對表達水平。選擇其中干擾效果較好的UBE2T-shRNA3進行后續(xù)實驗。

1.2.3CCK-8取對數(shù)生長期的各組細胞制成細胞懸液，調整細胞為2×104個/L，接種于96孔板，每組設6個復孔，邊緣孔加入適量無菌PBS溶液填充，將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。在接種前后不同時間點上向每孔滴加10 μl配好的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用DNM-9606酶標分析儀檢測各孔在450 nm處的OD值，觀察細胞的增殖情況，繪制生長曲線。

1.2.4流式細胞術 收集各組細胞于離心管中，每組設3個復孔。1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2遍，棄上清，加入緩沖液混勻后，再加入5 μl Annexin V-FITC、10μl PI混合，4℃避光孵育20 min，采用FACSCalibur流式細胞儀進行上樣檢測，CellQuest軟件分析計算細胞凋亡率。

1.2.5Transwell小室法 細胞侵襲檢測在Transwell小室中進行。取Matrigel稀釋液用移液器均勻涂抹在小室底部，待其均勻凝固。取處于對數(shù)生長期的各組細胞制備成細胞懸液，調整細胞濃度，于小室內加入1×105個/孔細胞，每組設3個復孔。將其置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗滌3次，10%中性甲醛溶液固定30 min，結晶紫染色10 min，室溫晾干后將微孔薄膜刮下，固定在載玻片上。在顯微鏡下隨機選擇10個高倍（×400）視野，采用雙盲計數(shù)法統(tǒng)計侵襲過膜的細胞數(shù)目。

1.2.6Western blot實驗 培養(yǎng)48 h后，提取各組細胞的總蛋白，Bradford調節(jié)蛋白濃度。經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳、電轉至PVDF膜，密封2 h，添加一抗，4℃孵育過夜，用TBST漂洗40 min，加入HRP標記的二抗，孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL發(fā)光液顯色，暗室曝光于X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值。以GAPDH為標準內參，使用相對灰度值進行統(tǒng)計學分析。

1.2.7裸鼠分組及體內成瘤實驗 將40只SPF級雄性BALB/c裸鼠隨機分為2組，每組各20只。于裸小鼠腋下或背部皮下分別注射shRNA3感染的肺癌A549細胞（UBE2T-shRNA3組）和shRNA-NC感染的肺癌A549細胞（UBE2T-shRNA-NC組），每次注射5×106個活細胞。常規(guī)飼養(yǎng)31 d后將所有小鼠處死，取出皮下腫塊并稱取質量。

1.2.8免疫組化法檢測小鼠瘤體Ki67、VEGF蛋白表達 取各組小鼠瘤體組織標本經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，將其制成3 μm切片。參考SP免疫組化試劑盒說明書進行免疫組化實驗，在顯微鏡下隨機選擇10個高倍（×400）視野，統(tǒng)計陽性著色細胞所占百分比。Ki67以細胞核呈棕黃色為陽性表達，VEGF以細胞漿或細胞膜呈棕黃色為陽性表達。

1.3統(tǒng)計學處理 研究結果均以±s表示，采用GraphPad Prism、SPSS22.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1重組慢病毒感染肺癌細胞A549后UBE2T基因干擾效果RT-PCR結果顯示，shRNA-NC組和Control組的UBE2T mRNA相對表達水平比較差異無 統(tǒng) 計 學 意 義（P＞0.05），UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組 的UBE2T mRNA相對表達水平依次下降，且均明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖1A。

Western blot結果顯示shRNA-NC組和Control組的UBE2T蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），UBE2T-shRNA1組、UBE2T-shRNA2組、UBE2T-shRNA3組的UBE2T蛋白相對表達水平依次下降，且均明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖1B。

圖1 重組慢病毒感染肺癌細胞A549后UBE2T基因干擾效果Fig.1 Interference effect of UBE2T gene after recombinant lentivirus infection in lung cancer cells A549

2.2UBE2T-shRNA3轉染對肺癌細胞A549增殖的影響CCK-8結果顯示，shRNA-NC組和Control組在24 h、48 h、72 h、96 h各時間點的細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組在各時間點的細胞增殖率均低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖2A。

Western blot結果顯示，shRNA-NC組和Control組的Ki67、p21蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的Ki67蛋白的相對表達水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），p21蛋白的相對表達水平明顯高于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖2B、C。

圖2 UBE2T-shRNA3轉染對肺癌細胞A549增殖的影響Fig.2 Effects of UBE2T-shRNA3 transfection on proliferation of lung cancer cells A549

2.3UBE2T-shRNA3轉染對肺癌細胞A549凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，shRNA-NC組和Control組的細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的細胞凋亡率明顯高于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖3A、B。Western blot結果顯示，shRNA-NC組和Control組的cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9比較差異無統(tǒng) 計 學 意 義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組 的cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9明顯高于shRNANC組（P＜0.05），見圖3C、D。

圖3 UBE2T-shRNA3轉染對肺癌細胞A549凋亡的影響Fig.3 Effects of UBE2T-shRNA3 transfection on apoptosis of lung cancer cells A549

2.4UBE2T-shRNA3轉染對肺癌細胞A549細胞侵襲的影響Transwell小室結果顯示，shRNA-NC組和Control組的穿膜細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的穿膜細胞數(shù)明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖4A、B。

Western blot結果顯示，shRNA-NC組和Control組的VEGF、N-cad蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但UBE2T-shRNA3組的VEGF、N-cad蛋白相對表達水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖4C。

