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        毛鉤藤堿調(diào)控Shh信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌荷瘤鼠的抑瘤作用及CD4+、CD8+T細(xì)胞的影響①

        2023-01-17 11:55:40王晨宇李興旺張軍杰姚坤厚胡軍紅河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科一病區(qū)開(kāi)封475000
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2022年20期
        關(guān)鍵詞:荷瘤結(jié)腸癌外周血

        王晨宇 李興旺 張軍杰 姚坤厚 華 龍 胡軍紅(河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科一病區(qū),開(kāi)封 475000)

        結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,因其進(jìn)展快、惡性程度高嚴(yán)重威脅人類的健康[1]。毛鉤藤堿(hirsutine,HS)為我國(guó)傳統(tǒng)中藥鉤藤中的吲哚類生物堿,屬于非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑和鈣離子通道阻斷劑,具有降壓、抗感染、心臟保護(hù)及抗腫瘤等藥理活性[2-3]。研究顯示,HS可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)其凋亡[4],并具有逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌多藥耐藥的作用,但未見(jiàn)其對(duì)CRC體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的相關(guān)報(bào)道。Shh(sonic hedgehog)信號(hào)通路與消化道多種惡性腫瘤密切相關(guān)[5]。研究顯示Shh信號(hào)通路相關(guān)蛋白在食管癌、胃癌及CRC組織中均有高度表達(dá)[6],HS的抗腫瘤作用是否與此有關(guān),未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,為此,本研究擬建立CRC裸鼠移植瘤動(dòng)物模型,觀察Shh信號(hào)通路蛋白及CD4+、CD8+T細(xì)胞的變化,進(jìn)一步探討HS抑瘤作用的具體機(jī)制和靶點(diǎn),為臨床上抗結(jié)腸癌新藥的研制提供新的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1動(dòng)物BALB/c-nu裸鼠,4~6周齡,雄性,40只,體質(zhì)量18~22 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物合格證號(hào):201911179。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2019-1-003,動(dòng)物批次號(hào):201907013。

        1.1.2藥品與試劑HS(批號(hào):16122-307,純度≥98%,5 mg/支)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;SW480結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù);Shh信號(hào)通路特異性抑制劑環(huán)巴胺(cyclopamine)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗人Glil、Gli2及Shh多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔抗人Smo和Ptch1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;胎牛血清、胰蛋白酶及青霉素-鏈霉素混合液均購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。

        1.1.3儀器IX73倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司;BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman公司;B5060EK CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Hearers公司;JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek生物儀器有限公司;ZHYLS1C型動(dòng)物自主活動(dòng)儀購(gòu)自安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

        1.2方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至含10%熱滅活的胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液,迅速置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并進(jìn)行傳代,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用0.5%胰蛋白酶消化傳代,使用PBS溶液配置成細(xì)胞濃度為1.8×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

        1.2.2CRC荷瘤鼠模型建立 將配置好的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞混懸液接種于實(shí)驗(yàn)裸鼠的右腋部皮下,每只裸鼠接種0.1 ml,接種5 d后,可觀察到裸鼠接種瘤細(xì)胞的部位出現(xiàn)扁平或橢圓形的包塊,并且逐漸增大,視為裸鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型建立成功[7]。

        1.2.3動(dòng)物分組和給藥方法 將造模成功的40只BALB/c-nu裸鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為:荷瘤鼠模型組(Model)、陽(yáng)性藥對(duì)照組(環(huán)巴胺組,Cyclopamine)、HS低劑量(HS-low)、HS中劑量(HS-medium)和高劑量組(HS-high),每組8只。在造模第8天,皮下移植瘤直徑生長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)進(jìn)行各組的藥物干預(yù),陽(yáng)性藥對(duì)照組腹腔注射20 μmol/L環(huán)巴胺0.2 ml,HS干預(yù)組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg的HS,荷瘤鼠模型對(duì)照組給予等量的生理鹽水,1次/d,連續(xù)給藥21 d。

