呂艷利 巴 凱 方 政 商留珂（洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)，洛陽 471000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma， OSCC）是指發(fā)生于口腔內(nèi)的惡性腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，OSCC五年生存率僅有40%～50%，且發(fā)病迅速，預(yù)后極差，嚴(yán)重影響人們生命健康和生活質(zhì)量［2］。目前，國內(nèi)外針對(duì)OSCC的臨床治療方法主要有手術(shù)治療、放化療、基因靶向治療和中醫(yī)中藥輔助治療等［3-5］。穿心蓮內(nèi)酯是天然植物穿心蓮的有效成分，難溶于水，具有祛熱解毒、消炎止痛之功效，對(duì)細(xì)菌或病毒性上呼吸道感染有治療作用［6］。研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用，如穿心蓮內(nèi)酯通過上調(diào)死亡受體4（DR4）促進(jìn)人腎癌細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感，穿心蓮內(nèi)酯通過ROS/JNK途徑誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡，穿心蓮內(nèi)酯通過提高活性氧水平使Hep-2人喉癌細(xì)胞對(duì)卡鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感等［7-9］。但穿心蓮內(nèi)酯在OSCC體內(nèi)外的研究鮮見報(bào)道，因此，本研究旨在通過細(xì)胞水平及動(dòng)物水平研究穿心蓮內(nèi)酯在OSCC體內(nèi)外的影響作用，為穿心蓮內(nèi)酯在OSCC診斷與治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物、試劑及儀器 穿心蓮內(nèi)酯（純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司；OSCC細(xì)胞系CAL-27由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；CCK8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RT-PCR試劑盒和Hoechst染色試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；PI單染細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司；免疫組化試劑盒購自美國Invitrogen公司；caspase-9兔多克隆抗體、caspase-3兔多克隆抗體、cleaved PARP兔單克隆抗體、上皮型鈣黏蛋白（Ecadherin）兔單克隆抗體、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）兔單克隆抗體、波形蛋白（Vimentin）兔多克隆抗體和TGF-β1兔單克隆抗體均購自美國Abcam公司。

RT-PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，東勝龍ETC811）；臺(tái)式高速離心機(jī)（大龍，D3024R），酶標(biāo)儀（Rayto，RT6100）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R）。

1.1.2動(dòng)物 雄性BALB/c小鼠（6周齡，體質(zhì)量20～25 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0022。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：每只小鼠給予24 h晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理，24℃條件下獨(dú)立飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物建模及給藥 將小鼠分為對(duì)照組、25 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組、50 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組和100 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組。建模：OSCC細(xì)胞系CAL-27以5×106個(gè)/ml皮下注射小鼠建立移植瘤裸鼠模型，實(shí)驗(yàn)給藥組參照文獻(xiàn)［10］分別灌胃給藥25、50、100 mg/kg的穿心蓮內(nèi)酯，4周后分離各組小鼠移植瘤組織并稱取腫瘤重量。

1.2.2CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%且生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞，按每孔50μl 5×106個(gè)/ml接種至96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，除空白對(duì)照孔外，其余孔加入不同濃度（7.5、15和30μmol/L）的穿心蓮內(nèi)酯。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后每孔加入10 μl CCK8試劑避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值，計(jì)算公式：細(xì)胞活力（%）=各濃度給藥組的A值/空白組的平均A值×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAL-27細(xì)胞周期變化 取對(duì)數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，除空白對(duì)照孔外，其余孔加入不同濃度（7.5μmol/L、15μmol/L和30 μmol/L）的穿心蓮內(nèi)酯，培養(yǎng)48 h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理各組細(xì)胞，1×PBS溶液浸洗2次，移至1.5 ml離心管中，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。用冷PBS清洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入1 ml PI染液，輕輕振蕩混勻，室溫下避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成率 收集各組生長狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化處理后，將各組1×102個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，待6孔板中出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，棄培養(yǎng)液并用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，再加入適量的吉姆薩染液染色10～20 min，根據(jù)克隆形成數(shù)計(jì)算克隆形成率，克隆形成率（%）=（細(xì)胞克隆數(shù)/100）×100%。

1.2.5RT-PCR檢 測(cè)PCNA和p21 mRNA表 達(dá) 水平 收集對(duì)數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液，用TRIzol試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA（25℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，37℃逆轉(zhuǎn)錄10 min，85℃滅活5 s），然后按照RT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增（95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸2 min，循環(huán)40次后，72℃延伸5 min）。以目的基因和內(nèi)參比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。PCNA正 向 引 物：5'-TAAGGGCTGGAAGATAATGCTGAT-3'，反向引物：5'-CCTGTTCTGGGATTCCAAGTT-3'；p21正向引物：5'-CGCGGATCCCCTCTCACCCTAAGGGT-3'，反向引物：5'-CCGCTCGAGCCCTGCACCTCCTCGTC-3'；GADPH正向引物：5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3'，反向引物：5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'；caspase-3正向引物：5'-TGGTTCATCCAGTCGCTTTGT-3'，反向引物：5'-CAAATTCTGTTGCCACCTTTCG-3'。