2.5干擾UBE2T對裸鼠成瘤的影響RT-PCR結果顯示，UBE2T-shRNA3組的UBE2T mRNA相對表達水平明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖5A。體內實驗結果顯示，UBE2T-shRNA3組小鼠的瘤體質量明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖5B。免疫組化結果顯示，UBE2T-shRNA3組小鼠瘤體組織中的Ki67、VEGF蛋白陽性表達率明顯低于shRNANC組（P＜0.05），見圖5C、D。

圖5 干擾UBE2T對裸鼠成瘤的影響Fig.5 Effects of interfering with UBE2T on nude mouse tumorigenicity

3 討論

肺癌是臨床較為常見的腫瘤之一，其確切的發(fā)病機制至今尚未完全明確，多數(shù)學者認為，長期大量吸煙、大氣污染等因素均與肺癌的發(fā)生有密切聯(lián)系［12］。近幾十年來，有多個國家報道肺癌的發(fā)病率、病死率顯著提升，對患者的生命安全造成巨大威脅［13］。因此，尋找肺癌治療的新突破對于提高患者生存周期具有重要的積極意義。

UBE2T基因位于人1號染色體長臂32.1，共編碼197個氨基酸，其能夠介導泛素從泛素激活酶E1轉移到底物蛋白或E3連接酶，現(xiàn)已被證實與Fanconi貧血關系密切［14］。此外，有國內外學者報道UBE2T基因在腫瘤的疾病進程中可能也起到癌基因的作用［15］。據(jù)報道，一方面，UBE2T可以干預細胞DNA的損傷和修復，從而參與調節(jié)細胞周期和細胞凋亡的過程；另一方面，UBE2T還能泛素化腫瘤抑癌基因（如p53、BRCA1等），從而起到促進腫瘤細胞的生長作用［11，16］。PEREZ-PE?A等［17］研究顯示，UBE2T可能在乳腺和肺腫瘤的病理生理學中發(fā)揮作用，且與患者預后相關。LUO等［18］研究報道，UBE2T在胃癌細胞中呈高表達，干擾UBE2T表達能夠引起胃癌細胞周期阻滯、凋亡，抑制腫瘤細胞生長，且能夠通過改變EMT相關因子的表達來抑制腫瘤細胞的遷移與侵襲能力，可能是胃癌患者的一個有用的預后生物標志物和治療靶點。

本研究通過RNA干擾技術來抑制肺癌細胞A549的UBE2T基因表達，并篩選出干擾效果較好的UBE2T-shRNA3進行后續(xù)實驗。CCK-8和流式細胞術結果顯示，敲減UBE2T表達后，肺癌細胞A549的增殖率明顯降低，提示敲減UBE2T表達后能抑制肺癌細胞A549的增殖能力。同時，本研究還通過Western blot檢測了Ki67、p21蛋白的表達情況，結果顯示，敲減UBE2T表達后，A549細胞中的Ki67蛋白表達下調，p21蛋白表達上調。Ki67的功能與有絲分裂密切相關，是常見的調控細胞增殖的蛋白之一，其表達水平與細胞增殖能力呈正相關［19］；p21是p53抑癌基因的下游基因，其能夠通過調節(jié)細胞周期而影響細胞的增殖［20］。本研究推測，敲減UBE2T表達后A549細胞的抑制增殖能力能與Ki67蛋白表達下調，p21蛋白表達上調有關。Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術結果顯示，肺癌細胞A549受到sh-RNA3干擾后，細胞凋亡率顯著增高，提示敲減UBE2T表達后可誘導A549細胞發(fā)生凋亡。凋亡是細胞極為重要的生物學特征之一，其受到多種相關蛋白的調控，如Caspase家族等。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞A549受到shRNA3干擾后，cleaved cas3/cas3、cleaved cas9/cas9比值明顯增高，提示UBE2T被抑制后，可能會激活Caspase家族的凋亡啟動子Caspase-3、Caspase-9，從而促進A549細胞發(fā)生凋亡。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)敲減UBE2T表達后能抑制肺癌細胞A549的侵襲能力，下調VEGF、N-cad蛋白的表達水平。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，與血管內皮細胞遷移、增殖及血管生成密切相關［21-22］；N-cad是EMT的重要標志物，其表達升高可能會導致腫瘤細胞的骨架系統(tǒng)排列出現(xiàn)異常，改變細胞的生理學形狀，造成黏附功能下降，增加腫瘤細胞向周圍組織侵襲、轉移的風險［23］。推測UBE2T可能通過調控血管生成關鍵因子VEGF和EMT標志物N-cad來影響A549細胞的侵襲，但其具體的調控機制仍有待進一步的探索。

在體外實驗的基礎上，本研究還進行了裸鼠成瘤實驗，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長明顯受抑制，其成瘤質量明顯下降，證實了UBE2T基因能夠抑制裸鼠成瘤。同時，采用免疫組化法觀察到UBE2T-shRNA3組小鼠瘤體組織中Ki-67、VEGF蛋白表達明顯低于shRNANC組，提示Ki-67、VEGF蛋白在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用；敲減UBE2T表達能降低瘤體組織中Ki-67、VEGF蛋白表達。

綜上所述，敲減UBE2T基因的表達可以抑制肺癌細胞A549的增殖、侵襲，促進細胞凋亡，并能抑制裸鼠成瘤，其作用機制與調節(jié)Ki67、p21、Caspase-3、Caspase-9、VEGF、N-cad等蛋白表達有關。然而，有關UBE2T基因對相關蛋白的具體調控機制仍有待進一步的實驗研究。