        1.2.4檢測(cè)荷瘤鼠體質(zhì)量和相對(duì)腫瘤體積的變化 各組于給藥后每天測(cè)量每只荷瘤鼠的體質(zhì)量,計(jì)算各組荷瘤鼠平均體質(zhì)量,每天的體質(zhì)量增長(zhǎng)率(%)=(m給藥第n天-m給藥第1天)/m給藥第1天×100%。各組荷瘤鼠在停藥后第2天處死前,隔天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量每只荷瘤鼠腫瘤的短徑(b)與長(zhǎng)徑(a),腫瘤體積=(a×b2)×1/2,計(jì)算各組荷瘤鼠平均瘤體積,并計(jì)算相 對(duì) 瘤 體 積 增 長(zhǎng) 率(%)=(V給藥第n天-V給藥第1天)/V給藥第1天×100%[8]。停藥后第2天,眼眶收集靜脈血后,處死各組裸鼠,無(wú)菌操作剝離腫瘤組織,放于分析天平上稱取瘤重,計(jì)算各組平均瘤重,抑瘤率(%)=(m模型組平均瘤重-m實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/m模型組平均瘤重×100%[9]。

        1.2.5自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)荷瘤鼠自主活動(dòng)次數(shù)的變化 在各組裸鼠處死前每隔1 d觀察小鼠狀態(tài),并測(cè)定各組荷瘤鼠的自主活動(dòng)次數(shù)。將荷瘤鼠放在動(dòng)物自主活動(dòng)儀里適應(yīng)2 min,待小鼠穩(wěn)定后,記錄5 min內(nèi)各組小鼠的自發(fā)活動(dòng)次數(shù)(隔斷光線活動(dòng)次數(shù))[8]。

        1.2.6免疫組化法(IHC)檢測(cè)荷瘤鼠移植瘤Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平 采用10%的中性甲醛固定各組裸鼠無(wú)菌操作剝離的腫瘤組織,并制備石蠟切片,脫蠟至水,參考文獻(xiàn)[10-11]的方法進(jìn)行免疫組化法操作,熱抗原修復(fù),3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,山羊血清封閉,加入兔抗人Glil(1∶1 000)、Gli2(1∶1 000)、Shh(1∶1 000)多克隆一抗及Smo(1∶1 000)和Ptch1(1∶1 000)多克隆一抗,4℃過(guò)夜,二抗(1∶1 000)37℃孵育60 min,DAB顯色,蘇木精染核,二甲苯透明,中性樹膠封固,光學(xué)顯微鏡下觀察。Shh、Ptch1、Smo蛋白以細(xì)胞膜或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性,Gli1、Gli2蛋白則以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。高倍鏡視野下各切片根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(率)的判斷標(biāo)準(zhǔn),采用Universal Imaging Porporation圖像分析系統(tǒng)和Meta Morph軟件系統(tǒng)分析各組陽(yáng)性細(xì)胞的IOD值,并進(jìn)行定量分析。

        1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平 參考文獻(xiàn)[12]的方法制備腫瘤細(xì)胞和外周血細(xì)胞混懸液。外周血細(xì)胞混懸液制備:收集外周血,加入3 ml紅細(xì)胞裂解液低溫裂解10 min,隨后離心(300 r/min,離心半徑15 cm)10 min,分離上清后再次加入3 ml紅細(xì)胞裂解液低溫裂解,再次低溫離心(300 r/min,離心半徑15 cm)10 min后,使用PBS重懸收集細(xì)胞沉淀。腫瘤細(xì)胞混懸液制備:無(wú)菌眼科手術(shù)剪破碎移植瘤組織,使用大量程移液槍吹散后過(guò)200目細(xì)胞濾網(wǎng),低溫離心(300 r/min,離心半徑15 cm)10 min,分離上清后使用PBS重懸即可。分別吸取腫瘤和外周血細(xì)胞懸液,加入500 μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞,再加入相應(yīng)抗體染色后避光孵育,低溫離心(300 r/min,離心半徑15 cm)10 min后,分離上清,PBS洗滌后使用多聚甲醛定容,在過(guò)350目濾網(wǎng)后,流式上機(jī)檢測(cè)混懸液中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用±s表示,多組間均數(shù)比較采用oneway ANOVA檢驗(yàn),兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);P<

        0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1各組CRC荷瘤鼠自主活動(dòng)次數(shù)比較 如圖1所示,CRC腫瘤的生長(zhǎng)明顯影響各組裸鼠的自主活動(dòng)次數(shù),隨著時(shí)間的推移,各組裸鼠的自主活動(dòng)次數(shù)均明顯減少。各用藥組用藥7 d后,模型組活動(dòng)次數(shù)下降最為顯著,與其他各藥物干預(yù)組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。值得注意的是,在HS干預(yù)11 d后,低、高劑量組荷瘤鼠的自主活動(dòng)次數(shù)與陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且HS高劑量組荷瘤鼠的自主活動(dòng)次數(shù)下降最為緩慢(P<0.05)。