1.2.6Hoechst染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 收集生長狀態(tài)良好的CAL-27細(xì)胞，4℃、3 000 r/min條件下離心細(xì)胞，用1.5 ml離心管收集細(xì)胞樣品，加入0.5 ml固定液，制備細(xì)胞懸液，固定10 min后棄固定液，用PBS洗滌后，將細(xì)胞樣品液均勻鋪于載玻片上，待玻片晾干后，滴加0.5 ml Hoechst染色液染色5～10 min。待晾干后，用PBS洗滌，滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.7Western blot檢測(cè)caspase-9、caspase-3、cleaved PARP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白表達(dá)水平 收集各組CAL-27細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞后制成細(xì)胞懸液，4℃、3 000 r/min離心15 min，取上清。用RIPA蛋白裂解液于冰上提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入caspase-9（1∶500）、caspase-3（1∶500）、cleaved PARP（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和TGF-β1（1∶1 000），4℃孵育搖床過夜。加入按比例稀釋的HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗（1∶10 000），室溫避光孵育2 h。采用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影，將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件分享光密度值。

1.2.8免疫組化檢測(cè)Ki67、caspase-3和Vimentin陽性表達(dá)率 按0Envision二步法和免疫組化檢測(cè)試劑盒（PV-6000）說明操作，將石蠟切片脫蠟至水，室溫孵育5～10 min，用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH=6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，切片放入3%H2O2溶液中室溫避光孵育25 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，BSA封閉30 min，加入一抗孵育過夜，加二抗（HRP標(biāo)記）覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出來的陽性信號(hào)為棕黃色。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)處理使用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為±s。采用單因素方差分析，若方差齊則兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則兩兩比較采用Dunnett-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞活力的影響CCK8檢測(cè)OSCC細(xì)胞活力，0.75、1.5、3、7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯處理OSCC CAL-27后，細(xì)胞活力無明顯變化。15、30μmol/L穿心蓮內(nèi)酯處理CAL-27后，細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。60、120、240、480 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯顯著降低CAL-27細(xì)胞活力，且細(xì)胞活力極低，見圖1。本實(shí)驗(yàn)選擇0、7.5、15、30 μmol/L的穿心蓮內(nèi)酯進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，探究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞的影響作用。

圖1 CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力Fig.1 CCK8 was employed to detect cell viability

2.2穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響PI單染法檢測(cè)CAL-27細(xì)胞周期變化，與0μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較，7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞G0～G1期細(xì)胞占比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15 μmol/L和30μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組G0-G1期細(xì)胞占比顯著上升（P＜0.05），見圖2A，提示穿心蓮內(nèi)酯可將CAL-27細(xì)胞增殖周期阻滯在G0～G1期?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成率，與0 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較，

7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞克隆形成率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15、30μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞克隆形成率顯著降低（P＜0.05），見圖2B、C。RTPCR檢測(cè)PCNA和p21 mRNA表達(dá)水平，與0μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較，7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞PCNA和p21 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15、30 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞中PCNA mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），p21 mRNA水平顯著增高（P＜0.05），見圖2D。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of andrographolide on proliferation of OSCC cells

2.3穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞凋亡的影響Hoechst染色觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，0、7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞形態(tài)正常，胞核呈圓形，淡藍(lán)色，內(nèi)有較深的藍(lán)色顆粒，未見凋亡細(xì)胞。15、30 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞胞核呈亮藍(lán)色，核呈分葉，碎片狀，邊集，可見大量凋亡細(xì)胞，見圖3A。與0μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較，7.5 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3和cleaved PARP蛋白水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15μmol/L和30 μmol/L穿 心 蓮 內(nèi) 酯 組cleaved cas9/cas9、cleaved cas3/cas3和cleaved PARP蛋白水平顯著提高（P＜0.05），圖3B。

圖3 Hoechst染色和Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡（Hoechst×200）Fig.3 Apoptosis detected by Hoechst and Western blot（Hoechst×200）

2.4穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白水平的影響 與0μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組比較，7.5μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15、30 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯組細(xì)胞中E-cadherin蛋白水平顯著增高（P＜0.05），N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 Western blot檢 測(cè) 細(xì) 胞 中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和TGF-β1蛋白水平Fig.4 Expression levels of E-cadherin，N-cadherin，Vimentin and TGF-β1 protein in cells were detected by Western blot

