陳家顯 陳 磊 張遠(yuǎn)生 劉先霞 陳勁松（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，?？?570311）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由嗜心性病毒引發(fā)的心肌局限或彌漫性炎癥性病變，是一種復(fù)雜的兒童獲得性心血管系統(tǒng)疾病，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢［1］。目前VMC的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但有研究顯示，VMC的發(fā)生、發(fā)展過程與病毒感染后機(jī)體炎癥通路激活密切相關(guān)［2］。NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是免疫反應(yīng)的重要組成部分，與心血管疾病關(guān)系密切。眾多研究已證實(shí)，NLRP3炎癥小體的激活參與心肌病和心律失常等疾病的發(fā)生發(fā)展過程，提示NLRP3炎癥通路可能成為VMC治療的新靶點(diǎn)［3-4］。目前VMC的臨床治療以輔助支持療法和抗病毒治療為主，但效果并不理想，因此急需尋找能有效抑制VMC的藥物。隨著現(xiàn)代藥物提取工藝和科學(xué)技術(shù)的飛躍發(fā)展，中藥相關(guān)單體在抗病毒、防止心臟重構(gòu)、免疫調(diào)節(jié)方面取得較大成就［5］。芍藥苷（paeoniflorin，PF）是傳統(tǒng)中藥芍藥的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功能［6］。既往研究表明，PF具有減輕心肌肥厚、抑制心肌纖維化、減少心肌炎癥反應(yīng)、改善左室功能、促進(jìn)心室重構(gòu)等作用，但目前關(guān)于PF在VMC中作用的研究甚少［7-8］。本研究擬采用柯薩奇B3（coxsackievirus B3，CVB3）病毒感染構(gòu)建VMC小鼠模型，研究PF對VMC的保護(hù)作用，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗動物60只SPF級雄性BALB/c小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，由湖南省實(shí)驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK（湘）2016-0002。

1.1.2主要試劑與儀器PF（純度≥98%，批號：190301）購自成都曼思特生物科技有限公司；CVB3嗜心肌Nancy標(biāo)準(zhǔn)株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保存中心（ATCC）；單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）購自法國InvivoGen公司；TUNEL染色試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司；Cleaved caspase-3、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、半胱天冬酶-1（caspase-1）和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白（Mb）購自上海索萊寶生物科技有限公司；IL-1β、IL-18和TNF-α ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及分組處理60只BALB/c小鼠隨機(jī)分成空白對照組（blank）、VMC模型組（VMC）、PF低劑量組（PF-L，10 mg/kg）、PF高劑量組（PF-H，40 mg/kg）和高劑量PF聯(lián)合NLRP3激動劑組（PF-H+MSU，40 mg/kg PF+5 mg/kg MSU），每組12只。采用腹腔注射0.1 ml 100 TCID50的CVB3病毒溶液建立病毒性心肌炎小鼠模型［9］，次日開始腹腔注射給藥，給藥體積為0.25 ml，對照組和模型組注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。7 d后眼球取血，分離血清后儲存于-80℃冰箱待檢。采血后頸椎脫臼法處死小鼠，留取心臟組織，取部分組織置于4%多聚甲醛固定，其余組織置于液氮中保存。

1.2.2HE染色觀察心肌損傷情況 收集各組小鼠心肌組織，經(jīng)生理鹽水洗凈后用4%多聚甲醛固定，經(jīng)包埋后行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀察心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.3TUNEL染色觀察心肌組織細(xì)胞凋亡情況

收集各組小鼠心肌組織，包埋后進(jìn)行石蠟切片，常規(guī)脫蠟，PBS漂洗，加蛋白酶K室溫下水解20 min，加蒸餾水洗，3%過氧化氫室溫下反應(yīng)5 min，PBS漂洗3次。加TUNEL反應(yīng)液，于37℃濕盒中避光孵育60 min，PBS漂洗3次，加過氧化物酶標(biāo)記的抗體，濕盒中室溫孵育30 min，PBS漂洗3次，加顯色液，室溫反應(yīng)5 min。蒸餾水洗，脫水，透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個視野，心肌細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4ELISA法檢測心肌損傷標(biāo)志物及炎癥因子 收集各組小鼠血清和心肌組織，心肌組織勻漿離心后收集上清液，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中心肌損傷標(biāo)志物cTnⅠ、CKMB、Mb及心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量。1.2.5Western blot檢測蛋白表達(dá) 取適量心肌組織，加入RIPA裂解液充分研磨勻漿至液體狀態(tài)，12 000 r/min離心25 min，收集上清液，BCA法測定上清液中總蛋白含量。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗抗體稀釋液（Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、caspase-1、GAPDH，1∶1 000），4℃過夜孵育，次日加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。最后加入發(fā)光液于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，利用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值，作為目的蛋白表達(dá)的相對水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS22.0軟件進(jìn)行處理，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PF對VMC小鼠體質(zhì)量及狀態(tài)的影響 如表1所示，blank組、VMC組、PF-L組、PF-H組和PF-H+MSU組小鼠在飼養(yǎng)1 d、3 d、5 d、7 d期間體質(zhì)量均呈逐漸上升的趨勢，但在5 d、7 d時VMC組、PF-L組和PF-H+MSU組小鼠體質(zhì)量顯著低于blank組，同時出現(xiàn)皮毛無光澤、活動減少、蜷縮駝背等委頓癥狀。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，n=12，g）Tab.1 Comparison of body weight of mice in each group（±s，n=12，g）

Note：-1 d.The day before inoculation of the virus；0 d.The day of virus inoculation.1）P＜0.01 vs blank group.