        圖1 各組CRC荷瘤鼠自主活動(dòng)次數(shù)(±s)Fig.1 Number of autonomous activities of in each group(±s)

        2.2各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 如圖2、表1所示,與模型組比較,陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組及HS中、高劑量組腫瘤質(zhì)量均顯著降低(P<0.05),HR低劑量組腫瘤質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組比較,HS各劑量組腫瘤質(zhì)量和抑瘤率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且隨著HR劑量增加,腫瘤質(zhì)量顯著降低,抑瘤率明顯提高。

        表1 各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較(±s,n=8)Tab.1 Comparison of tumor quality and tumor inhibition rate of colorectal cancer-bearing mice in each group(±s,n=8)

        表1 各組CRC荷瘤鼠腫瘤質(zhì)量和抑瘤率比較(±s,n=8)Tab.1 Comparison of tumor quality and tumor inhibition rate of colorectal cancer-bearing mice in each group(±s,n=8)

        Note:Compared with model group,1)P<0.05;compared with cyclopamine group,2)P<0.05.

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        圖2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤圖示Fig.2 Diagram of transplanted tumors in each group of CRC tumor-bearing mice

        2.3各組CRC荷瘤鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率和相對(duì)腫瘤體積的比較 如圖3所示,各組荷瘤鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率增長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致,其中以荷瘤鼠模型組的體質(zhì)量增長(zhǎng)率提高最為顯著。與模型組比較,陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組在干預(yù)10 d后,相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率顯著降低(P<0.05);HS中、高劑量組在干預(yù)12 d后相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率均顯著降低(P<0.05),HS低劑量則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組比較,HS各劑量組在干預(yù)12 d后相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),隨著HS劑量的增加,相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率明顯降低。

        圖3 各組CRC荷瘤鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率和相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率比較Fig.3 Weight growth rate and relative tumor volume growth rate of CRC tumor-bearing mice in each group were compared

        2.4HS對(duì)CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響 如表2所示,與模型組比較,陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組及HR中、高劑量組Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表 達(dá) 量 均 顯 著 降 低(P<0.05或P<0.01),而HS低劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組比較,HR各劑量組Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),并且隨著劑量的增加,上述蛋白的表達(dá)量均下降。

        表2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的比較(±s,n=8)Tab.2 Comparison of expression of key proteins of Shh signaling pathway in transplanted tumors of CRC tumor-bearing mice in each group(±s,n=8)

        表2 各組CRC荷瘤鼠移植瘤中Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的比較(±s,n=8)Tab.2 Comparison of expression of key proteins of Shh signaling pathway in transplanted tumors of CRC tumor-bearing mice in each group(±s,n=8)

        Note:Compared with model group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with cyclopamine group,3)P<0.05,4)P<0.01.

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        2.5HS對(duì)CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的影響 如表3、圖4、5所示,與模型組比較,陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組及HS中、高劑量組移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均顯著提高(P<0.05或P<0.01),而HS低劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組比較,HS各劑量組移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),并且隨著劑量的增加,CD4+及CD8+T細(xì)胞水平提高。

        圖4 各組CRC荷瘤鼠外周血和移植瘤中CD4+T細(xì)胞水平Fig.4 Levels of CD4+T cells in peripheral blood of CRC tumor-bearing mice and transplanted tumors in each group

        表3 各組CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的比較(±s,n=8)Tab.3 Comparison of levels of CD4+and CD8+T cells in transplanted tumor and peripheral blood of CRC tumor-bearing mice in each group(±s,n=8)

        表3 各組CRC荷瘤鼠移植瘤和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平的比較(±s,n=8)Tab.3 Comparison of levels of CD4+and CD8+T cells in transplanted tumor and peripheral blood of CRC tumor-bearing mice in each group(±s,n=8)

        Note:Compared with model group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with cyclopamine group,3)P<0.05,4)P<0.01.