2.5穿心蓮內(nèi)酯對(duì)移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響測(cè)量腫瘤重量，與對(duì)照組比較，25 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組腫瘤重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），50、100 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組腫瘤重量顯著降低（P＜0.05）。免疫組化檢測(cè)caspase-3、Vimentin和Ki67表達(dá)量。與對(duì)照組比較，25 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組caspase-3、Vimentin和Ki67表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），50、100 mg/kg穿心蓮內(nèi)酯組caspase-3表達(dá)量顯著增高（P＜0.05），Vimentin和Ki67表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 免疫組化檢測(cè)caspase-3、Vimentin和Ki67表達(dá)量Fig.5 Immunohistochemical detection of caspase-3，Vimentin and Ki67 expression levels

3 討論

本研究利用濃度梯度穿心蓮內(nèi)酯處理OSCC細(xì)胞系CAL-27，檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC活力、增殖、凋亡及EMT過程的影響。同時(shí)，本研究還利用OSCC皮下注射BALB/c小鼠建立移植瘤裸鼠模型，觀測(cè)腫瘤生長。研究結(jié)果顯示，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯給藥處理后，OSCC細(xì)胞活力顯著降低，癌細(xì)胞克隆形成率顯著降低，凋亡細(xì)胞明顯增多，運(yùn)動(dòng)能力顯著被抑制，且腫瘤生長明顯被抑制。結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯在OSCC中具有調(diào)節(jié)作用。

癌細(xì)胞異常增殖是促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的重要因素，因此，抑制癌細(xì)胞增殖能有效調(diào)控癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，只存在于正常增殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，與啟動(dòng)細(xì)胞增殖、DNA合成等過程有關(guān)［11］。P21是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，與腫瘤抑制作用密切相關(guān)，還通過抑制周期素依賴激酶復(fù)合物活性協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系，有研究報(bào)道，P21在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)水平與癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯給藥處理后，OSCC細(xì)胞克隆形成率顯著降低，PCNA表達(dá)水平明顯降低，P21表達(dá)水平明顯增高，結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制OSCC細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是指為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，由基因控制的細(xì)胞程序性死亡過程。凋亡發(fā)生時(shí)，上游細(xì)胞凋亡起始蛋白caspase-9誘導(dǎo)并活化下游細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，凋亡蛋白caspase-3和caspase-9被異常激活，使得大腦組織產(chǎn)生大量的cleaved cas-3和cleaved cas-9，并進(jìn)一步執(zhí)行DNA裂解及細(xì)胞凋亡過程［13］。本研究結(jié)果顯示，OSCC經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯處理后，凋亡細(xì)胞明顯增多，caspase-9和caspase-3蛋白水平顯著上調(diào)，結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯通過上調(diào)caspase-9和caspase-3蛋白表達(dá)誘導(dǎo)OSCC凋亡。

EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的過程，是腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用［14］。Ecadherin通過促進(jìn)細(xì)胞間黏附性和極性抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，N-cadherin與E-cadherin相反，N-cadherin通過減弱細(xì)胞間的黏附性和極性促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等過程，Vimentin是維持細(xì)胞骨架完整性的一種重要中間絲蛋白［15］。TGF-β1是促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要特征因子［16］。大量研究表明，OSCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)弱與EMT過程有關(guān)［17-18］。因此，本研究通過檢測(cè)OSCC細(xì)胞中EMT標(biāo)記蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OSCC細(xì)胞中E-cadherin蛋白低表達(dá)，N-cadherin和Vimentin蛋白高表達(dá)，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯處理后，E-cadherin蛋白水平顯著上調(diào)，N-cadherin和Vimentin蛋白水平顯著下調(diào)，結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯通過調(diào)控E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平抑制OSCC細(xì)胞遷移和侵襲能力。

為進(jìn)一步驗(yàn)證穿心蓮內(nèi)酯在OSCC中的作用，利用OSCC細(xì)胞皮下注射小鼠，建立移植瘤裸鼠模型，觀測(cè)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)裸鼠腫瘤生長的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)穿心蓮內(nèi)酯灌胃給藥治療后，移植瘤裸鼠腫瘤重量明顯降低，免疫組化結(jié)果顯示，增殖細(xì)胞相關(guān)抗原Ki67和Vimentin陽性細(xì)胞明顯減少，caspase-3陽性細(xì)胞增多，與前期細(xì)胞水平中觀測(cè)到的結(jié)果相符合。結(jié)果提示，穿心蓮內(nèi)酯在體內(nèi)外均能抑制OSCC生長。

綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)OSCC生長具有抑制作用，其具體作用機(jī)制尚不明確，后續(xù)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)一步探討穿心蓮內(nèi)酯抑制OSCC生長的作用機(jī)制，為穿心蓮內(nèi)酯的臨床應(yīng)用提供更加充分的理論基礎(chǔ)。