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2.2PF對VMC小鼠心肌組織損傷的影響 如圖1所示，blank組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，未見炎癥細(xì)胞浸潤；VMC組、PF-L組和PF-H+MSU組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，細(xì)胞排列紊亂，伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤；PF-H小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞排列大致有序，有少量炎癥細(xì)胞浸潤。

圖1 各組小鼠心肌組織病理學(xué)觀察（HE染色，×200）Fig.1 Histopathological observation of myocardium of mice in each group（HE staining，×200）

2.3PF對VMC小鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物含量的影響 如圖2所示，與blank組比較，VMC組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較Fig.2 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum of mice in each group

2.4PF對VMC小鼠心肌組織中炎癥因子含量的影響 如圖3所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著減少（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量比較Fig.3 Comparison of contents of IL-1β，IL-18 and TNF-α in myocardium of mice in each group

2.5PF對VMC小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖4所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率顯著提高（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），PF-L組

圖4 各組小鼠的心肌組織細(xì)胞凋亡情況比較Fig.4 Comparison of apoptosis of myocardial tissue cells of mice in each group

無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01），心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）。

2.6PF對VMC小 鼠 心 肌組 織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平的影響 如圖5所示，與blank組比較，VMC組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與VMC組比較，PF-H組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），PF-L組無顯著變化（P＞0.05）；與PF-H組比較，PF-H+MSU組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖5 各組小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in myocardium of mice in each group

3 討論

VMC的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多認(rèn)為與病毒直接損傷心肌組織以及機(jī)體自身不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)相關(guān)，越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體參與了VMC的發(fā)病過程：魏傲等［10］研究發(fā)現(xiàn)，VMC患者外周血中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平顯著升高，推斷VMC的發(fā)生可能與NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)；WANG等［11］研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎癥小體激活能減輕VMC模型小鼠心肌炎癥損傷，有效改善VMC模型小鼠心功能。提示NLRP3炎癥小體可能是VMC過程中一個極其重要的炎癥致病通路，也是一個可能潛在治療靶點(diǎn)。近些年天然產(chǎn)物在改善心肌損傷及減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)方面的積極作用被越來越多的學(xué)者關(guān)注，PF是中國傳統(tǒng)中藥芍藥中的主要活性成分，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病，但PF在VMC中是否具有治療效果目前還未見報道。本研究結(jié)果顯示，PF能夠顯著減少VMC小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，下調(diào)血清及心肌組織炎癥因子含量，從而抑制心肌組織細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過抑制NLRP3炎癥小體通路的激活來實(shí)現(xiàn)的。

局限性和彌散性的心肌組織壞死、炎癥細(xì)胞浸潤是VMC過程中典型的病理變化，本研究中HE染色結(jié)果顯示，VMC模型小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)破壞，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，與既往研究一致，提示CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠模型構(gòu)建成功［12］。給予高劑量PF治療后，小鼠心肌組織病理損傷明顯減輕，心肌細(xì)胞排列趨于規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。cTnⅠ、CK-MB和Mb為心肌損傷特異性標(biāo)志物［13］，正常情況下cTnⅠ以復(fù)合物或游離狀態(tài)存在于心肌細(xì)胞中，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時，cTnⅠ會被釋放到血液中，使其在血液中的含量異常升高；CK-MB是心肌中重要的能量調(diào)節(jié)酶，VMC發(fā)生時快速進(jìn)入血液，其在血液中的含量能特異地反映心肌受損程度；Mb具有貯存和運(yùn)輸氧的功能，心肌損傷時血液中的Mb會迅速升高，眾多研究顯示，VMC過程中cTnⅠ、CKMB和Mb含量會明顯上升［14-15］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，VMC模型小鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著升高，高劑量PF治療能顯著降低其水平，說明PF能有效緩解CVB3造成的心肌損傷。

病毒感染造成心肌細(xì)胞死亡是導(dǎo)致心肌炎患者心臟功能減退的主要原因，當(dāng)病毒侵襲心肌細(xì)胞時，機(jī)體一方面可激活凋亡程序，通過犧牲感染細(xì)胞達(dá)到清除病毒的作用；另一方面，病毒也可調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡［16］。本研究中TUNEL檢測結(jié)果顯示，與正常組對照比較，VMC模型小鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯增高，心肌組織中Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，與LI等［17］研究發(fā)現(xiàn)一致，而高劑量PF治療組心肌細(xì)胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)，說明PF能通過抑制VMC模型小鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對心肌組織的保護(hù)作用。

NLRP3炎癥小體是由NLRP3蛋白、ASC和caspase-1組成的大分子多蛋白復(fù)合體，通常情況下，機(jī)體NLRP3活性處于抑制狀態(tài)，當(dāng)NLRP3受外界刺激被激活時，活化的效應(yīng)蛋白caspase-1可促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟與釋放，加劇炎癥反應(yīng)，參與VMC的發(fā)生發(fā)展［18］。為進(jìn)一步探究PF改善VMC小鼠心肌損傷的作用機(jī)制，本研究對心肌組織中NLRP3炎癥小體通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平以及炎癥因子含量進(jìn)行了檢測，研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，VMC模型小鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表達(dá)水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α含量顯著增加，高劑量PF治療能顯著降低其在心肌組織中的含量，但PF和NLRP3激動劑聯(lián)合治療后，PF抑制NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)水平以及IL-1β、IL-18和TNF-α水平的作用降低，提示PF可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化減輕VMC小鼠心肌損傷。

綜上所述，PF可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕VMC小鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞凋亡，改善CVB3造成的心肌組織損傷，該研究結(jié)果可為VMC臨床治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗依據(jù)。