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        圖5 各組CRC荷瘤鼠外周血和移植瘤中CD8+T細(xì)胞水平Fig.5 Levels of CD8+T cells in peripheral blood of CRC tumor-bearing mice and transplanted tumors in each group

        3 討論

        茜草科植物鉤藤在我國(guó)資源豐富,廣泛應(yīng)用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病方面,其中HS為其主要的吲哚類生物堿,在抗腫瘤方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理學(xué)活性[13]。研究顯示,HS可下調(diào)Bcl-2/Bax蛋白,通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡,同時(shí)HS可選擇性誘導(dǎo)多種肺癌細(xì)胞凋亡,并能有效抑制肺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[14-16]。HS抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)其凋亡[4]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)HS能有效抑制結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),HS的干預(yù)顯著提高荷瘤鼠的自主活動(dòng)次數(shù),改善荷瘤鼠的活動(dòng)狀態(tài),降低瘤重,并且隨著劑量的增加,抑瘤率明顯提高、相對(duì)腫瘤體積增長(zhǎng)率明顯降低。本研究還發(fā)現(xiàn),Shh信號(hào)通路特異性抑制劑環(huán)巴胺組在抑瘤作用方面同樣具有較優(yōu)的效果,提示HS對(duì)結(jié)腸癌裸鼠的抑瘤作用可能與Shh信號(hào)通路有關(guān)。

        Shh信號(hào)通路在調(diào)控干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育中具有重要作用,近年來(lái)在食管癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了Shh信號(hào)的異常激活,通路中的Ptch、Gli基因及蛋白存在明顯的過(guò)表達(dá),抑制Shh信號(hào)通路可以下調(diào)腫瘤細(xì)胞的惡性表型,誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡[17-19]。研究顯示,半乳糖凝集素9誘導(dǎo)CRC HT29細(xì)胞凋亡的作用與抑制Shh信號(hào)通路有關(guān)[20]。異甾體類生物堿環(huán)巴胺作為Shh信號(hào)通路特異性抑制劑在不同時(shí)間應(yīng)用均可抑制裸鼠直腸癌移植瘤的生長(zhǎng),表現(xiàn)出了較好的抑瘤作用[21]。在本研究中,陽(yáng)性藥環(huán)巴胺組在提高荷瘤鼠自主活動(dòng)次數(shù),降低瘤重方面同樣具有較好的作用,這與以往報(bào)道一致,同時(shí)發(fā)現(xiàn)HS干預(yù)組Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白Glil、Gli2及Shh、Smo和Ptch1表達(dá)量與環(huán)巴胺組一樣均明顯降低,并且隨著毛鉤藤堿劑量的增加,Shh信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)量呈顯現(xiàn)不同程度的降低,以上均可表明HS對(duì)結(jié)腸癌裸鼠的抑瘤作用與Shh信號(hào)通路有關(guān)。

        研究顯示,CRC組織的發(fā)生發(fā)展與癌組織局部微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其亞型數(shù)量的變化相關(guān)[22]。CD4+、CD8+T細(xì)胞作為動(dòng)物體內(nèi)自然發(fā)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的重要亞群,廣泛參與多種免疫性疾病,同時(shí)還與多種惡性腫瘤有關(guān)[23]。在CRC患者癌組織和癌旁組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平存在顯著差異,外周血中兩者的比例也明顯增加[24]。多項(xiàng)研究已證實(shí),CD8+及CD4+水平對(duì)判斷CRC患者的預(yù)后有較好的參考價(jià)值[25]。在本研究中,環(huán)巴胺組及HS干預(yù)組中瘤體內(nèi)和外周血中CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均顯著提高,并且隨著HS劑量的增加,CD4+及CD8+T細(xì)胞水平均呈現(xiàn)不同程度的提高,以上均表明,HS與環(huán)巴胺組在改善結(jié)腸癌裸鼠細(xì)胞免疫功能,提高機(jī)體免疫狀態(tài)方面同樣具有較好的作用,這也可能是HS改善荷瘤鼠的自主活動(dòng)狀態(tài),發(fā)揮較好抑瘤作用的另一個(gè)原因。

        綜上所述,HS對(duì)CRC荷瘤鼠可改善荷瘤鼠的自主狀態(tài),發(fā)揮較好的抑瘤作用,這可能與其抑制Shh信號(hào)通路,改善CD4+及CD8+T細(xì)胞水平有關(guān)。

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